Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

هندسة الأنسجة عن طريق الجوهرية الأوعية الدموية في Published: May 30, 2016 doi: 10.3791/54099
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2
1O'Brien Institute Department, St Vincent's Institute of Medical Research, 2Department of Surgery, University of Melbourne, 3Faculty of Health Sciences, Australia Catholic University
* These authors contributed equally

Abstract

في الجراحة الترميمية، هناك حاجة السريرية عن بديل للطرق الحالية لإعادة الإعمار ذاتي التي هي معقدة ومكلفة والتجارة عيب واحد لآخر. هندسة الأنسجة مستقبل واعد لتلبية هذا الطلب المتزايد. ومع ذلك، تفشل معظم استراتيجيات هندسة الأنسجة لتوليد بدائل الأنسجة مستقرة وظيفية بسبب ضعف الأوعية الدموية. وتركز هذه الورقة على المجراة هندسة الأنسجة نموذج غرفة الأوعية الدموية الذاتية حيث يتم توجيه الشريان perfused والوريد إما حلقة شرياني أو تكوين عنيق التدفق من خلال داخل غرفة جوفاء المحمية. في هذا النظام القائم على غرفة يحدث تنتشر عائية من الأوعية الشريانية وهذا النظام يجذب الدماغية والتهابات مدفوعة هجرة الخلايا الذاتية التي تملأ تدريجيا مساحة الغرفة مع النسيج الليفي الوعائي. الخارجية خلية / غرس مصفوفة عند بناء غرفة يعزز سور خليةvival ويحدد خصوصية الأنسجة المهندسة والتي تتطور. وقد أظهرت دراستنا أن هذا النموذج الغرفة يمكن أن تولد الأنسجة المختلفة مثل الدهون والعضلات القلبية والكبد وغيرها بنجاح. ومع ذلك، هناك حاجة التعديلات والتحسينات لضمان النسيج المستهدف تشكيل ثابت واستنساخه. توضح هذه المقالة بروتوكول موحد لتصنيع اثنين من نماذج مختلفة الغرفة هندسة الأنسجة أوعية دموية في الجسم الحي.

Introduction

افتعال الأنسجة أوعية دموية الوظيفية باستخدام نهج هندسة الأنسجة هو النموذج الناشئ في مجال الطب التجديدي. 1،2 العديد من المقاربات لهندسة أنسجة جديدة وصحية لاستبدال الأنسجة المصابة أو الأجهزة المعيبة تم تطويرها و3-6 تجريبيا في نماذج حيوانية صغيرة إمكانات واعدة السريرية. 7،8 ومع ذلك، الأوعية الدموية لا تزال واحدة من التحديات الكبرى للهندسة الأنسجة الحد من قدرتها على النمو أنسجة حجم ذات الصلة سريريا. 9

النهج الحالية ليوعي الأنسجة اتبع إما مسار خارجي حيث تنمو سفن جديدة من السرير الوعائي المستفيدة وتغزو جميع أنحاء الأنسجة المزروعة يبني 10 أو مسار الأوعية الدموية جوهري حيث ينمو الأوعية الدموية ويوسع في انسجام تام مع الأنسجة النامية حديثا. 11 نهج خارجي ينطوي عادة خلايا البذر على سقالةفي المختبر، وغرس بناء الكامل في الحيوانات الحية مع توقع أن المواد الغذائية، زودت من قبل وسائل الإعلام والثقافة، وسوف يكون مصدرها من التداول. 12،13 مفهوم مبسط كما نشوب الأوعية الدموية بطيئة جدا وفقط يزرع رقيقة جدا (< سوف 1-2 مم) تبقى قابلة للحياة. توفير المواد الغذائية والأكسجين عن طريق الأوعية الدموية كافية والسريع هو في صميم أي محاولات ناجحة لزراعة بدائل أكثر تعقيدا وأكبر الأنسجة المهندسة مثل العظام والعضلات والدهون والأجهزة الصلبة، ويقدم 14،15 الأوعية الدموية الجوهرية احتمال يبني أكبر لتطوير نمو الأنسجة التدريجي بما يتناسب مع زيادة امدادات الدم. تصميم واحد هو في الجسم الحي زرع في غرفة من عنيق الأوعية الدموية مع أو بدون خلية سقالة المصنفة. 5،6 وقد أدى ذلك إلى تمهيد الطريق لإجراءات جديدة لتوليد سمكا الأنسجة أوعية دموية في جوهرها. 16،17 </ P>

وفي الآونة الأخيرة، وقد وضعت استراتيجيات ما قبل يوعي ترقيع الأنسجة، وذلك قبل الغرس. وتهدف شبكات الأوعية الدموية أدرجت هذه لتفممض مع السفن المضيف في غرس السماح لسرعة توفير إمدادات الدم الكامل لتحسين البقاء على قيد الحياة من جميع أجزاء من الكسب غير المشروع نسيج سميك المزروعة. 18

