Protocol
1. Utforma och Ordering oligonukleotider med lämpliga utstickande ändarna
- Identifiera potentiella Rho-oberoende terminatorer genom genomisk analys med hjälp av program som är fritt tillgängliga på nätet. 7
- När man arbetar med dubbelsträngat DNA, bestämma orienteringen för terminatorn som skall testas. 7 PGR-Blue plasmid verifierar endast terminatorer ligerade i 5 'till 3'-riktning på den övre (främre strängen).
- Konvertera en botten (bakåt) strängen terminator till sitt omvända komplement till omorientera sekvensen för att testa i PGR-Blue med hjälp av gratis programvara online, t.ex. apa.
- Efter orienteringen bestäms vara korrekt, tillsätt klibbig ände "5'-CGAC-3 '" till 5'-änden av den övre strängen. Lägg den klibbiga änden "5'-CCGC-3 '" till 5' änden av bottensträngen. 8 Detta kommer att säkerställa att ligerade insats kommer att införas i den lämpligariktning med GGA.
- När sekvenser bestäms, beställa så enkelsträngade oligonukleotider kommersiellt.
2. Glödgning Oligonukleotider (gäller endast Frystorkad DNA)
- Återsuspendera individuella oligonukleotider i nukleasfritt vatten till en koncentration av 100 ^ M.
- Göra 10x pamingsbuffert: 1 M NaCl och 100 mM Tris-HCl pH 7,4. Pamingsbuffert kan förvaras vid 4 ° C under flera veckor. När glödgning buffert görs och oligonukleotider återsuspenderas, börja glödgning 8.
- För varje terminator som skall testas, tillsätt 16 pl ultrarent vatten till en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 2 pl av 10x annealing buffert i varje mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 pl av toppsträngen oligonukleotid (100 | iM) från den önskade terminatorn.
- Tillsätt 1 pl av bottensträngen oligonukleotid (100 | iM) från den önskade terminatorn.
- Skapa ett kokande vattenbad bath användning av en 1000 ml bägare innehållande ca 400 ml kranvatten och placera på en värmeplatta.
- Placera mikrocentrifugrör från steg 2,6 i en flottör och koka i fyra minuter. Efter fyra minuter, stäng av värmen plattan men lämnar röret och flyta i vattenbadet svalna långsamt O / N (18 timmar) 8. Förvara glödgade terminator vid -20 ° C.
3. Golden Gate Assembly (Standard Mix - Kostnadseffektiv)
- Gör en 40 nM utspädning av glödgade terminator. Lägg 124 pl nukleasfritt vatten till 1 pl glödgad termineblandning (100 ^ M).
- Centrifugera prover för 30 sek vid 10000 xg och förvara på is.
- Till ett nytt rör lämpligt för termocykler som används, tillsätt 6 | il sterilt vatten.
- Tillsätt 1 pl av kommersiell DNA-ligasbuffert [300 mM Tris-HCl (pH 7,7 till 7,8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT och 10 mM ATP]. Utför alla efterföljande steg på is.
- Lägg till1 pl PGR-Blue (35-50 ng / l) destination plasmid till mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 pl av 40 nM glödgat termine till mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 0,5 l kommersiella high-fidelity Bsal restriktionsendonukleas till mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 0,5 pl av kommersiell DNA-ligas till mikrocentrifugrör.
- Centrifugera reaktionsblandningen vid 10.000 xg under 120 sek. Placera sedan röret direkt i termo.
- Köra termocykler programmet: 20 cykler av 1 min vid 37 ° C följt av 1 min vid 16 ° C, följt av en cykel av 15 minuter vid 37 ° C. Använd prover omedelbart eller frysa och lagra vid -20 ° C. 8
4. Golden Gate Assembly (Commercial Master Mix - tidseffektivt)
- Lägg 124 pl nukleasfritt vatten till 1 pl av 100 pM glödgade terminatorer skapade i steg 2. Detta späder terminatorn DNA-koncentrationen till 40 nM.Utför detta steg i en ny, märkt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Till ett nytt rör lämpligt för termocykler, tillsätt 14 | il sterilt vatten. Se till att nya röret är märkt i enlighet därmed.
