Protocol
1. Conception et Commande Oligonucleotides avec les collants appropriés Ends
- Identifier terminateurs rho-indépendant potentiels par le biais de l' analyse génomique en utilisant des programmes qui sont disponibles gratuitement en ligne. 7
- Lorsque l'on travaille avec de l' ADN double brin, déterminer l'orientation du terminateur à tester. 7 Le plasmide pgr-Blue ne vérifie terminateurs ligaturées dans le 5 'à 3' sur le dessus (brin avant).
- Convertir un fond (arrière) brin de terminaison à son complément inversé pour réorienter la séquence pour les tests en pgr-Blue en utilisant un logiciel gratuit en ligne, par exemple, ApE.
- Après l'orientation est déterminé à être correct, ajoutez la fin collante "5'-ACJC-3 '" à l'extrémité 5' du brin supérieur. Ajouter l'extrémité collante "5'-CCGC-3 '" à l'extrémité 5' du brin inférieur. 8 Cela garantira que insert ligaturé sera inséré dans le appropriéorientation à l'aide GGA.
- Une fois que les séquences sont déterminées, ordonner que des oligonucléotides simple brin commercialement.
2. Recuit Oligonucleotides (uniquement pour lyophilisé ADN)
- Remettre en suspension les oligonucléotides individuels dans l'eau sans nuclease à une concentration de 100 uM.
- Faire 10x recuit tampon: 1 M de NaCl et Tris-HCl 100 mM pH 7,4. tampon d'hybridation peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs semaines. Une fois que le tampon de recuit est effectuée et les oligonucléotides sont remis en suspension, commencer le recuit 8.
- Pour chaque terminaison à tester, ajouter 16 pi d'eau ultra pure dans un tube de 1,5 ml.
- Ajouter 2 ul de 10 x tampon d'hybridation à chaque microtube.
- Ajouter 1 pl du brin supérieur oligonucléotide (100 uM) à partir du terminateur désiré.
- Ajouter 1 pl de l'oligonucléotide fond de brin (100 uM) à partir du terminateur désiré.
- Créer un point d'ébullition de l'eau bae en utilisant un bêcher de 1000 ml contenant environ 400 ml d'eau du robinet et les placer sur une plaque chauffante.
- Placer les tubes de microcentrifugation de l'étape 2.6 dans un flotteur et faire bouillir pendant 4 min. Après 4 min, éteignez la plaque chauffante , mais laisser le tube et flotter dans le bain d'eau lentement O fraîche / N (18 h) 8. Stocker les terminateurs recuits à -20 ° C.
3. Or Assemblée Porte (Standard Mix - Coût efficace)
- Faire 40 nM dilution des terminateurs recuits. Ajouter 124 pi d'eau sans nucléase à 1 pl de recuit terminateurs mélange (100 uM).
- Centrifuger les échantillons pendant 30 secondes à 10.000 xg et stocker sur la glace.
- Dans un nouveau lieu de tube pour le thermocycleur utilisé, ajouter 6 ul d'eau sans nucléase.
- Ajouter 1 pi de tampon d' ADN ligase commercial [300 mM de Tris-HCl (pH 7,7 à 7,8), 100 mM de MgCl2, 100 mM DTT et 10 mM d' ATP]. Effectuez toutes les étapes ultérieures de la glace.
- Ajouter1 pl de pgr-Blue (35-50 ng / pl) destination plasmide au tube de microcentrifugeuse.
- Ajouter 1 pi de 40 nM terminateurs recuites au microtube.
- Ajouter 0,5 ul commercial haute fidélité Bsal endonucléase de restriction sur le tube de microcentrifugeuse.
- Ajouter 0,5 pi de ligase d'ADN du commerce au microtube.
- Centrifuger le mélange réactionnel à 10 000 x g pendant 120 secondes. Ensuite, placez le tube directement dans le thermocycleur.