نحن رائدة في الجسم الحي أوعية دموية نموذج هندسة الأنسجة في الحيوانات الصغيرة التي تنطوي على تحت الجلد المزروع الغرفة المغلقة شبه الصلبة التي تحتوي على عنيق الأوعية الدموية perfused والحيوية التي تحتوي على الخلية. غرفة يخلق بيئة الدماغية التي تحفز تنتشر عائية من السفن زرعها. 3 عنيق الأوعية الدموية يمكن أن تكون إما حلقة شرياني أعيد بناؤها أو شريان تدفق من خلال سليمة والوريد. 3-6،19 هذه الأوعية الدموية براعم عنيق على أداء والشريانية واسعة شبكة -capillary-الوريدية التي تربط في كل من الفنeriole وريدي ينتهي عنيق الأوعية الدموية. 3،20 علاوة على ذلك، الغرفة دعم جوفاء المحيطة تحمي الأنسجة النامية من المحتمل تشويه القوى الميكانيكية ويطيل من محرك الدماغية لتعزيز الأوعية الدموية. 3،21،22 إذا تم زرع عنيق سفينة ببساطة إلى الأنسجة الطبيعية وليس داخل الفضاء محمي من الغرفة، تنتشر عائية يتوقف على طول نفس الجدول الزمني كجرح عادي وليس أنسجة جديدة سوف تتراكم حول عنيق. وقد استخدم الباحثون هذا التكوين في الجسم الحي لإنتاج بنيات أوعية دموية وظيفية ثلاثية الأبعاد الأنسجة مع الأوعية الدموية داعمة والحجم ذات الصلة سريريا. 4،23 علاوة على ذلك، ويبني أنسجة أوعية دموية هندسيا مع عنيق الأوعية الدموية سليمة لها يمكن أن تحصد لزرع لاحق في مكان الاصابه . 24،25 شأنه أن سيناريو أكثر جدوى سريريا أن يخلق غرفة في موقع نهائي لاعادة اعماراوك والثدي. وبالتالي، يمكن لهذا دي نوفو نهج هندسة الأنسجة لديها امكانات السريرية لتوفير مصدر جديد من النسيج المستهدف وظيفية للجراحة الترميمية 26-28

فإن بروتوكول التالية توفر المرشد العام لبناء في الجسم الحي أوعية دموية غرفة هندسة الأنسجة في الفئران، والتي يمكن تكييفها في نماذج حيوانية مختلفة، وتستخدم لدراسة العمليات المعقدة من الأوعية الدموية، وإنتاج مصفوفة، والهجرة الخلوية والتمايز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تمت الموافقة على البروتوكولات المذكورة هنا من قبل لجنة الأخلاقيات الحيوان في مستشفى ملبورن سانت فنسنت واستراليا، وكانت تجرى في إطار الالتزام الصارم للمبادئ التوجيهية للمجلس الوطني للصحة والأبحاث الطبية الاسترالية.

ملاحظة: يتم وصف بروتوكولين غرفة أدناه. ويوضح نماذج مختلفة وتصاميم غرفة معينة في الشكل 1. غرفة يرصد (1) من البولي (لنموذج غرفة الفئران شرياني حلقة). ومن أسطواني مع الداخلية قطرها 13 ملم وارتفاعه 4 مم. نافذة عند نقطة واحدة في الجدار يسمح بالوصول دون عوائق لعنيق. في النموذج الثاني (لالفئران التدفق من خلال عنيق نموذج غرفة)، ويتكون من غرفة polyacrylic وغير مستطيلة (10 × 8 × أبعاد 4 مم 3 الداخلية). فقد اثنين من 1.5 ملم فتحات على جانبي لاستيعاب شريان الفخذ والوريد لأنها تتعدى الغرفة.

1. الجرذ شرياني حلقة غرفة نموذج (واحد شامالبر لكل الحيوان)

ملاحظة: قبل بدء عملية جراحية، تأكد من أن جميع الصكوك تم تعقيمها بشكل صحيح. وبالمثل، وضمان بقية الأدوات على مناشف معقمة وهي على مسافة معقولة من حقل الجراحة لتجنب التلوث أثناء العملية.

