Protocol
1. Projecção e Ordenação oligonucleótidos com as apropriadas pegajosas Termina
- Identificar potenciais terminadores independente de rho através da análise genômica usando programas que estão livremente disponíveis online 7.
- Quando se trabalha com o ADN de cadeia dupla, determinar a orientação do terminador para ser testado. 7 O plasmídeo PGR-azul apenas verifica terminadores ligados na direcção 5 'para 3' na parte superior (vertente para a frente).
- Converter um fio terminator inferior (reverso) para o seu complemento revertida para reorientar a sequência de ensaios in PGR-azul usando software livre online, por exemplo, APE.
- Após a orientação é determinada para ser correta, adicionar a extremidade coesiva "5'- CGAC-3 '" para a extremidade 5' da cadeia superior. Adicionar a extremidade coesiva "5'- CCGC-3 '" para a extremidade 5' da cadeia inferior. 8 Isto irá assegurar que pastilha ligado irá ser inserido no adequadoorientação usando GGA.
- Uma vez que as sequências são determinadas, pedir como oligonucleotídeos de cadeia simples comercialmente.
2. Annealing oligonucleotídeos (aplica apenas para liofilizadas DNA)
- Re-suspender oligonucleótidos individuais em água livre de nuclease, a uma concentração de 100 uM.
- Adicione 10x tampão de emparelhamento: NaCl 1 M e Tris-HCl 100 mM pH 7,4. tampão de emparelhamento pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas. Uma vez que é feita de tampão de recozimento e os oligonucleótidos são re-suspensas, iniciar o recozimento 8.
- Para cada terminador a ser testado, adicionar 16 ul de água ultra-pura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Adicionar 2 l de 10x tampão de têmpera a cada tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 1 ml de topo oligonucleótido cadeia (100 um) a partir do terminador desejado.
- Adicionar 1 ml de oligonucleótido inferior cadeia (100 um) a partir do terminador desejado.
- Criar uma ebulição ba de águath utilizando um copo de 1000 ml contendo cerca de 400 ml de água da torneira e coloque em um prato quente.
- Coloque os tubos de microcentrífuga a partir do passo 2.6 em uma bóia e deixe ferver por 4 min. Após 4 min, desligue o calor de placas, mas deixar o tubo e flutuar no banho de água para arrefecer lentamente O / N (18 hr) 8. Armazenar os terminadores recozido à temperatura de -20 ° C.
3. Montagem Golden Gate (Mix Standard - Custo Eficiente)
- Fazer uma diluição de 40 nM dos terminadores recozidos. Adicionar 124 mL de água livre de nuclease para 1 ml de mistura terminadores recozido (100 M).
- Centrifugar as amostras durante 30 segundos a 10.000 xg e armazenar no gelo.
- Em uma nova adequada do tubo para o termociclador sendo usado, adicionar 6 mL de água livre de nuclease.
- Adicionar 1 mL de tampão de ligase de ADN comercial [Tris-HCl 300 (pH 7,7-7,8), MgCl2 100 mM, DTT 100 mM e 10 mM de ATP]. Execute todas as etapas subsequentes no gelo.
- Adicionar1 ul de PGR-Azul (35-50 ng / ul) do plasmídeo de destino para o tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 1 mL do 40 nm terminadores emparelhado com o tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 0,5 uL de endonuclease de restrição comercial de alta fidelidade BSAI ao tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 0,5 uL de ligase de ADN comercial para o tubo de microcentrífuga.
- Centrifugar a mistura reaccional a 10.000 xg, durante 120 segundos. Em seguida, coloque o tubo diretamente no termociclador.
- Executar o programa de termociclador: 20 ciclos de 1 min a 37 ° C, seguido de 1 min a 16 ° C, seguido de 1 ciclo de 15 min a 37 ° C. Use amostras imediatamente ou congelar e armazenar a -20 ° C. 8
4. Montagem Golden Gate (Comercial Mix Master - tempo eficiente)
- Adicionar 124 uL de água livre de nuclease e 1 uL de 100 uM terminadores criados no passo 2. Este dilui a concentração de ADN de 40 nM terminador recozidos.Execute esta etapa em uma nova, rotulados 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
- Em uma nova adequada do tubo para o termociclador, adicione 14 mL de água livre de nuclease. Verifique se o novo tubo é rotulado em conformidade.
- Adicionar 2 mL de Commercial Mestre Mix Buffer para o tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 1 ml de PGR Azul plasmídeo (35-50 ng / ul) ao tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 2 mL da 40 nM terminadores emparelhado com o tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 1 ml de Commercial Master Mix ao tubo de microcentrífuga.