- Exécutez le programme de thermocycleur: 20 cycles de 1 min à 37 ° C, puis 1 min à 16 ° C, suivi par 1 cycle de 15 min à 37 ° C. Utiliser des échantillons immédiatement ou congeler et conserver à -20 ° C. 8
4. Or Assemblée Gate (Commercial Master Mix - Time Efficient)
- Ajouter 124 pi d'eau sans nucléase à 1 pl de 100 uM terminateurs créé à l'étape 2. Cela dilue la concentration d'ADN de terminaison à 40 nM recuits.Effectuez cette étape dans une nouvelle, marquée de 1,5 ml microtube.
- Dans un nouveau lieu de tube pour le thermocycleur, ajouter 14 ul d'eau sans nucléase. Assurez-vous que le nouveau tube est étiqueté en conséquence.
- Ajouter 2 pi de tampon commercial Maître Mix au tube de microcentrifugeuse.
- Ajouter 1 pl de pgr-Blue plasmidique (35-50 ng / ul) au tube de microcentrifugeuse.
- Ajouter 2 ul de 40 nM terminateurs recuites au microtube.
- Ajouter 1 pi de Commercial Master Mix au tube de microcentrifugeuse.
- Centrifuger le tube 40 nM à 10.000 xg pendant 120 secondes. Ensuite, placez le tube directement dans le thermocycleur.
- Exécutez le programme de thermocycleur: 1 cycle de 60 min à 37 ° C suivi par 1 cycle de 15 min à 55 ° C. Utiliser des échantillons immédiatement ou congeler et conserver à -20 ° C.
5. Transformation et sélection Colony
- Préparer Luria Base (LB) agar boîtes de Pétri contenant 1 mM concentration d'ampicilline (Amp) et une concentration de 10 mM d'arabinose (ARB). Préparer au moins 10 ml de 1 M L Stock arabinose solution car cette solution mère sera utilisée dans les étapes ultérieures.
- Utilisez un haut rendement (10 8 - 10 9 transformants / pg) E. chimiquement compétente coli (JM109) pour la transformation des cellules. 9 Pour obtenir les meilleurs résultats, ajouter 3-5 pl de la réaction de ligature à 50 ul de cellules compétentes. Lors de l'utilisation de cellules compétentes chimiques, suivre le protocole de transformation spécifique aux cellules utilisées.
- Étendre la moitié (25 pi) des cellules transformées sur LB préchauffée (Amp / arb) des plaques d'agar en utilisant un «bâton de hockey» stérile en forme de L et incuber O / N à 37 ° C. En raison de l'évolution rapide de l'ampicilline de décomposition, ne pas incuber à 37 ° C pendant 24 heures.
- Effectuer une sélection de colonies sur la base de la couleur par inspection visuelle. Une ligature réussie doit être blanc / jaune à la lumière visible et fluorescence verte undebleu r (450 nm) ou la lumière UV. Une ligature infructueuse produira une colonie qui est de couleur bleue sous lumière visible après 18 - 20 h.
6. La vérification et la quantification des Terminator
- Préparer des tubes stériles de 5 ml de bouillon LB-ampicilline avec 1 mM et 10 mM arabinose. Le nombre de tubes nécessaires dépend du nombre de terminateurs étant testés ainsi que les contrôles (cellules présentant une résistance à l'ampicilline qui ne sont pas fluorescentes et les cellules contenant le PGR-bleu non coupée du plasmide).
- Sous la lumière visible ramasser 2-3 colonies blanches / jaunes (étape 5.4) en utilisant une boucle stérile. Laisser les échantillons incuber dans des bouillons sur un agitateur à 37 ° C et 160 rpm pendant 16-18 h. Ne pas incuber ces échantillons pendant plus de 24 heures.
- Le cas échéant, en utilisant un spectrophotomètre pour déterminer la densité cellulaire optique à 600 nm (DO 600) afin d' assurer une croissance cellulaire adéquate. En règle générale, une DO 600 de ~ 0,8-1,0 est observée après 16-18 h de croissance.