  1. إعداد الحيوان للجراحة
    1. استخدام الفئران وزنها لا يقل عن 250 غرام لحجمها الكبير من السفن لخلق حلقة شرياني.
    2. تخدير الحيوان مع استنشاق الأيزوفلورين 4٪. تأكيد عمق كاف من التخدير عن طريق تقييم تجاوب إلى أخمص قدميه قرصة. بعد التخدير، والحفاظ على الحيوانات تخدير كاف في جميع أنحاء الداخلي مع 2٪ الأيزوفلورين.
    3. وضع الحيوان في موقف ضعيف على لوحة ظاهرة الاحتباس وتطبيق مواد التشحيم معقم للعين لمنع جفاف أثناء الجراحة.
    4. باستخدام الحلاقة الكهربائية، يحلق على حد سواء الخاصرتين وإزالة الشعر بقطعة من الشاش الرطب.
    5. الإعدادية مواقع الجراحية مع الكلورهيكسيدين/ 70٪ محلول الإيثانول وثنى الحيوان مع المناشف المعقمة. إدارة جرعة واحدة من كاربروفين (5 ملغ / كغ، تحت الجلد)، ومسكن.
  2. حصاد الفخذ الوريد الكسب غير المشروع
    1. باستخدام شفرة رقم 15، وجعل شق الجلد 4 سم على موازاة الفخذ الأيسر إلى الرباط الإربي. هذا يعرض لوحة الدهون الأربية.
    2. قطع طريق لوحة الدهون محيطي مع مقص ترك الأمر تعلق على عنيق في الأوعية الدموية على أساس سفن شرسوفي.
    3. باستخدام المقص الصغير، تحرير التصاقات الأنسجة الضامة غشائي بين جدار البطن والأوعية الفخذ الأساسية.
    4. وضع ضام على جدار البطن وسحب إعلامي. هذا يفضح الرباط الإربي وطول كل من الأوعية الفخذ.
    5. باستخدام ملقط الصغيرة ومقص منحني تشريح الوريد شرسوفي وعزلها من الدهون المحيطة بها عن طريق سحب والقطع بلطف. يعمل هذا المنوال كما حبل عند بناء حلقة.
    6. النقيبز ملقط الصغيرة والمقص الصغير منحني فتح غمد ماحول الأوعية التي تحتوي على الأوعية الفخذية والعصبية على طول الطريق من الرباط الإربي إلى القاصي التشعب لفرع شرسوفي.
    7. باستخدام ملقط الجزئي، والتقاط الوريد الفخذي من البرانية وبلطف فصلها عن الأنسجة المحيطة بها والمرافق الشريان. القيام بذلك مع ملقط الصغيرة ومنحني المقص الصغير أشار ذهابا وعن طريق سحب الأنسجة، وبصرف النظر قطع من خلال ذلك.
      ملاحظة: أبدا الاستيلاء على سمك كامل من جدار الوريد لأن ذلك قد يسبب صدمة للالبطانية مما يجعلها عرضة للتخثر.
    8. فروع جانبية Ligate وجدت أثناء تشريح مع خياطة 10/0 النايلون أو تخثر لهم مخثار ثنائي القطب.
    9. مع الوريد الفخذي خالية تماما، ligate الداني والقاصي ينتهي مع 4/0 خيوط الحرير. تأكد من الحصول على الكسب غير المشروع الوريد لا يقل عن 10 ملم طول وتشمل حوالي 0.5 سم طول فرع شرسوفي لاستخدامها بمثابة حبل حبل الرجلعقد حلقة مفتوحة في الغرفة.
    10. باستخدام ملقط الصغيرة والمقص الصغير على التوالي، وتقليم البرانية من طرفي الكسب غير المشروع عن طريق سحب بلطف والقطع. ويمكن أيضا أن يتم ذلك في وقت لاحق، قبل مفاغرة المجهرية.
    11. تدفق الكسب غير المشروع الوريد بمحلول ملحي heparinized (10 U / مل من الهيبارين) وترك الأمر للراحة في الحل. إغلاق الجرح باستخدام الجري المستمر 4/0 خياطة الحرير زائد اثنين أو ثلاثة إضافية غرز انقطاع بسيطة.
  3. إنشاء شرياني حلقة وزرع الغرفة
    1. كرر الخطوات من 1.2.1 إلى 1.2.4 في نفس الطريقة بالضبط على الطرف المقابل.
    2. باستخدام ملقط الجزئي، تشريح وعزل كل من الشريان والوريد شرسوفي تشكيل لوحة الدهون المحيطة بها. القيام بذلك عن طريق سحب بلطف الأنسجة بعيدا عن السفن