- Centrifuga-se o tubo de 40 nm a 10000 xg durante 120 seg. Em seguida, coloque o tubo diretamente no termociclador.
- Executar o programa de termociclador: 1 ciclo de 60 min a 37 ° C, seguido de 1 ciclo de 15 min a 55 ° C. Use amostras imediatamente ou congelar e armazenar a -20 ° C.
5. Transformação e Selecção Colony
- Prepare Luria Base (LB) agar placas de Petri contendo concentrat 1 mMion de ampicilina (Amp) e uma concentração de 10 mM de arabinose (ARB). Preparar pelo menos 10 ml de uma solução M de L da -arabinose porque esta solução de reserva vai ser usado em passos posteriores.
- Use qualquer alta eficiência (10 8 - 10 9 transformantes / mg) E. quimicamente competente coli (JM109), as células para a transformação. 9, para obter os melhores resultados, adicionar 3-5 uL da reacção de ligação a 50 ul de células competentes. Quando se utiliza células competentes químicos, seguir o protocolo de transformação específica para as células a ser usadas.
- Espalhe metade (25 ul) das células transformadas em LB pré-aquecido (Amp / ARB) placas de agar utilizando uma forma de L "stick de hóquei" estéril e incubar O / N a 37 ° C. Devido à rápida taxa de ampicilina de decomposição, não se incubar a 37 ° C ao longo de 24 h.
- Realizar a seleção de colónia com base na cor por inspeção visual. A ligadura de sucesso deve ser branco / amarelo na luz visível e fluorescência verde undeazul r (450 nm) ou luz UV. Uma ligação bem sucedida irá produzir uma colônia que é de cor azul sob luz visível após 18-20 horas.
6. Verificação e Quantificação de Terminator
- Prepare 5 ml estéreis tubos de caldo LB com ampicilina 1 mM e 10 mM de arabinose. O número de tubos necessário é dependente do número de terminais a ser testado, mais controlos (células com resistência à ampicilina que não apresentam fluorescência e as células contendo o plasmídeo PGR-azul não cortadas).
- Sob a luz visível pegar 2-3 colónias branco / amarelo (passo 5.4) usando um loop estéril. Deixar as amostras a incubar em caldos num agitador a 37 ° C e 160 rpm durante 16-18 horas. Não incubar as amostras durante mais de 24 horas.
- Opcionalmente, utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade celular óptica a 600 nm (DO600) para garantir o crescimento celular adequado. Geralmente, uma DO 600 de 0,8-1,0 ~ é observada após 16-18 horas de crescimento.
- Usaruma placa de 96 poços estéreis para as etapas restantes. Realizar estas etapas num ambiente asséptico e em triplicado. Adicionar 199 ul de estéril LB + Amp caldo / arabinose (1 mM de ampicilina / arabinose a 10 mM) a cada poço. Incluir quarto na placa por três controles separados.
- Use os três controlos seguintes: somente um poço (1) contendo LB + Amp / arabinose caldo e um poço (2) para células competentes não transformadas (em branco) para servir como um espaço em branco. Para a quantificação (3) da força terminador, as células que contêm PGR originais sem cortes ou contendo PGR-azul ligado com uma sequência não-terminating deve ser incluído (controlo de referência para a quantificação). Veja a Figura 1 para o layout do leitor de placas.
- Pipetar 1 mL da solução de células a partir de O / N caldos em poços individuais da placa de 96 poços.
- placas de vedação com uma cobertura respirável e agitar durante 18-20 horas a 37 ° C e 160 rpm.
- Utilizando um leitor de placa, determinar pela leitura OD600absorvância a 600 nm. Medir a fluorescência de GFP, como se segue: 395 de excitação e emissão de fluorescência 509. Medida RFP como se segue: 575 de excitação e de emissão 605. Após 18-20 horas, o OD 600 deve ser de aproximadamente 0,5.
- Para normalizar as variações em crescimento, a utilização da equação:
tanto para GFP e RFP. - Após a normalização, determinar a força terminator relativa usando a equação
tanto para GFP e RFP. 
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Representative Results
Este protocolo irá produzir células que contêm PGR-azul com um terminador ligado entre GFP e RFP usando Golden Gate Assembly (Figura 2). As colónias positivas contendo inserção ligado pode ser seleccionado com base na cor. À luz visível colónias positivas será branco / amarelo e falsos positivos irá produzir colónias azuis após 18-20 horas de incubação a 37 ° C (Figura 3).