- Utilisationune plaque à 96 puits stérile pour les étapes restantes. Effectuer ces étapes dans un environnement aseptique et en triple. Ajouter 199 ul de bouillon LB + Amp / arabinose stérile (1 mM d'ampicilline / 10 mM arabinose) à chaque puits. Inclure pièce sur la plaque pour trois commandes séparées.
- Utilisez les trois commandes suivantes: Un puits (1) contenant LB + Amp bouillon / arabinose seulement et un puits (2) pour les cellules compétentes non transformées (en blanc) pour servir de vide. Pour la quantification (3) de la résistance de terminaison, les cellules contenant pgr originale uncut ou contenant pgr-Blue ligaturé avec une séquence non-terminaison doivent être inclus (contrôle de référence pour la quantification). Voir la Figure 1 pour lecteur de plaque mise en page.
- Pipette 1 pi de la solution de cellules à partir de la O / N bouillons dans des puits individuels de la plaque à 96 puits.
- plaques d'étanchéité avec un couvercle perméable à l'air et agiter pendant 18-20 heures à 37 ° C et 160 rpm.
- En utilisant un lecteur de plaque, déterminer OD 600 par la lectureabsorbance à 600 nm. Mesurer la fluorescence de la GFP comme suit: excitation 395 et d' émission 509. Mesure DP fluorescence comme suit: excitation 575 et d' émission 605. Après 18-20 h, la DO 600 devrait être d' environ 0,5.
- Pour normaliser la variation de la croissance, utiliser l'équation:
pour les deux GFP et RFP. - Après normalisation, déterminer la force relative de terminaison en utilisant l'équation
pour les deux GFP et RFP. 
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Representative Results
Ce protocole va produire des cellules contenant pgr-bleu avec un terminateur ligaturé entre GFP et RFP à l' aide d' or Assemblée Porte (figure 2). Les colonies positives contenant insert ligaturé peuvent être choisis en fonction de la couleur. À la lumière visible colonies positives seront blanc / jaune et faux positifs vont produire des colonies bleues après 18-20 heures d'incubation à 37 ° C (figure 3).
Une fois la sélection de colonies, un lecteur de plaque peut être utilisée pour déterminer la résistance de terminaison. Comme preuve de concept, six terminateurs putatifs (T1-6) ont été identifiés dans la bioinformatique mycobactériophage Bernal13. Les résultats de la figure 4 montrent la résistance de terminaison par rapport avec des cellules exprimant uncut / non modifié pgr comme témoin. Si un terminateur prédit a une GFP / rapport de DP similaire à pgr (~ 0,0) ou au-dessous de 0,1, alors la séquence était déterminé à ne pas être un terminateur(T5 et T6). Cependant, numériquement chaque dixième augmentation correspond à une augmentation d'un facteur de résistance de terminaison par rapport au témoin. Par exemple, T3 a un rapport élevé d'expression de la GFP par rapport à la DP et a montré une augmentation de 5 fois (0,5 sur le graphique) , la résistance de terminaison par rapport au témoin et a été considéré comme un agent de terminaison forte (figure 4). Les données ont été recueillies en triple exemplaire et en moyenne pour la représentation visuelle.
Pour déterminer le meilleur contrôle de référence pour quantifier la force de terminaison, nous avons comparé les données brutes en utilisant le plasmide pgr d'origine ne contenant pas de terminateur et pgr-Blue cloné avec une séquence connue pour ne pas être un terminateur. Les deux contrôles ont montré des niveaux similaires de GFP et d' expression DP (figure 5) et, plus important encore , produit GFP / RFP ratios similaires.
