Protocol
1. Проектирование и заказа олигонуклеотиды с Соответствующих липкими концами
- Выявление потенциальных Rho-независимого терминатора путем геномного анализа с помощью программ, которые свободно доступны в Интернете. 7
- При работе с двухцепочечной ДНК, определяют ориентацию терминатора быть испытанным. 7 ГПР-Blue плазмиду только проверяет терминаторы лигируют в 5' - 3 'направлении сверху (вперед цепь).
- Преобразование нижней (обратный) нити терминатор к его обращенно дополнения переориентировать последовательность для тестирования в ПГР-голубым цветом с помощью бесплатного программного обеспечения, например, APE.
- После того, как ориентация определяется правильным, добавьте липкий конец "5'-CGAC-3 '" с 5'-конца верхней нити. Добавьте липкий конец "5'-CCGC-3 '" до 5' конца нижней нити. 8 Это гарантирует , что сшита вставка будет вставлена в соответствующийОриентировка с помощью GGA.
- После того, как последовательности определяются, порядок, как одноцепочечными олигонуклеотидами на коммерческой основе.
2. Отжиг олигонуклеотиды (Относится только к сублимационной сушке ДНК)
- Повторное приостановить отдельные олигонуклеотиды в нуклеазная свободной воде до концентрации 100 мкМ.
- Сделать 10x отжига буфер: 1 М NaCl и 100 мМ Трис-HCl, рН 7,4. Отжиг буфер можно хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель. После отжига буфер выполнен и олигонуклеотиды ресуспендировали, начинают отжиг 8.
- Для каждого терминатора быть испытанным, добавить 16 мкл сверхчистой воды до 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
- Добавляют 2 мкл 10х отжига буфера в каждую пробирку микроцентрифужных.
- Добавить 1 мкл верхней нити олигонуклеотида (100 мкМ), от желаемого терминатора.
- Добавить 1 мкл нижней ветви олигонуклеотида (100 мкМ), от желаемого терминатора.
- Создание кипящему ба водый с использованием 1000 мл химический стакан, содержащий приблизительно 400 мл водопроводной воды и места на горячей плите.
- Поместите трубки микроцентрифужных с шага 2.6 в поплавком и кипятят в течение 4 мин. Через 4 мин, выключить плиту тепла , но оставить трубку и плавать в водяной бане медленно охлаждаться O / N (18 ч) 8. Храните отожженном терминаторов при -20 ° С.
3. Золотые ворота в сборе (Standard Mix - экономически эффективное)
- Сделать 40 нМ разведение отожженных терминаторов. Добавьте 124 мкл нуклеазы свободной воды в 1 мкл отожженной терминаторы смеси (100 мкМ).
- Центрифуга образцов в течение 30 сек при 10000 XG и хранить на льду.
- В настоящее время используется новая труба подходит для амплификатора, добавьте 6 мкл нуклеазы свободной воды.
- Добавить 1 мкл ДНК - лигазы коммерческий буфер [300 мМ Трис-HCl (рН 7,7-7,8), 100 мМ MgCl 2, 100 мМ DTT и 10 мМ АТФ]. Выполнить все последующие шаги на льду.
- Добавить1 мкл ПГР-Blue (35-50 нг / мкл) плазмиды назначения в микроцентрифужных трубки.
- Добавить 1 мкл 40 нМ отожженных терминаторов в микроцентрифужных трубки.
- Добавить 0,5 мкл коммерчески высокоточный BsaI Рестриктна в микроцентрифужных трубки.
- Добавить 0,5 мкл коммерческого ДНК-лигазы в микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга реакционной смеси при 10000 х г в течение 120 сек. Затем поместите трубку непосредственно в амплификатор.
- Запуск программы амплификатора: 20 циклов: 1 мин при 37 ° С, а затем 1 мин при 16 ° С, а затем 1 цикл 15 мин при 37 ° С. Используйте образцы сразу или заморозить и хранить при температуре -20 ° C. 8
4. Золотые ворота в сборе (Commercial Master Mix - Время Эффективное)
- Добавьте 124 мкл нуклеазы свободной воды в 1 мкл 100 мкМ отожженных терминаторы, созданный на шаге 2. Это разбавляет концентрацию ДНК терминатора до 40 нм.Выполните этот шаг в новом, маркированы 1,5 мл микроцентрифужных трубку.
- В новую пробирку, подходящей для амплификатора, добавить 14 мкл нуклеазы свободной воды. Убедитесь, что новая трубка обозначена соответствующим образом.
- Добавьте 2 мкл Commercial Master Mix буфера в микроцентрифужных трубки.
- Добавляют 1 мкл ПГР-голубой плазмиды (35-50 нг / мкл) в микроцентрифужных трубки.
- Добавьте 2 мкл 40 нМ отожженных терминаторов в микроцентрифужных трубки.