    3. باستخدام ملقط الجزئي، والتقاط الشريان الفخذي بواسطة البرانية وتحريره من الأنسجة المحيطة بها. القيام بذلك مع ملقط الصغيرة ومنحني مستديرة مدببة هيئة التصنيع العسكريمقص ريال عماني عن طريق سحب الأنسجة، وبصرف النظر قطع من خلال ذلك. Ligate أو تخثر فروع جانبها.
    4. Ligate الشريان الفخذي والوريد البعيدة إلى ظهور الأوعية شرسوفية باستخدام 4/0 خياطة الحرير.
    5. وضع المشبك واحد قريب على كل من شريان الفخذ والوريد. باستخدام مقص حاد الصغيرة على التوالي، وجعل عرضية نظيفة قطع في كل القاصي السفينة إلى ظهور فروع شرسوفية. وضع خلفية تباين بلاستيكية معقمة تحت السفن.
    6. تدفق السفن بقوة مع كميات سخية من المياه المالحة heparinized حتى يتم إزالة كافة الدم من التجويف.
    7. جلب الكسب غير المشروع الوريد في حقل الجراحة وإزالة أي البرانية زائدة من نهايات الأوعية 'كما في الخطوة 1.2.10، إذا لزم الأمر.
    8. تنفيذ كل مفاغرة المجهرية مع خياطة 10/0 النايلون. يفاغر نهاية القريبة من الكسب غير المشروع الوريد إلى الوريد الفخذي ونهاية البعيدة إلى الشريان الفخذي. وهذا سوف يسمح بتدفق الدم وROM الشرياني إلى الجانب الوريدي دون مقاومة من الصمامات داخل الأوردة الكسب غير المشروع.
      ملاحظة: تأكد من أن السفن الفخذ والوريد الكسب غير المشروع بقية في موقفهم الطبيعي دون أي التقلبات.
    9. تحقق من وجود تسرب في كلا الموقعين المفاغرة. حل التسريبات الصغيرة، التي تبدو وكأنها غير النابض الدم يسيل من موقع توصيلي، عن طريق وضع قطعة صغيرة من الدهون على أعلى وضغط بلطف لمدة 5-10 دقائق. وأكبر تسرب النابض أن الفيضانات بسرعة الحقل بأكمله يحتاج غرز إضافية.
    10. تحقق المباح من الحلقة شرياني. انسداد طيف من الشريان الفخذي ينبغي أن تجعل من انكماش في حين أن نفس الشيء في الوريد الفخذي ينبغي أن التهم عليه.
    11. وضع قاعدة للغرفة هندسة الأنسجة تحت حلقة شرياني مع يستريح الأخيرة في موقفها الطبيعي دون التقلبات أو مكامن الخلل.
    12. تأمين قاعدة من الغرفة إلى الرباط الإربي والكامنة لفافة العضلات مع 6/0 خيوط النايلون.
    13. وضع غطاء علىالقاعدة بحيث الأوعية الفخذ تدخل الغرفة من خلال تحقيقها (نافذة في جانب من الغرفة). عند إغلاق الغطاء، والتأكد من أنها ملفتة للفروع شرسوفي، بين القاعدة الغرفة وغطاء، والتي تكون بمثابة الحبال لعقد حلقة شرياني في الموقف.
    14. إغلاق الجرح باستخدام الجري المستمر 4/0 خياطة الحرير زائد اثنين أو ثلاثة إضافية غرز انقطاع بسيطة.
    15. السماح للحيوان للتعافي من التخدير على وسادة الاحترار.
    16. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. وبالمثل، لا عودة الحيوان الذي خضع لعملية جراحية للشركة من الحيوانات الأخرى حتى تعافى تماما. بعد 24 ساعة، إدارة جرعة أخرى واحدة من كاربروفين (5 ملغ / كغ، تحت الجلد)، ومسكن.
    17. علاج الجرح مع مرهم مضاد حيوي موضعي لمدة 5 أيام. إذا تم فتح الجرح، تخدير الحيوان كما في الخطوة 1.1.2 خلال 1.1.5 وإغلاق الجرح كما هو الحال في 1.30.14. مراقبة صحة الحيوان يوميا. الموت ببطء الحيوان باستخدام جرعة قاتلة من حقن lethabarb داخل الصفاق (163 ملغ / كغ في 0.25 مل بنسبة 23 إبرة G) إذا تبين للحيوان أكثر من علامات معتدلة من inacitivity، فقدان الشهية، وفقدان الوزن وفقدان اللون.