Após selecção de colónias, um leitor de placas pode ser usado para determinar a força terminador. Como prova de conceito, seis terminadores putativos (T1-6) foram bioinformatically identificado no micobacterióf ago Bernal13. Os resultados na Figura 4 mostram força terminador relativa com células que expressam sem cortes / pgr não modificada como um controlo. Se um terminador previsto tem um rácio de GFP / RFP semelhante ao pgr (~ 0,0) ou inferior a 0,1, então a sequência não foi determinada para ser um terminador(T5 e T6). No entanto, cada décima numericamente representa um aumento de vezes de aumento na força terminador em relação ao controlo. Por exemplo, T3 tinha um rácio elevado de expressão da GFP em relação ao RFP e mostrou um aumento de 5 vezes (0,5 no gráfico) no terminador força, em comparação com o controlo e foi considerado um terminador forte (Figura 4). Os dados foram recolhidos em triplicado e média para a representação visual.
Para determinar o melhor controle de referência para quantificar a força terminator, foram comparados dados brutos utilizando o plasmídeo PGR original que contém nenhum terminador e PGR Azul clonado com uma sequência conhecida não ser um terminador. Ambos os controles apresentaram níveis semelhantes de GFP e expressão RFP (Figura 5) e, mais importante, produzido GFP / RFP proporções semelhantes.
Figura 1. S chematic Detalhamento Leitor de placas Layout. quarto deve ser incluído no leitor de placa por três controles separados (verde). Um poço (1) contendo LB Amp + caldo / arabinose única e um poço (2) para células competentes não transformadas (em branco) para servir como um espaço em branco. Para a quantificação (3) da força terminador, as células que contêm PGR originais sem cortes ou contendo PGR-azul ligado com uma sequência não-terminating deve ser incluído (controlo de referência para a quantificação). O restante da placa (amarelo) pode ser usado para testar terminadores putativos. Sugere-se todas as células ser cultivadas em triplicado e médios antes da análise. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Orientação sítio de clonagem e expressão dePGR-Azul. expressão constitutiva de AmilCP (azul Chromo Protein) é conduzido na direção oposta (cadeia inferior) da GFP e RFP. Quando digerido com BSAI, AmilCP e os locais de reconhecimento BSAI são removidos e o terminador a ser testado é permanentemente ligado dentro do plasmídeo. A cadeia de topo e cadeia de baixo de um terminador com as extremidades coesivas apropriadas são mostradas. Os genes regulador AraC e ampicilina resistência são no plasmídeo, mas não apresentados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Colony Seleção após a clonagem. (A) placa Representante após a ligadura PGR-Azul / terminator (mix padrão) e transformação celular. colónias azuis representam ligations mal sucedidas e branco col / amareloonies (indicado pela seta) são ligaduras de sucesso. (B) Um zoom de imagem da mesma placa mostrando colónias representativas após transformação. A cor de fundo foi alterada digitalmente a diferenças colónia de cor ainda mais destaque. As células transformadas (E.coli -JM109) foram semeadas em canteiros de agar LB contendo ampicilina e arabinose. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Quantificação dos Seis Terminators diferente na PGR-Azul. Seis terminadores putativos (T1-6) foram bioinformatically identificado no micobacterióf ago Bernal13. Os resultados mostram fluorescência relativa. Todos os resultados foram normalizados utilizando células contendo sem cortes / pgr não modificada como um controlo. T3 foi encontrado para ser um forteExterminador do Futuro. Todos os resultados representam colónias individuais, cultivadas em triplicado e média para a representação visual. As barras de erro representam desvios entre pontos de dados em média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. GFP e Expressão RFP em controles. A expressão de GFP e RFP em sem cortes / inalterado PGR e duas sequências não-terminator diferentes inserido PGR-Azul. Todos os resultados representam colónias individuais, cultivadas em triplicado e média para a representação visual. As barras de erro representam desvios entre pontos de dados em média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O passo mais importante neste protocolo é design oligonucleotídeo adequada antes de pedir. Os oligonucleótidos devem ter as extremidades coesivas apropriadas para adicionado extremidades 5 'da parte superior e inferior cadeias para assegurar que GGA incorporação é possível. Além disso, é importante para mudar a orientação da terminadores virada para a esquerda (terminadores que param de transcrição na cadeia inferior) ao do direito virado (termina a transcrição na parte superior fio) terminadores porque GFP e RFP expressão é na virada para a direita (cadeia de topo ) direção.