- Добавить 1 мкл Commercial Master Mix в микроцентрифужных трубки.
- Центрифуга 40 нм трубки при 10000 мкг в течение 120 сек. Затем поместите трубку непосредственно в амплификатор.
- Запуск программы амплификатора: 1 цикл 60 мин при 37 ° С, а затем 1 цикл 15 мин при 55 ° С. Используйте образцы сразу или заморозить и хранить при температуре -20 ° C.
5. Трансформация и отбор колоний
- Подготовьте Лурия Base (LB) агар чашки Петри, содержащих 1 мМ Концентратион ампициллин (Amp) и 10 мМ концентрация арабинозы (АРБ). Приготовьте по меньшей мере , 10 мл 1 M L -арабинозы маточного раствора , так как этот раствор будет использоваться на последующих этапах.
- Используйте любой высокоэффективное (10 8 - 10 9 трансформантов / мкг) химически компетентную E. палочки (JM109) клетки для трансформации. 9 Для достижения наилучших результатов, добавьте 3-5 мкл реакции лигирования в 50 мкл компетентных клеток. При использовании химических компетентных клеток, следовать протоколу преобразования, специфичные для используемого клетки.
- Намажьте половину (25 мкл) трансформированных клеток на предварительно подогретой LB (АМФ / АРБ) агаром с использованием стерильного L-образный "хоккейной клюшки" и инкубировать O / N при 37 ° С. В связи с высокой скоростью к ампициллину в декомпозиции, не инкубировать при 37 ° С в течение 24 часов.
- Выполнить отбор колонии на основе цвета путем визуального осмотра. Успешный лигирование должен быть белый / желтый в видимом свете и флуоресцирует зеленый недеформированнойг-синий (450 нм) или ультрафиолетового света. Неудачная лигирования будет производить колонии, которое синего цвета под видимым светом после 18 - 20 часов.
6. Проверка и Количественное Терминатор
- Приготовьте 5 мл стерильного LB-бульоне пробирки с 1 мМ ампициллина и 10 мМ арабинозы. Число труб, необходимых зависит от количества терминаторов проходит испытания плюс контрольной группе (клетки с устойчивость к ампициллину, которые не флуоресцируют и клеток, содержащих режиссерский PGR-Blue плазмиды).
- Под видимым светом выбрать 2-3 белый / желтые колонии (шаг 5.4), используя стерильную петлю. Разрешить образцы для инкубирования в бульонах на шейкере при 37 ° С и 160 оборотах в минуту в течение 16-18 часов. Не инкубировать эти образцы в течение более 24 часов.
- Необязательно использовать спектрофотометр для определения плотности оптической ячейки при 600 нм (OD 600) для обеспечения адекватного роста клеток. Как правило, OD 600 ~ 0.8-1.0 наблюдается через 16-18 ч роста.
- использованиестерильный 96-луночный планшет для остальных этапов. Провести эти шаги в асептических условиях и в трех экземплярах. Добавьте 199 мкл стерильного LB + Amp / арабинозы бульона (1 мМ ампициллина / 10 мМ арабинозы) в каждую лунку. Включите номер на пластине для трех отдельных элементов управления.
- Используйте следующие три элемента управления: только хорошо (1), содержащий LB + Amp / арабинозы бульон и хорошо (2) для нетрансформированных компетентные клетки (пустой), чтобы служить в качестве заготовки. Для количественной оценки (3) прочности терминатора, клетки, содержащие режиссерский оригинальный ГПР или содержащий ГПР-Blue лигирован с непостоянным истекающий последовательности должны быть включены (управления заданием для количественной оценки). На рисунке 1 макета планшет - ридер.
- Пипеткой 1 мкл раствора клетки из O / N бульоны в отдельные лунки 96-луночного планшета.
- Уплотнительные пластины с воздухопроницаемой крышкой и встряхивают в течение 18-20 ч при 37 ° С и 160 оборотов в минуту.
- С помощью планшет - ридера, определить OD 600 путем считыванияОптическую плотность при 600 нм. Мера флуоресценции GFP следующим образом : 395 возбуждения и эмиссии 509. Мера RFP флуоресценции следующим образом : возбуждение 575 и излучение 605. После 18-20 ч, оптическая плотность 600 должна составлять приблизительно 0,5.
- Для нормализации для изменения роста, использовать уравнение:
как для GFP и RFP. - После нормализации, определить относительную силу терминатор с помощью уравнения
как для GFP и RFP. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол будет производить клетки , содержащие ПГР-синего цвета с терминатором лигированы между GFP и RFP с использованием Golden Gate в сборе (рис 2). Положительные колонии, содержащие вставку лигировали могут быть выбраны на основе цвета. В видимом свете положительные колонии будет белый / желтый и ложных срабатываний будет производить голубые колонии после 18-20 ч инкубации при 37 ° С (рисунок 3).