2. تدفق من خلال غرفة عنيق (اثنان غرف في الحيوان)

  1. إعداد الحيوان للجراحة
    1. كرر الخطوات من 1.1.1 خلال 1.1.4. يمكن زرع غرفتين في كل من مناطق الفخذ من الفئران واحد.
  2. عزل سفن الفخذ والإدراج للغرفة
    1. كرر الخطوات من 1.2.1 خلال 1.2.8.
    2. مع كل من الشريان والوريد سراح تماما من الأنسجة المحيطة بها وفروعها ligated، وجلب الغرفة في مجال الجراحة.
    3. وضع كل من الأوعية الفخذ سليمة على شق المقابلة للقاعدة الغرفة والتأكد من عدم وجود التقلبات أو مكامن الخلل.
    4. إغلاق الغرفة عن طريق attachiنانوغرام غطاء للقاعدة. إغلاق الجرح باستخدام الجري المستمر 4/0 خياطة الحرير زائد اثنين أو ثلاثة إضافية غرز انقطاع بسيطة والسماح للحيوان لاسترداد كما هو موضح سابقا.

3. حصاد الدوائر ومعالجة الأنسجة

  1. مرة واحدة يتم الوصول إلى نقطة زمنية في التجربة (4-6 أسابيع بعد الزرع)، تخدير الحيوان كما في الخطوة 1.1.2 وكرر الخطوات من 1.1.3 خلال 1.1.5.
  2. فتح الجرح باستخدام شفرة رقم 15 وقطع طريق الأنسجة مع مقص حتى يتعرض الغرفة تماما.
  3. فضح الأوعية الفخذ الأقرب إلى بناء واختبار لالمباح الأوعية الدموية: انسداد بلطف السفينة مع اثنين من microforceps، ثم الألبان والدم في اتجاه القاصي وأخيرا الافراج عن ملقط القريبة. إذا تملأ وعاء مع الدم مرة أخرى، وهذا يؤكد المباح. Ligate الأوعية الفخذ قريب في حالة من الحلقة شرياني وكلاهما قريب وبشكل أقصى في حالة من اله التدفق من خلال التكوين، وإزالة غرف مع تحتوي على الأنسجة ككل.
  4. في نهاية التجربة، الموت ببطء الحيوان باستخدام جرعة قاتلة من حقن lethobarb داخل الصفاق (163 ملغ / كغ في 0.25 مل بنسبة 23 إبرة G).
  5. إصلاح الأنسجة في 4٪ امتصاص العرق في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. الأنسجة تقسيمها إلى أقسام عرضية متعددة (1-2 مم) وتضمينها في شمع البارافين أو الأمثل مجمع درجة حرارة القطع لأقسام البارافين (5 ميكرون) أو أقسام المجمدة (10 ميكرون)، على التوالي. 3،4،8،17،22، 24
  6. أداء تلطيخ النسيجي الروتينية مثل الهيماتوكسيلين ويوزين لدراسة مورفولوجية العام للأنسجة. أداء تلطيخ المناعى مع الأجسام المضادة المحددة لتحديد نوع الخلية من الفائدة، 3،4،8،17،22،24،29 على سبيل المثال التروبونين القلبي T المناعية للالعضلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم تنفيذ إنشاء المجهرية غرف هندسة الأنسجة كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. الأنسجة المولدة داخل غرف يمكن فحص تشريحيا كما وصف في خطوة بروتوكول تم 3. أنواع الأنسجة المختلفة هندسيا بنجاح باستخدام المجراة غرفة أوعية دموية (الشكل 2). وتشمل هذه الأنسجة القلبية مع العضلية حديثي الولادة الفئران (الشكل 2A)، الأنسجة العضلية مع الفئران myoblasts الهيكل العظمي (الشكل 2B)، والأنسجة الدهنية مع هيدروجيل المشتقة من الأنسجة الدهنية المصفوفة خارج الخلية (الشكل 2C).

تقييم المورفومترية من الأنسجة لا يمكن أن يؤديها إما مع نظام ستيريو محقق أو برنامج ImageJ. 3،4،8،17،22،29 بالإضافة إلى التقييم النوعي لمكونات الأنسجة المختلفة، ونظام التجسيم كما يسمح لغير منحازة quantification من حجم الأنسجة محددة. على سبيل المثال، كتين (علامة للخلايا القوارض البطانية) ملطخة المقاطع العرضية (الشكل 3) يمكن استخدامها لتقدير حجم الأوعية الدموية في بنيات الأنسجة التي تحصد باستخدام المجهر الفيديو مع نظام التجسيم. ويمكن تطبيق أساليب القياس الكمي مماثلة لتقييم حجم من أنواع الأنسجة الأخرى.

ويمكن أيضا أن الدوائر هندسة الأنسجة أن تستخدم لتتبع مصير الخلية التالية في غرس الجسم الحي. يمكن الخلايا ما قبل المسمى مع الأصباغ الفلورية مثل الجاذبة، PKH26 أو نقاط الكم قبل الزرع. على سبيل المثال، العضلية الفئران حديثي الولادة قبل المسمى مع الجاذبة يمكن الكشف في بنيات الأنسجة التي تحصد في 3 يوم بعد الزرع (الشكل 4A). كما لمسنا بنجاح الخلايا المزروعة التي وصفت قبل مع الجاذبة لمدة تصل إلى 4 أسابيع بعد الزرع. بدلا من ذلك، الأجسام المضادة أنواع محددة يمكن استخدامها لطdentify الخلايا المزروعة في الدراسات زرع الأعضاء. على سبيل المثال، من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة مزروع داخل غرف هندسة الأنسجة في الفئران immunocompromized يمكن تحديدها في بنيات الأنسجة تحصد المناعية مع الأجسام المضادة Ku80 البشري محددة (الشكل 4B).