Dois protocolos GGA separadas e misturas tampão pode ser utilizado para testar PgR terminadores em-azul. O mix-economia padrão consiste em compra de material individualmente e depois misturados no laboratório 8. O segundo protocolo utiliza um pré-fabricados mix comercial mestre GGA. Embora ambos funcionam bem; o master mix comercial é mais tempo eficiente, mas é relativamente caro em comparação com a mistura padrão.Em um cenário de educação, pode ser mais econômico para fazer a mistura GGA padrão com antecedência e congelar alíquotas para uso do aluno individual.
Como um resultado da modificação de PGR para GGA e adicionando amilCP na orientação inversa para a selecção de cores, a expressão da GFP e RFP é limitado no plasmídeo não cortado PGR-Blue e não deve ser usada como o controlo de referência, quando se determinar a força relativa terminador. No entanto, todas as modificações são removidos durante o processo de clonagem que permite a quantificação adequada da força relativa terminador. Embora seja melhor utilizar as não modificadas PGR plasmídeo resultados originais semelhantes pode ser conseguido por clonagem de uma sequência conhecida não seja um terminador em PGR-azul. Ambos os controles apresentaram níveis iguais de GFP e expressão RFP (Figura 5) e, mais importante, teve relações GFP / RFP semelhantes.
Para regulação apertada da expressão do gene, o plasmídeo PGR Azul expressa constitutivamente o regulador AraCdo pBAD (arabinose indutível) promotor. 10,11 Dependendo da linha celular utilizada uma concentração elevada de arabinose pode ser necessário para a expressão de GFP e RFP. Foram obtidos bons resultados utilizando uma concentração de arabinose a 10 mM em E. linha de células coli JM109. As células transformadas deve ser branco / amarelo ou azul sob luz visível. Sob a luz UV ou a luz azul (450 nm), é comum ver apenas fluorescência verde mas não vermelho em células transformadas de forma positiva. No entanto, a fluorescência RFP foi detectado utilizando o leitor de placas.
Os terminadores usados como prova de conceito para este protocolo foram identificados na micobacterióf ago Bernal13. No entanto, PGR-azul só funciona em E. coli e não é um vector de vaivém que pode ser expresso em outras espécies de bactérias. O resultado é que não sabemos exatamente como os terminadores identificados iria funcionar em seu ambiente de acolhimento e é uma limitação potencial. O associado cassete de expressãod com o PGR-azul é flanqueado por locais de clonagem tradicionais e poderia ser transferido para um vector de transporte adequado. Isso permitiria que investigadores individuais para adequar PGR-Blue às suas espécies bacterianas específicas, se assim o desejar.
Embora existam outros métodos de análise de sequência de elevada capacidade disponível, a maioria usa uma abordagem genética para a frente. Estas abordagens utilizam mutagénese dirigida ao local ou oligo-síntese para gerar centenas a milhares de combinações de sequências potenciais 12,13. Uma vez criado, o efeito de cada modificação da sequência é então catalogado. No entanto, PGR-azul é projetado para uma aplicação genética reversa mais direcionado. Ao analisar um genoma novel in silico, é comum observar múltiplos terminadores potenciais numa determinada área. PGR-azul foi projetado para ajudar os pesquisadores a refinar rapidamente o seu nas previsões silico, permitindo-lhes para testar sequências putativas in vivo. Deve-se notar a PGR testes terminator plasmid foi utilizado para quantificar a força terminador em 582 sequências de 4, no entanto PGR utiliza um padrão de montagem de restrição por enzimas (por exemplo, a montagem de base de bio-tijolo (BBA)), um processo de clonagem relativamente demorada em comparação com GGA. 7 O plasmídeo PGR-Azul foi projetado para funcionar de forma semelhante ao PGR mas usa uma seleção procedimento de clonagem e cor colónia mais rápida. Estas modificações, junto com o nosso protocolo simplificado, certifique-PGR-Azul adaptável a educação e laboratórios de pesquisa orientada.
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Acknowledgments
Autores gostariam de reconhecer Malcom Campbell e Todd Eckdahl com o Consórcio do Genoma para o Active Ensino (GCAT) e da Educação Alliance HHMI-Science - programa Caçadores de fagos Avançando Genómica e Ciência Evolutiva (SEA-fagos).
Este projecto foi apoiado por doações do Centro Nacional de Investigação Recursos (P20RR016460) e do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (P20GM103429) do National Institutes of Health. Esta pesquisa foi apoiada em parte pela National Science Foundation, Grant # IIA-1.457.888. (Ouachita Baptist University) Os fundos Além disso institucionais foram fornecidos pela JD Patterson Verão Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
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