После отбора колоний, планшет-ридера может быть использован для определения прочности терминатор. В качестве доказательства концепции, шесть предполагаемых терминаторы (T1-6) были bioinformatically идентифицированы в mycobacteriophage Bernal13. Результаты на рисунке 4 показывают относительную силу терминатор с клетками , экспрессирующими необрезанный / немодифицированного PGR в качестве контроля. Если предсказанное терминатор имеет отношение / GFP RFP, похожий на ГРР (~ 0,0) или ниже 0,1, то последовательность была определена, чтобы не быть терминатором(T5 и T6). Тем не менее, численно каждый десятый рост представляет собой кратное увеличение прочности терминатора по сравнению с контролем. Например, T3 имел высокое соотношение экспрессии GFP по отношению к RFP и показал 5-кратное увеличение (0,5 на графике) в силе терминатора по сравнению с контролем и считался сильным терминатор (рисунок 4). Данные были собраны в трех экземплярах и усреднены для визуального представления.
Для того, чтобы определить наилучший способ управления заданием для количественной оценки прочности терминатора, мы сравнили необработанные данные с использованием оригинальной ГРР плазмиды, не содержащей терминатор и ГПР-Blue клонированный с последовательностью, известной не быть терминатором. Оба элемента управления показали сходные уровни GFP и RFP выражения (рисунок 5) и, что более важно, получают аналогичные GFP / RFP отношения.
Figure 1. S chematic Детализация планшет - ридер макета. Номер должен быть включен в ридере для трех отдельных элементов управления (зеленый). Хорошо (1), содержащий LB + Amp / арабинозы бульон только и хорошо (2) для нетрансформированных компетентных клеток (пустые), чтобы служить в качестве заготовки. Для количественной оценки (3) прочности терминатора, клетки, содержащие режиссерский оригинальный ГПР или содержащий ГПР-Blue лигирован с непостоянным истекающий последовательности должны быть включены (управления заданием для количественной оценки). Остальная часть пластины (желтый) может быть использован для тестирования предполагаемых терминаторы. Предполагается , все клетки быть выращены в трех экземплярах и усредненные перед анализом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Ориентация Клонирование сайта и экспрессияПГР-синий. Конститутивная экспрессия AmilCP (Синий Chromo белка) приводится в действие в противоположном (нижней нити) направлении GFP и RFP. Когда переваривают BsaI, AmilCP и BsaI сайтов узнавания удаляются, а терминатор испытываемый постоянно лигируют в плазмиду. Верхняя и нижняя нить нить терминатором с соответствующими липкими концами показаны. Гены регулятор AraC и ампициллину в плазмиде , но не показаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Выбор колонии после Клонирование. (А) представитель пластины после того, как ПГР-синий / терминатора перевязки (стандартная смесь) и трансформации клеток. Синие колонии представляют собой неудачные перевязку и белый / желтый седловиныonies (указанные стрелкой) являются успешными лигатуры. (B) увеличенного изображения одного и того же пластины , показывая репрезентативные колонии после трансформации. Цвет фона был изменен в цифровой форме с целью лучшего выделения цвета колонии различий. Трансформированные клетки (E.coli -JM109) высевали на чашках с LB платс , содержащих ампициллин и арабинозы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Количественное шести различных терминаторов в ПГР-синий. Шесть предполагаемых терминаторов (T1-6) были bioinformatically идентифицированы в mycobacteriophage Bernal13. Результаты показывают относительную флуоресценцию. Все результаты были нормализованы с использованием клеток, содержащих необрезанный / немодифицированного PGR в качестве контроля. Т3 было установлено, что сильныйтерминатор. Все результаты представляют собой отдельные колонии, выращенные в трех экземплярах и усреднены для визуального представления. Планки погрешностей представляют отклонения между усредненными точек данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. GFP и RFP Expression в контрольной группе . Экспрессия GFP и RFP необработанными / неизмененном ГРР и двух различных последовательностей , не терминатора , вставленной в ПГР-синий. Все результаты представляют собой отдельные колонии, выращенные в трех экземплярах и усреднены для визуального представления. Планки погрешностей представляют отклонения между усредненными точек данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важным шагом в этом протоколе является правильная разработка олигонуклеотид перед заказом. Олигонуклеотиды должны иметь соответствующие липкие концы добавлены к концам 5'как на верхней и нижней нити, чтобы гарантировать, что GGA включение возможно. Кроме того, важно, чтобы переключить ориентацию слева перед терминатор (терминаторов, которые останавливают транскрипцию на нижней ветви), что и справа, обращенной (прекращает транскрипцию на верхней нити) терминаторы, потому что экспрессия GFP и RFP находится в правом облицовочный (верхняя цепь ) направлении.