شكل 1
الشكل 1: هندسة الأنسجة القلبية مع المجراة غرفة أوعية دموية نهج الأوعية الدموية الجوهرية مع شرياني حلقة نموذج الغرفة ونموذج غرفة عنيق التدفق من خلال. وقدمت الدوائر سواء من البولي أو polyacrylic، تم اختبار هذه المواد لتكون غير التهابات وغير سامة في الجسم الحي. شريط مقياس = 5 ملم. إعادة طبع بإذن من 30. نداء حد ذاته انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الأنسجة المهندسة من الجسم الحي في غرف أوعية دموية (A) أنسجة القلب مع العضلية الفئران حديثي الولادة. و immunostained العضلية مع التروبونين القلبي T الأجسام المضادة (البني). (ب) الأنسجة العضلية مع الفئران myoblasts الهيكل العظمي. و immunostained الخلايا العضلية مع الأجسام المضادة desmin (البني). الأنسجة (C) الدهون مع هيدروجيل المشتقة من الأنسجة الدهنية المصفوفة خارج الخلية. 31 Haematoxylin وتلطيخ يوزين. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/files/ftp_upload/54099/54099fig3.jpg "/>
الشكل (3): الإحتوائية من بنيات الأنسجة التي تحصد في 4 أسابيع بعد الزرع صور الممثل أقسام الملطخة كتين. وصفت الأوعية الدموية تنبت من الشريان الفخذي (*) مع كتين (البني). شريط مقياس = 200 ميكرون (يسار) و 100 ميكرون (يمين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: تحديد الخلايا التي تم زرعها في بنيات الأنسجة (A) الجاذبة التسمية العضلية الفئران حديثي الولادة (الأحمر والسهام البيضاء) في بناء أنسجة الفئران التي تحصد في 3 أيام بعد الزرع. (ب) والإنسان محددة Ku80 الملون صورة الأنسجة تمثيلية لبناء الأنسجة التي تحصد من TISSU الفئرانغرفة البريد الهندسة زرعها مع خلايا الجذعية المحفزة من صنع الإنسان في 28 يوما بعد الزرع. وقد تم استخدام نوى الإنسان الفأر البني وimmunocompromized المسمى المناعة لمنع رفض الخلايا البشرية. شريط النطاق = 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويجري حاليا التحقيق في الهندسة من دوران الأوعية الدقيقة أساسا من خلال نهجين. الأول ينطوي على تطوير شبكة الأوعية الدموية المتشابكة للغاية ضمن التركيبة في المختبر بحيث عندما زرعت، الشعيرات الدموية من السرير الوعائي المضيفة التواصل مع تلك التي زرعها بناء من خلال عملية تسمى مفاغمة، وبالتالي ضمان إيصال المواد الغذائية ليس فقط إلى المحيط ولكن أيضا في 21،32،33 الأساسية. وهذا ما يسمى بمرحلة ما قبل الأوعية الدموية. يحاول النهج الثاني لتعزيز الأوعية الدموية المضيف نفسه مباشرة في الجسم الحي، لذلك يحدث أن تنتشر الشعرية سواء قبل أو بالتزامن مع تمايز الخلايا المزروع ونمو الأنسجة. 17،34

في الجسم الحي بروتوكول غرفة هندسة الأنسجة المقدمة هنا يستغل المفهوم الأخير عن طريق وضع الشريان والوريد، إما حلقة شرياني أو تكوين عنيق التدفق من خلال،داخل مساحة فارغة المحمية، مما يسمح تنتشر كبير وتشكيل الشعرية الجديدة على مر الزمن 3 مزايا غرفة تشمل (1) غياب في المختبر التلاعب؛ (2) جيل من شبكة الأوعية الدموية ذاتي تماما والتي سوف يتم رفضها من قبل المضيف. و (3) حقيقة أنه لا يحتاج إلى فترة مفاغمة التي يمكن أن يستغرق ما بين 1-7 أيام مما يجعل الأنسجة بناء من عرضة لنقص التروية. 35،36

ومع ذلك، لا بد من الإشارة إلى أن يستغرق حوالي 3-7 أيام لشعري كبير تنبت أن تحدث، وهي الفترة التي تم أيضا تزويد الأنسجة المزروعة سيئة. وأوعية دموية 3 تأخر زرع الخلايا مرة واحدة في غرفة كاف تمت في الواقع أظهرت تحسن البقاء على قيد الحياة. وتشمل 17 وثمة ميزة أخرى للتوافق مع الحياة وغير المناعية للمواد غرف "(أي البولي وpolyacrylic). بالإضافة إلى ذلك، شام جامدة غير قابلة للطييوفر نوفمبر مساحة المحمية من أجل الأنسجة والأوعية الدموية في النمو دون دمج وتكامل مع البيئة المحيطة بها، والتي من شأنها أن تعرقل خلاف ذلك التوسع وجعل حصاد الأنسجة التي شكلت حديثا صعبا. على النقيض من، والحقيقة أن أغلب الدوائر قد تحد من نمو الأنسجة. هذا، ومع ذلك، فقد تم تناولها في نموذج شرياني حلقة، والذي يستخدم الآن في غرفة المثقبة التي ثبت أن تنمو الأنسجة أكثر فعالية من واحد مغلق. 37

بروتوكولات غرفة النسيج الهندسة المقدمة هنا هي تكرار للغاية ولكن يجب التأكيد على أن غرف نادرا ما يملأ على الانتهاء، وعادة لقدرة حوالي 70٪. يتم تحقيق نتائج متسقة شريطة أن يتم أخذ بعض الخطوات الحاسمة والقضايا الفنية في الاعتبار. عنيق المباح هو الهدف النهائي عند العمل مع الأوعية الدموية، وخاصة إذا تم تنفيذ مفاغرة المجهرية. لقد وجدت دائما لا الأنسجة تنمو إذا كان VASCجلطات عنيق جزيئية الأولى بعد الجراحة. العوامل التي تؤثر على المباح ويمكن تصنيف على نطاق واسع إلى أربع فئات، وهي العمليات الجراحية الفني، وتدفق الدم، تخثر الدم وتشنج.