Figure 1. S Chematic Detailing lecteur de plaques Disposition. Chambre devrait être inclus dans le lecteur de plaque pour trois commandes séparées (vert). Un puits (1) contenant LB + Amp bouillon / arabinose seulement et un puits (2) pour les cellules compétentes non transformées (blanc) pour servir de vide. Pour la quantification (3) de la résistance de terminaison, les cellules contenant pgr originale uncut ou contenant pgr-Blue ligaturé avec une séquence non-terminaison doivent être inclus (contrôle de référence pour la quantification). Le reste de la plaque (jaune) peut être utilisé pour tester des terminateurs putatifs. Il est suggéré toutes les cellules être cultivées en triple exemplaire et moyennes avant l' analyse. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Clonage du site Orientation et expression depgr-Blue. Expression Constitutif de AmilCP (Bleu Chromo Protein) est entraîné dans la direction opposée (brin inférieur) de la GFP et RFP. Quand digéré avec Bsal, AmilCP et les sites de reconnaissance BsaI sont éliminés et le terminateur à tester est lié de façon permanente dans le plasmide. Le brin supérieur et brin inférieur d'un terminateur avec les extrémités cohésives appropriées sont indiquées. Les gènes de résistance du régulateur de AraC et l' ampicilline sont dans le plasmide , mais non représentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Sélection Colony après clonage. (A) Plaque représentant après pgr-Blue / terminateur ligature (mélange standard) et la transformation cellulaire. Les colonies bleues représentent ligatures infructueuses et blanc col / jauneOnies (indiqué par la flèche) sont ligatures réussies. (B) Un zoom sur l' image de la même plaque montrant des colonies représentatives après transformation. La couleur d'arrière-plan a été numériquement modifiée pour les différences de couleur des colonies plus claires. Les cellules transformées (E.coli -JM109) ont été étalées sur LB plats d'agar contenant de l' ampicilline et de l' arabinose. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Quantification des Six différents Terminators dans pgr-Blue. Six terminateurs putatifs (T1-6) ont été identifiés dans le bioinformatique mycobactériophage Bernal13. Les résultats montrent une fluorescence relative. Tous les résultats ont été normalisés en utilisant des cellules contenant uncut / non modifié pgr comme témoin. T3 a été trouvé être un solideterminateur. Tous les résultats représentent des colonies individuelles cultivées en triple et la moyenne pour la représentation visuelle. Les barres d'erreur représentent les écarts entre les moyennes de points de données. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. GFP et RFP Expression dans les contrôles. Expression de la GFP et RFP dans uncut / pgr non modifiée et deux séquences non-terminateur différents insérés dans pgr-Blue. Tous les résultats représentent des colonies individuelles cultivées en triple et la moyenne pour la représentation visuelle. Les barres d'erreur représentent les écarts entre les moyennes de points de données. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'étape la plus importante dans ce protocole est la conception d'oligonucléotides appropriée avant de commander. Les oligonucléotides doivent avoir des extrémités cohésives appropriées ajoutées aux extrémités 5 'des deux brins du haut et du bas pour faire en sorte que l'incorporation GGA est possible. En outre, il est important de changer l'orientation de terminateurs tourné vers la gauche (terminateurs qui empêchent la transcription sur le brin inférieur) à celui de droite face (termine la transcription sur le brin supérieur) terminateurs parce GFP et RFP expression est dans la bonne face (brin supérieur ) direction.
Deux protocoles de GGA séparés et les mélanges tampons peuvent être utilisés pour tester terminateurs dans pgr-Blue. Le mélange standard-économie consiste en l' achat de matériel individuellement, puis mélangés dans le laboratoire 8. Le second protocole utilise un mélange maître pré-faites commerciale GGA. Bien que les deux fonctionnent bien; le mélange maître commercial est plus de temps efficace, mais est relativement cher par rapport au mélange standard.Dans un cadre de l'éducation, il peut être plus économique de faire le mélange de GGA norme à l'avance et congeler des aliquotes pour l'utilisation de chaque élève.
À la suite de la modification pgr pour GGA et en ajoutant amilCP dans l'orientation inverse pour la sélection des couleurs, l'expression de la GFP et RFP est limitée dans le uncut pgr-Blue plasmidique et ne doivent pas être utilisés en tant que témoin de référence pour déterminer la force relative de terminaison. Cependant, toutes les modifications sont supprimés pendant le processus de clonage permettant une bonne quantification de la force relative de terminaison. Bien qu'il soit préférable d'utiliser les non modifiés pgr plasmidiques des résultats similaires d'origine peut être obtenue par clonage d'une séquence connue pour ne pas être un terminateur dans pgr-Blue. Les deux contrôles ont montré des niveaux égaux de la GFP et l' expression de la DP (figure 5) et, plus important encore , avaient des rapports GFP / RFP similaires.
Pour une régulation stricte de l'expression génique, le plasmide pgr-Blue exprime constitutivement le régulateur de AraCdu pBAD (arabinose inductible) promoteur. 10,11 Selon la lignée cellulaire utilisé une concentration de arabinose élevée peut être nécessaire pour l'expression de la GFP et RFP. De bons résultats ont été obtenus en utilisant une concentration de 10 mM dans l'arabinose E. lignée cellulaire coli JM109. Les cellules transformées doivent être soit blanc / jaune ou bleu sous la lumière visible. Sous une lumière UV ou la lumière bleue (450 nm), il est fréquent de voir que la fluorescence verte, mais pas rouge dans les cellules transformées positivement. Cependant, la fluorescence DP a été détectée en utilisant le lecteur de plaque.
Les terminateurs utilisés comme preuve de concept pour ce protocole ont été identifiés dans le mycobactériophage Bernal13. Cependant, pgr-Blue ne fonctionne que dans E. coli , et il est pas un vecteur navette qui peut être exprimée dans d' autres espèces de bactéries. Le résultat est que nous ne savons pas exactement comment les terminateurs identifiés fonctionneraient dans leur milieu d'accueil et est une limitation potentielle. L'associé de cassette d'expressiond avec pgr-Blue est flanqué par des sites de clonage traditionnels et pourrait être déplacé vers un vecteur navette approprié. Cela permettrait aux chercheurs d'adapter pgr-Blue à leurs espèces bactériennes spécifiques, si on le souhaite.
Bien qu'il existe d'autres méthodes d'analyse de séquence à haut débit disponible, la plupart utilisent une approche génétique de l'avant. Ces approches utilisent mutagenèse dirigée ou oligo-synthèse pour générer des centaines de milliers de combinaisons possibles de séquences. 12,13 Une fois créés, l'effet de chaque modification de séquence est alors cataloguée. Cependant, pgr-Blue est conçu pour une application de génétique inverse plus dirigée. Lors de l' analyse d' un roman génome in silico, il est fréquent d'observer plusieurs terminateurs potentiels dans une zone donnée. pgr-Blue a été conçu pour aider les chercheurs à affiner rapidement leur dans les prévisions de silico en leur permettant de tester des séquences putatives in vivo. Il convient de noter le PGR test de terminaison plasmid a été utilisé pour quantifier la force de terminaison dans 582 séquences 4, cependant pgr utilise une norme d'assemblage enzyme de restriction (par exemple, base assemblage bio-brique (BBA)), un processus de clonage relativement de temps par rapport à GGA. 7 Le plasmide pgr-Blue a été conçu pour fonctionner de manière similaire à pgr mais utilise une sélection plus rapide de la procédure de clonage et de la couleur de la colonie. Ces modifications, ainsi que notre protocole simplifié, font pgr-Blue adaptable à la fois l'éducation et les laboratoires de recherche orientée.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Malcom Campbell et Todd Eckdahl avec le Genome Consortium pour l'enseignement actif (GCAT) et l'Alliance pour l'éducation HHMI-Science - Chasseurs phages Advancing Génomique et Evolutionary Sciences programme (SEA-phages).
Ce projet a été soutenu par des subventions du National Center for Research Resources (P20RR016460) et l'Institut national des sciences médicales générales (P20GM103429) des National Institutes of Health. Cette recherche a été financée en partie par la National Science Foundation subvention # IIA-1457888. (Université Ouachita Baptist) des fonds plus institutionnels ont été fournis par l'été de bourses de recherche JD Patterson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
- Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
- Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
- Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
- Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
- Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
- Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
- Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
- Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).