Два отдельных протоколов GGA и буферные смеси могут быть использованы для тестирования терминаторы в ПГР-Blue. Сочетание стандартного экономика состоит из материала покупки по отдельности , а затем смешивают в лаборатории 8. Второй протокол использует коммерческий предварительно сделанный GGA мастер смеси. В то время как оба хорошо работают; коммерческий основной смеси, включающей более эффективный по времени, но является относительно дорогим по сравнению со стандартной смесью.В обстановке образования, это может быть более экономичным, чтобы сделать стандартный GGA смесь заранее и заморозить аликвоты для индивидуального использования студентами.
В результате модификации PGR для GGA и добавления amilCP в обратной ориентации для выбора цвета, экспрессия GFP и RFP ограничена в режиссерский PGR-Blue плазмиды и не должна использоваться в качестве опорного контроля при определении относительной силы терминатор. Тем не менее, все изменения будут удалены в процессе клонирования позволяет должным образом количественной оценки относительной силы терминатора. Хотя это лучше всего использовать оригинальные немодифицированные ГРР плазмиды аналогичные результаты могут быть достигнуты путем клонирования последовательности заведомо не терминатор в ПГР-синий. Оба элемента управления показали одинаковые уровни экспрессии GFP и RFP (рисунок 5) и, что более важно, имели сходные отношения GFP / RFP.
Для жесткой регуляции экспрессии генов, ГПР-Blue плазмида конститутивно выражает регулятор ARACиз pBAD (арабинозы индуцируемый) промотор. 10,11 В зависимости от клеточной линии используется высокая концентрация арабинозы может потребоваться для экспрессии GFP и RFP. Хорошие результаты были достигнуты с использованием концентрации 10 мМ арабинозы в E. палочка линия клеток JM109. Трансформированные клетки должны быть либо белого / желтого или синего цвета в видимом свете. Под ультрафиолетовым светом или синим светом (450 нм), обычно только видеть зеленую флуоресценцию, но не красный положительно трансформированных клеток. Тем не менее, ЗП флуоресценции определяли с помощью планшет-ридере.
Терминаторы, используемые в качестве доказательства концепции для этого протокола были определены в mycobacteriophage Bernal13. Тем не менее, ГПР-Blue работает только в E. палочка , и это не является челночный вектор , который может быть выражен у других видов бактерий. Результатом является то, что мы не знаем точно, как идентифицированные терминаторы будет функционировать в их среде хозяина и является потенциальным ограничением. Кассета экспрессии ассоциироватьd с ГПР-Blue примыкают традиционных сайтов клонирования и может быть перемещен в соответствующий челночный вектор. Это позволило бы отдельные исследователи адаптировать ПГР-синего до их конкретных видов бактерий, если это желательно.
Хотя существуют и другие процедуры анализа последовательности с высокой пропускной способностью доступны, наиболее использовать прямой подход генетики. Эти подходы используют сайт - направленный мутагенез или олиго-синтез генерировать сотни и тысячи потенциальных комбинаций последовательностей. 12,13 После создания эффект каждой модификации последовательности затем каталогизированы. Тем не менее, ГПР-Blue предназначен для более направленного применения обратной генетики. При анализе нового генома в силикомарганца, он является общим для наблюдения несколько потенциальных терминаторов в данной области. ГПР-Blue был разработан , чтобы помочь исследователям быстро уточнить их в силикомарганца предсказаний, позволяя им испытать предположительные последовательности в естественных условиях. Следует отметить, испытательную терминатор plasmi ГРРd была использована для количественной оценки прочности терминатора в 582 последовательностей 4, однако ГРР использует стандарт рестрикции-фермента сборки (например, базовый био-кирпича сборки (BBA)), относительно затратная время процесса клонирования по сравнению с GGA. 7 ГПР-голубой плазмиды был разработан, чтобы функционировать аналогично ГРР, но использует более быструю процедуру клонирования и цвет колонии выбор. Эти модификации, вместе с нашим упрощенным протоколом, сделать ГПР-Blue адаптируется как к образованию и научно-исследовательских лабораторий, ориентированных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать Малькольм Кэмпбелл и Тодд Eckdahl с Genome Consortium для активного обучения (GCAT) и Альянса HHMI-научного образования - фага Hunters Выросшие Genomics и эволюционная наука программы (SEA-фагов).
Этот проект был поддержан грантами от Национального центра исследовательских ресурсов (P20RR016460) и Национального института общих медицинских наук (P20GM103429) из Национальных институтов здравоохранения. Это исследование было поддержано частично Национальным научным фондом в рамках гранта # IIA-1457888. Кроме того, институциональные (Ouachita Baptist University) средства были предоставлены через JD Patterson Summer Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
- Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
- Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
- Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
- Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
- Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
- Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
- Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
- Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).