أولا، تقنية جراحية حساسة هي مفتاح النجاح. في هذا المعنى، وتجدر الإشارة إلى أن هذه الإجراءات، خاصة واحدة تنطوي على خلق حلقة الشرايين والأوردة تتطلب مستوى معين من المهارة الجراحية التي يمكن الحصول عليها بسهولة من خلال ممارسة لأول مرة في نماذج غير الحية، وبعد ذلك في أوعية الفخذ فأر التالية المبادئ والتقنيات وصفت هنا وفي أماكن أخرى. 38 الأضرار التي لحقت جدار الوعاء الدموي، وخصوصا البطانية، يجب تجنب في جميع الأوقات التعامل الصحيح مع السفن، والذي يتضمن أبدا الاستيلاء على سمك كامل من جدار الوعاء الدموي، ومنع المفرطة وتمتد، وحكيمة استخدام مخثار ثنائي القطب، وذلك في حالة من الحلقة شرياني، أداء مفاغرة المجهرية الدقيقة وارضحي. على الرغم من أن التنظيف بمحلول ملحي heparinized يساعد على منع تخثر، فإنه لن تحل أبدا محل تقنية جراحية دقيقة. ثانيا، عوامل تدفق الدم وتتعلق أساسا إلى الاضطراب والركود. تدفق المضطرب الثانوي إلى التقلبات، الانحناءات أو مكامن الخلل السفن يعزز تشكيل خثرة. لذلك يجب ضمان التدفق غير المقيد تبسيط في كل حلقة شرياني ونماذج التدفق من خلال. في هذا المعنى، فإن تأثير الربط فروع شرسوفية في نموذج شرياني حلقة ضرورية لمنع الانحناء. إذا لأي سبب من الأسباب هذه الفروع لا يمكن استخدامها، بسيطة 10/0 غرز النايلون من جدار الوعاء الدموي إلى الأنسجة المحيطة بها ينبغي أن توضع بعناية بدلا من ذلك. الدم ثابتة في موقع توصيلي أثناء إجراء شرياني حلقة هو أيضا مخثر للغاية ويجب منع عن طريق تنظيف السفينة بقوة مع المالحة heparinized قبل وطوال مفاغرة. العوامل ثالثا، الموالية الجلطة مثل الملوثات من حقل من المنطوق ومعظم importantly وجود قطعة من البرانية داخل مفاغرة هي التي ينبغي تجنبها. إعداد السفينة ينتهي بشكل صحيح قبل خياطة المجهرية والحفاظ على الميدان ومفاغرة نظيفة عن طريق التنظيف بانتظام والجوانب الهامة التي يجب مراعاتها عند بناء حلقة شرياني. وأخيرا وليس آخرا، هناك مسألة من تشنج الأوعية. على الرغم من أن الفيزيولوجيا المرضية للتشنج السفينة قد لم توضح تماما، فمن المرجح أن يكون راجعا إلى كل من العوامل المحلية والنظامية. وتشمل العوامل المحلية الصدمة السفينة، ووجود الدم في المنطوق الميدانية والأنسجة جفاف. العوامل النظامية من جهة أخرى، تشكل، وانخفاض درجة الحرارة الأساسية، انخفاض ضغط الدم والاستجابة متعاطفة مع الألم. 38

وهكذا، في كل حلقة شرياني ونماذج التدفق من خلال التعامل السليم وإعداد الحيوان جنبا إلى جنب مع تقنية جراحية حساسة لا يمكن المبالغة. وتشمل استراتيجيات لحل تشنج الري المالحة الدافئة أو مخفف1٪ الزيلوكائين وجود فترة راحة من 5-10 دقيقة. تمدد الأوعية وتجريد من البرانية يمكن أن يساعد أيضا على تخفيف تشنج بسبب تأثير الودي المحليين. 38 للتحايل على الحاجة لإجراء مفاغرة المجهرية والتحدي التقني الذي يعني، تقنية صفعة يمكن استخدامها كما هو موضح في مكان آخر. 39 وتتكون هذه التقنية من إدخال واحد من السفينة ينتهي في الكفة، إيفرت عليه وثبته مع كفافي خياطة 6/0 النايلون. المقبل، وانخفض في نهاية سفينة أخرى على الكفة وتأمين بطريقة مماثلة.