- Tillsätt 2 pl Commercial Master Mix buffert till mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 pl PGR-Blue plasmid (35-50 ng / l) till mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 2 pl 40 nM glödgat termine till mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 1 pl Commercial Master Mix till mikrocentrifugrör.
- Centrifugera 40 nM röret vid 10.000 xg under 120 sek. Placera sedan röret direkt i termo.
- Köra termocykler programmet: en cykel av 60 minuter vid 37 ° C följt av en cykel av 15 minuter vid 55 ° C. Använd prover omedelbart eller frysa och lagra vid -20 ° C.
5. Transformation och Colony Val
- Förbered Luria Base (LB) agar petriskålar innehållande ett mM Koncentratjonen av ampicillin (Amp) och en 10 mM koncentration av arabinos (ARB). Förbereda minst 10 ml av 1 M L -arabinose stamlösning eftersom denna förrådslösning kommer att användas i senare steg.
- Använd någon högeffektiv (10 8 - 10 9 transformanter / pg) kemiskt kompetenta E. coli (JM 109) celler för transformation. 9 För bästa resultat, lägg 3-5 pl ligeringsreaktionen till 50 pl kompetenta celler. Vid användning av kemiska kompetenta celler, följ transformationsprotokollet som är specifik för cellerna som används.
- Sprida halv (25 ^ il) av de transformerade cellerna på förvärmda LB (Amp / ARB) agarplattor med användning av en steril L-formad "hockeyklubba" och inkubera O / N vid 37 ° C. På grund av ampicillin snabba sönderdelningshastighet, inte inkubera vid 37 ° C under 24 h.
- Utför koloni urval baserat på färg genom visuell inspektion. En framgångsrik ligering ska vara vit / gul i synligt ljus och fluorescerar i grönt under blå (450 nm) eller UV-ljus. En misslyckad ligering kommer att producera en koloni som är blå i färg under synligt ljus efter 18-20 timmar.
6. Kontroll och kvantifiering av Terminator
- Förbered 5 ml sterilt LB-buljong rör med 1 mM ampicillin och 10 mM arabinos. Antalet rör som behövs är beroende av antalet terminatorer testas plus kontroller (celler med ampicillinresistens som inte fluorescerar och celler innehållande den oklippta PGR-Blue plasmid).
- Under synligt ljus plocka 2-3 vit / gula kolonier (steg 5,4) med en steril ögla. Tillåta proverna att inkubera i buljonger på en skakanordning vid 37 ° C och 160 rpm under 16 till 18 h. Inte inkubera dessa prover för mer än 24 timmar.
- Du kan också använda en spektrofotometer för att bestämma optisk cell densitet vid 600 nm (OD 600) för att säkerställa tillräcklig celltillväxt. I allmänhet en OD 600 av ~ 0,8-1,0 observeras efter 16-18 timmar av tillväxt.
- Användningen steril 96-brunnar för de återstående stegen. Genomför dessa steg i en aseptisk miljö och i tre exemplar. Lägg 199 ul steril LB + Amp / arabinos buljong (1 mM ampicillin / 10 mM arabinos) till varje brunn. Inkludera rum på plattan för tre separata kontroller.
- Använd följande tre kontroller: En väl (1) innehållande LB + Amp / arabinos buljong bara och en brunn (2) för otransformerade kompetenta celler (tomma) för att tjäna som en blank. För kvantifiering (3) hos terminatorn styrka, celler innehållande uncut original- PGR eller innehållande PGR-Blue ligerades med en icke-avslutande sekvensen bör ingå (referenskontroll för kvantifiering). Se figur 1 för plattläsare layout.
- Pipettera 1 l av cellösningen från O / N buljonger till individuella brunnar i 96-brunnar.
- Tätningsplattor med en andas lock och skaka i 18-20 timmar vid 37 ° C och 160 rpm.
- Med användning av en plattläsare, fastställa OD 600 genom att läsaabsorbans vid 600 nm. Mät GFP fluorescens enligt följande: excitation 395 och emissions 509. Mät RFP fluorescens enligt följande: excitation 575 och emissions 605. Efter 18-20 timmar, bör OD600 cirka 0,5.
- För att normalisera för variation i tillväxt, använd ekvationen:
för både GFP och RFP. - Efter normalisering, bestämma relativ terminator styrka med hjälp av ekvationen
för både GFP och RFP. 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll kommer att producera celler som innehåller PGR-blå med en terminator ligerad mellan GFP och RFP använder Golden Gate Assembly (Figur 2). Positiva kolonier innehållande ligerad insats kan väljas baserat på färg. I synligt ljus positiva kolonier kommer att vara vit / gul och falska positiva kommer att producera blå kolonier efter 18-20 h inkubation vid 37 ° C (Figur 3).
Efter koloni val, kan en plattavläsare användas för att bestämma terminator styrka. Som proof of concept, var sex förmodade termine (T1-6) bioinformatically identifierats i mycobacteriophage Bernal13. Resultaten i figur 4 visar relativa terminator styrka med celler som uttrycker oklippt / omodifierad PGR som en kontroll. Om en förutsagd terminator har en GFP / RFP förhållande liknar PGR (~ 0,0) eller under 0,1, då sekvensen bestämdes att inte vara en terminator(T5 och T6). Men numeriskt varje tionde ökning representerar en faldig ökning av terminator styrka i förhållande till kontrollen. Till exempel, T3 hade en hög andel av GFP uttryck i förhållande till RFP och visade en 5-faldig ökning (0,5 på graf) termine styrka jämfört med kontroll och ansågs vara en stark terminator (Figur 4). Data samlades in i tre exemplar och i genomsnitt för visuell representation.
För att bestämma den bästa referenskontroll för kvantifiering terminator styrka, jämförde vi rådata med hjälp av den ursprungliga PGR plasmid som innehåller någon terminator och PGR-Blå klonad med en sekvens känd inte vara en terminator. Båda kontrollerna visade liknande nivåer av GFP och RFP uttryck (Figur 5) och, ännu viktigare, gav liknande GFP / RFP förhållanden.
Figure 1. S chematic Detailing Plate Reader layout. rummet bör ingå på plattan läsare för tre separata kontroller (grön). En väl (1) innehållande LB + Amp / arabinos buljong bara och en brunn (2) för otransformerade kompetenta celler (tomma) för att tjäna som en blank. För kvantifiering (3) hos terminatorn styrka, celler innehållande uncut original- PGR eller innehållande PGR-Blue ligerades med en icke-avslutande sekvensen bör ingå (referenskontroll för kvantifiering). Resten av plattan (gul) kan användas för att testa förmodade terminatorer. Det föreslås alla celler odlas i tre exemplar och i genomsnitt före analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kloning Site Orientering och expression avPGR-Blue. Konstitutiv expression av AmilCP (Blue Chromo Protein) drivs i motsatt (nedre sträng) riktning av GFP och RFP. När digererades med Bsal, AmilCP och Bsal igenkänningsställena avlägsnas och terminatorn som skall testas är permanent ligeras in i plasmiden. Toppsträngen och bottensträngen av en terminator med lämpliga klibbiga ändarna är visade. De AraC regulator och ampicillin resistensgener är i plasmiden men inte visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Colony Urval efter kloning. (A) representant plattan efter PGR-Blå / terminator ligation (standard mix) och celltransformation. Blåa kolonier utgör misslyckade ligeringar och vit / gul colonies (anges med pil) är framgångsrika ligeringar. (B) en inzoomad bild av samma platta som visar representativa kolonier efter transformation. Bakgrundsfärgen digitalt ändras till ytterligare belysa kolonifärgskillnader. Transformerade celler (E. coli -JM109) ströks ut på LB-agar plåtar innehållande ampicillin och arabinos. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kvantifiering av sex olika Terminators i PGR-blått. Sex förmodade termine (T1-6) var bioinformatically identifierades i mycobacteriophage Bernal13. Resultaten visar relativ fluorescens. Alla resultat normaliserades med användning av celler som innehåller uncut / omodifierad PGR som en kontroll. T3 visade sig vara en starkterminator. Alla resultat representerar individuella kolonier odlade i tre exemplar och i genomsnitt för visuell representation. Felstaplar representerar avvikelser mellan genomsnittliga datapunkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. GFP och RFP uttryck i Kontroller. Expression av GFP och RFP i oklippt / omodifierad PGR och två olika icke-terminatorsekvenser in i PGR-Blue. Alla resultat representerar individuella kolonier odlade i tre exemplar och i genomsnitt för visuell representation. Felstaplar representerar avvikelser mellan genomsnittliga datapunkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det viktigaste steget i detta protokoll är korrekt oligonukleotid designen innan beställning. Oligonukleotiderna måste ha lämpliga vidhäftande ändarna sattes till 5'-ändarna av både de övre och undre strängarna för att säkerställa att GGA inkorporering är möjlig. Dessutom är det viktigt att byta orienteringen av vänster vända terminatorer (terminatorer som hindrar transkription på bottensträngen) till det av höger vänd (terminerar transkription på den översta strängen) terminatorer eftersom GFP och RFP uttryck är i rätt vänd (toppsträngen ) riktning.
Två separata GGA protokoll och buffertblandningar kan användas för att testa terminatorer i PGR-blått. Standarden-ekonomi mix består av material inköp individuellt och sedan blandas i labbet 8. Det andra protokollet använder en kommersiell färdiga GGA Master Mix. Medan både fungerar bra; den kommersiella huvudblandning är mer tidseffektivt men är relativt dyra jämfört med standardblandningen.I en miljö utbildning, kan det vara mer ekonomiskt att göra standard GGA mixen i förväg och frysa alikvoter för enskild student användning.
Som ett resultat av modifiering av PGR för GGA och tillsats amilCP i omvänd orientering för färgval, är uttrycket av GFP och RFP begränsad i den oklippta PGR-Blue plasmiden och bör inte användas som referens kontroll vid bestämning av relativ terminator styrka. Men alla ändringar avlägsnas under kloningsprocessen möjliggör för korrekt kvantifiering av relativa terminator styrka. Även om det är bäst att använda den ursprungliga omodifierade PGR plasmid liknande resultat kan uppnås genom att klona en sekvens känd för att inte vara en terminator i PGR-Blue. Båda kontrollerna visade lika nivåer av GFP och RFP uttryck (Figur 5) och, ännu viktigare, hade liknande GFP / RFP förhållanden.
För tät reglering av genuttryck, PGR-Blue plasmid uttrycker konstitutivt den AraC regulatorav pBAD (arabinos inducerbar) promotor. 10,11 Beroende på vilken cellinje som användes en hög arabinos koncentration kan krävas för uttryck av GFP och RFP. Goda resultat uppnåddes med användning av en koncentration av 10 mM arabinos i E. coli cellinjen JM109. Transformerade celler bör vara antingen vit / gul eller blått under synligt ljus. Under UV-ljus eller blått ljus (450 nm), är det vanligt att endast se grön fluorescens men inte röd i positivt transformerade celler. Emellertid var RFP fluorescens detekterades med användning av plattläsaren.
Termine används som bevis på konceptet för detta protokoll identifierades i mycobacteriophage Bernal13. Men PGR-Blue fungerar endast i E. coli och det är inte en skyttelvektor som kan uttryckas i andra arter av bakterier. Resultatet är att vi inte vet exakt hur de identifierade termine skulle fungera i sin värdmiljön och är en potentiell begränsning. Expressionskassetten associerad med PGR-Blue flankeras av traditionella kloningsställen och kan flyttas till en lämplig skyttelvektor. Detta skulle göra det möjligt för enskilda forskare att skräddarsy PGR-Blå till deras specifika bakteriearter, om så önskas.
Även om det finns andra förfaranden med hög genomströmning sekvensanalys tillgängliga, använder mest framåt genetik tillvägagångssätt. Dessa metoder använder riktad mutagenes eller oligo-syntes att generera hundratals till tusentals potentiella sekvenskombinationer. 12,13 När skapas, är effekten av varje sekvens modifiering sedan katalogiseras. Dock är PGR-Blå konstruerad för en mer riktad omvänd genetik ansökan. Vid analys av en roman genom in silico, är det vanligt att observera flera potentiella termineringar i ett visst område. PGR-Blue har utformats för att hjälpa forskare snabbt förfina sin in silico förutsägelser genom att låta dem testa förmodade sekvenser in vivo. Det bör noteras PGR terminator testa plasmid användes för att kvantifiera terminator styrka i 582 sekvenserna 4 dock PGR använder ett restriktionsenzymaggregatet standard (t.ex., grundläggande bio-tegelaggregat (BBA)), en relativt tidskrävande kloning process jämfört med GGA. 7 PGR-Blue plasmid har utformats för att fungera på samma sätt som PGR men använder en snabbare kloningsförfarande och koloni färgval. Dessa ändringar, tillsammans med vår förenklade protokoll, göra PGR-blå anpassningsbara till både utbildning och forskning inriktad laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Malcolm Campbell och Todd Eckdahl med Genome Consortium för Active undervisning (GCAT) och HHMI-Science Education Alliance - Fag Hunters kunna främja Genomics och evolutions Science (SEA-fager) program.
Projektet har finansierats med bidrag från National Center for Research Resources (P20RR016460) och National Institute of General Medical Sciences (P20GM103429) från National Institutes of Health. Denna forskning stöds delvis av National Science Foundation i bidrags # IIA-1.457.888. Dessutom institutionella (Ouachita Baptist University) medel tillhandahölls genom JD Patterson Summer Research Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pGR-Blue Plasmid | Addgene | 68374 | |
| pGR-Plasmid | Addgene | 46002 | |
| AeraSeal-(Sterile Sheets) | Excel Scientific | BS-25 | Sterile Sheets only |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | NEB | ||
| BsaI-HF | NEB | R3535S | The non-HF enzyme will work but is less heat stable. |
| NEB Golden Gate Assembly Mix | NEB | E1600S | Commerial Master Mix refered to in the protocol. |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Round Microcentrifuge Floating Rack | Nova Tech International | F18875-6401 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma Aldrich | A-3256 | D-Arabinose will not induce the pBAD promoter |
| Luria Base (LB) - Broth, Miller | Sigma Aldrich | L1900 | |
| Luria Base (LB) - Agar, Miller | Sigma Aldrich | L2025 | |
| Tecan-Infinite M200 Plate Reader | Tecan | ||
| Mix & Go Competent Cells - Strain JM109 | Zymo Research | T3005 | Use company recommended transformation protocol |
| ApE: A plasmid editor-software | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ | ||
| Tris-HCl, Molecular Grade | Promega | H5121 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Biological, Certified) | Fisher Chemical | S671 | |
| Comercial Oligonucleotide synthesis | Integrated DNA Technologies (IDT) | http://www.idtdna.com/site | |
| Microtest Tissue Culture Plates - 96 well (Sterile) | Falcon | 35-3072 | |
| mycobacteriophage "Bernal13" | Genebank | KJ510413 | |
| Nuclease Free Water | Integrated DNA Technologies (IDT) | IDT004 | |
| Sterile, L-shaped Hockey-Stick Cell | Life Science Products | 6444-S1 | |
| Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer | Thermo Scientific | 2000c | |
| ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. | http://rna.igmors.u-psud.fr/ |
References
- Li, J., Zhang, Y. Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression. Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).
- Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
- Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses. CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).
- Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. Vision and change in the biology community: snapshots of change. CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).
- Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators. RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).
- Campbell, A. M., et al. pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students. CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).
- Rhee, J. I., et al. Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA. J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).
- Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein. J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).
- Schleif, R. Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli. Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).
- Kosuri, S., et al. Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).
- Sharon, E., et al. Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters. Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).