فتحت غرفة النسيج الهندسة نافذة جديدة من الفرص المتاحة في البحوث التجريبية وتتقدم بثبات نحو هدف السريرية المحتملة. حتى الآن، والنماذج المقدمة هنا استخدمت أساسا لتوليد أنسجة الأنساب مختلفة. 4،7،8،17،22،، 24،25،27-29،37،40 على الرغم من ذلك، لديهم عدد من غيرها من التطبيقات المحتملة. على سبيل المثال، ها نحنلقد استخدمت غرفة التدفق من خلال كنموذج فعال وسريع نسبيا لتشكيل مسخي بعد زرع الخلايا الجذعية المحفزة التي يتسبب فيها الإنسان. 41،42 وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب كأداة "مراقبة الجودة" لتحقيق هندسة الأنسجة خالية من الورم مع الخلايا الجذعية المحفزة. أيضا، يمكن استكشافها دراسات علم السموم المخدرات في الأنسجة البشرية نمت داخل الغرفة. وبالمثل، يمكن توليد أنسجة مرضية تسفر عن نهج مثيرة للاهتمام نحو النمذجة المرض واختبار المخدرات. وأخيرا، قد تصبح غرفة النسيج الهندسة أيضا نموذجا محتملا لدراسة نمو الأنسجة وتتبع مصير خلية في الجسم الحي.

في الختام، التي وصفناها بروتوكول تنطوي على وضع غرفة تحت الجلد في الحيوانات من خلال نهجين مختلفين: باستخدام حلقة شرياني المجهرية، أو تكوين عنيق التدفق من خلال. هذه التقنية هي استنساخه للغاية وتعطي نتائج متسقة. لاستخدام حكما تم استغلالها بشكل رئيسي في مجال هندسة الأنسجة حتى الآن، ومع ذلك، هناك مجالات البحث المحتملة الأخرى التي قد تكون هذه الدوائر من الطلب الكبير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل منح التمويل من NHMRC ومؤسسة ستافورد فوكس الطبية. المؤلفون تقر المساعدة الجراحية سو مكاي، ليليانا بيبي، آنا Deftereos وأماندا RIXON من التجارب الطبية وحدة الجراحة، مستشفى سانت فنسنت في ملبورن. ويقدم الدعم أيضا من قبل وزارة حكومة ولاية فيكتوريا في الابتكار والصناعة وبرنامج دعم البنية التحتية التشغيلي التنمية الإقليمي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 15 Blade Scalpel Braun BB515
1 Toothed Adson Forceps Braun BD527R
1 Needle Holder Braun BM201R
1 Bipolar Coagulator  Braun US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3 S & T 00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 S & T 00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 S & T 00108
1 Micro Scissors - Straight SAS-11 S & T 00098
1 Micro Scissors - Curved SDC-11 S & T 00090
2 Single Clamps B-3 S & T 00400
2 10/0 nylon suture S & T 03199
1 6/0 nylon suture Braun G2095469
2 4/0 Silk Sutures Braun C0760145
Xilocaine 1% Dealmed 150733 10 mg/ml
Heparin Sodium Dealmed 272301 5,000 UI/ml
Ringer Lactate Baxter JB2323 500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber custom made
1 flow-through chamber custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia  Vector Laboratories B-1105 1.67 μg/ml
Troponin T antibody Abcam Ab8295 4 μg/ml
Human-specific Ku80 antibody Abcam Ab80592 0.06 μg/ml
Desmin antibody Dako M0760 2.55 μg/ml
Cell Tracker CM-DiI dye Thermo Fisher Scientific C-7000 3 mg/106 cells
Lethabarb (sodium pentobarbitone) Virbac Animal Health LETHA450 325 mg/ml
Heat pad flexible Redzone Heating RZ/Medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
  2. Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
  3. Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
  4. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
  5. Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
  6. Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
  7. Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
  8. Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
  9. Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
  10. Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
  11. Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
  12. Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
  13. Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
  14. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 169-187 (2010).
  15. Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
  16. Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
  17. Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
  18. Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
  19. Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
  20. Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
  21. Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Engineering the microcirculation. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).
  22. Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
  23. Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
  24. Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
  25. Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
  26. Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).
  27. Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
  28. Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
  29. Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
  30. Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
  31. Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
  32. Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
  33. Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
  34. Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
  35. Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
  36. Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
  37. Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
  38. Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).
  39. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
  40. Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
  41. Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
  42. Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 111، هندسة الأنسجة، عنيق الأوعية الدموية، وحلقة الشرايين والأوردة، الأوعية الدموية، جراحة، سفينة الفخذ، الأوعية الدموية، الشعيرات الدموية
هندسة الأنسجة عن طريق الجوهرية الأوعية الدموية في<em&gt; في فيفو</em&gt; غرفة هندسة الأنسجة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhan, W., Marre, D., Mitchell, G.… More

Zhan, W., Marre, D., Mitchell, G. M., Morrison, W. A., Lim, S. Y. Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber. J. Vis. Exp. (111), e54099, doi:10.3791/54099 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter