Abstract
rekonstrüktif cerrahi olarak, başka bir karmaşık, pahalı ve ticari bir kusur, otolog yeniden geçerli yöntemlere alternatif için klinik bir ihtiyaç vardır. Doku mühendisliği bu artan talebi karşılamak için umut vaat ediyor. Ancak, çoğu doku mühendisliği stratejileri nedeniyle zayıf vaskülarizasyon kararlı ve işlevsel doku yerine geçen oluşturmak için başarısız. Bu kağıt bir perfüze arter ve ven ya bir arteriovenöz döngü veya bir akış pedikül yapılandırması olarak korunan bir oyuk odasının içine yönlendirilir içsel vaskülarizasyon in vivo doku mühendisliği odası modeli üzerinde duruluyor. Bu bölme tabanlı sistemde anjiyogenik filizlenme arteriyovenöz gemilerden oluşuyor ve bu sistem yavaş yavaş fibro-damar dokusu ile oda boşluğu doldurur tahrik iskemik ve inflamatuar endojen hücre göçü çekiyor. Eksojen hücre / bölme yapımı sırasında matriks implantasyon hücre sur artırırVival geliştirmek ve mühendislik doku özgüllüğünü belirler. Çalışmalarımız Bu bölme modeli başarıyla bu yağ, kalp kası, karaciğer ve diğer farklı dokular üretmek göstermiştir. Bununla birlikte, modifikasyon ve iyileştirmeler formasyonu istikrarlı ve tekrar üretilebilir, hedef doku sağlamak için gereklidir. Bu makalede, in vivo olarak iki farklı vaskülarize doku mühendisliği odası modelleri imalatı için standart bir protokol tanımlamaktadır.
Introduction
Rejeneratif tıpta ortaya çıkan bir paradigma, bir doku mühendisliği yaklaşımı kullanılarak fonksiyonel vaskülarize doku olduğunu imalatı. 1,2 Birçok yaklaşımlar yaralı doku veya kusurlu organların değiştirilmesi için yeni ve sağlıklı doku mühendisi, 3-6 deneysel küçük hayvan modelleri ile geliştirilmiştir umut verici bir klinik potansiyeli. 7,8 Ancak, damarlanma klinik olarak anlamlı büyüklükte dokuları büyümeye potansiyelini sınırlayan doku mühendisliği için büyük zorluklardan biri olmaya devam ediyor. 9
Güncel yaklaşımlar yeni gemiler alıcı vasküler yataktan büyüdüğü bir dışsal yolu ya izleyin doku vaskülarize ve implant doku 10 veya damar büyür ve yeni gelişen doku ile uyum içinde genişleyen bir içsel vaskülarizasyon yolu yapıları boyunca işgal etmeye. 11 dışsal yaklaşım geleneksel olarak, bir yapı iskelesi üzerinde tohumlama hücreleri kapsarin vitro ve besinler, önceden kültür medya tarafından verilen beklentisi ile yaşayan hayvana tam yapı yerleştirilmesi de, damar büyümesi çok yavaş ve sadece çok ince implantlar (as 12,13 kavram basittir. dolaşımdan kaynaklanan <edilecek 1-2 mm kalınlığında) canlı kalacaktır. Yeterli ve hızlı damarlanma yoluyla besin ve oksijen sağlayan kemik, kas, yağ ve katı organları gibi daha karmaşık ve daha büyük doku mühendisliği yerine geçen büyümek için herhangi bir başarılı girişimleri kalbidir. 14,15 İçsel vaskülarizasyon için potansiyel sunmaktadır daha büyük yapılar genişleyen kan akımı ile orantılı ilerleyici doku büyümesi geliştirmektir. Bir tasarım ile ya da bir hücre numaralı seribaşı iskele olmadan vasküler pedikül bir odasına in vivo implantasyon olduğunu. Bu kalın özünde vaskülarize dokuların üretimi için yeni yöntemlere yol açmıştır 5,6. 16,17 </ P>
Daha yakın zamanlarda, stratejiler İmplantasyondan önce doku greftleri,-vaskülarize ön geliştirilmiştir. Bu anonim kan damarı ağları nakledilen kalın doku grefti tüm parçaları hayatta geliştirmek için bir tam kan kaynağının hızlı sağlanması için izin implantasyon konakçı gemileri ile birleşmek amaçlanmıştır. 18
Bir perfüze vasküler pedikül ve hücre-ihtiva eden biyo materyaller ihtiva eden bir deri altından implante yarı sert kapalı bölme içeren küçük hayvanlarda in vivo vaskülarize doku mühendisliği modeli öncülük etmiştir. Odacık implante gemilerin anjiyojenik filizlenme uyaran bir iskemik bir ortam oluşturur. 3 damar pedikül bir yeniden arteriovenöz döngü veya sağlam bir akış arter ve ven olabilir ya. 3-6,19 Bu damar pedikül filizleri işleyen ve kapsamlı arterden Her iki sanatta bağlantılar -capillary-venöz ağeriole ve venöz vasküler pedikül ile sona erer. 3,20 Dahası, çevredeki boş destek odası vaskülarizasyon geliştirmek için. 3,21,22 damar pedikül sadece içine implante ise potansiyel olarak mekanik kuvvetleri deforme gelişen dokuları korur ve iskemik sürücü uzatır normal doku ve odasının korumalı alanı içinde, anjiyojenik filizlenme normal yara ve pedikül etrafında birikir yeni doku olarak aynı zaman çizelgesi boyunca durur. Araştırmacılar ve klinik olarak önemli büyüklükte destek damar üç boyutlu fonksiyonel vaskülarize doku yapıları üretmek için bu in vivo konfigürasyonu kullanmaktadır. 4,23 Bunun yanında bozulmamış vasküler pedikül tasarlayıp vaskülarize doku yapıları yaralanma yerinde daha sonra transplantasyon için hasat edilebilir . bir klinik olarak daha uygun senaryo yeniden s için kesin yerinde odasını oluşturmak olacaktır 24,25meme olarak uch. Bu nedenle, bu de novo doku mühendisliği yaklaşımıyla rekonstrüktif cerrahi için işlevsel bir hedef doku, yeni bir kaynak sağlamak için klinik bir potansiyele sahip olabilir. 26-28
Aşağıdaki protokol, farklı hayvan modellerinde uyarlanmış ve anjiyojenez, matriks üretim ve hücre göçü ve farklılaşmasının karmaşık işlemlerini incelemek için kullanılabilir olabilir sıçan, bir in vivo vaskülarize doku mühendisliği bölmeyi oluşturmak için genel bir kılavuz sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada anlatılan protokoller Vincent Hastanesi Melbourne, Avustralya Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmış, ve Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi Yönergeleri sıkı sıkıya bağlı kalmanın altında gerçekleştirilmiştir.
Not: iki odacık protokolleri aşağıda açıklanmıştır. İki farklı model ve özel bölme tasarımı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Oda (1) (Fare Arterdamar döngüsü bölmesi modeli için) polikarbonattan yapılmıştır. Bu bir iç çapı 13 mm ve yüksekliği 4 mm olan bir silindirdir. duvardaki bir noktada bir pencere pedikül için engelsiz erişim sağlar. (Sıçan akışı-through pedikül odası modeli için) İkinci modelde ise, oda poliakrilik yapılmış ve (10 x 8 x 4 mm 3 iç boyutları) dikdörtgen mesafesindedir. Bunların bölme aşmak femoral arter ve ven karşılamak için karşılıklı yanları üzerinde iki adet 1,5 mm'lik deliklere sahiptir.
1. Sıçan Arteriovenöz Döngü Odası Modeli (Tek Chamber Başına Hayvan)
NOT: cerrahi başlamadan önce, tüm enstrümanlar düzgün sterilize edilmiştir emin olun. Aynı şekilde, steril havlu aletleri dinlenme sağlamak ve işlem sırasında kirlenmesini önlemek için cerrahi alanında makul bir mesafede bulunmaktadır.
- Cerrahi Animal hazırlanması
- arteriovenöz döngüsünün oluşturulması için damarların büyük boyutları için en az 250 g ağırlığındaki sıçanlar kullanın.
- % 4 izofluran inhalasyonu ile hayvan Anesteziyoloji. ayak-tutam yanıtsızlık değerlendirerek anestezi yeterli derinlikte desteklemektedir. Anestezi sonra, yeterince% 2 izofluran ile işlem boyunca anestezi hayvan tutun.
- Bir ısınma pad üzerinde bir yatar pozisyonda hayvan yerleştirin ve ameliyat sırasında kuruma önlemek için gözlere steril yağlayıcı uygulayın.
- Bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak, hem Kasiklari tıraş ve nemli bir gazlı bez parçası ile saç kaldırmak.
- klorheksidin cerrahi sitesi hazırlayın/% 70 etanol çözeltisi ve steril havlu ile hayvan örtün. analjezik olarak karprofen tek bir doz (5 mg / kg, deri altına) uygulayınız.
- Femoral Ven Greft Harvest
- Bir 15. bıçak kullanarak, inguinal ligament sol kasık paralel bir 4 cm uzunluğunda cilt kesi yapmak. Bu kasık yağ yastığı ortaya çıkarır.
- makas o epigastrik damarların dayalı vasküler pedikül bağlı bırakarak çevresel yağ yastığı ile kesti.
- Mikro makas kullanarak, karın duvarı ve altta yatan femoral damarların arasındaki incecik bağ dokusu yapışıklıklar serbest.
- Karın duvarında retractor yerleştirin ve mediale doğru çekin. Bu inguinal ligament ve femoral damarların tüm uzunluğu ortaya çıkarır.
- Mikro forseps kullanarak ve kavisli makas hafifçe çekerek ve kesme ile epigastrik ven incelemek ve onun çevresindeki yağ onu izole. döngü oluşturarak zaman bu damar bir urgan gibi davranır.
- Çg mikro forseps ve kavisli mikro makas femur damarları ve sinir epigastrik şubesine kendi çatallanma distaline inguinal ligament tüm yol içeren perivasküler kılıf açın.
- Mikro forseps kullanarak kendi adventisya tarafından femoral ven pick up ve yavaşça çevre dokulardan ayırmak ve arter eşlik. Mikro forseps ve birbirinden doku çekerek ve bunun üzerinden keserek kavisli yuvarlak sivri mikro makas ile yapın.
NOT: Bu tromboz o eğilimli hale intima travma neden olabilir olarak damar duvarının tüm kalınlığını kapmak asla. - Ligate yan dalları 10/0 naylon sütür ile diseksiyon sırasında bulunan veya iki kutuplu bir pıhtılaştırıcı ile koagüle.
- femoral ven tamamen ücretsiz, 4/0 ipek sütür ile proksimal ve distal uçlarını Arter. en az 10 mm uzunluğunda bir damar grefti elde etmek için emin olun ve yaklaşık epigastrik dalının 0.5 cm uzunluğunda bir adam halat sabrının olarak kullanılmak üzere dahilodasında açık döngü tutun.
- Mikro forseps ve düz mikro makas kullanarak, hafifçe çekerek ve keserek greft uçlarından adventisya kırpın. Bu aynı zamanda mikrocerrahi anastomozlar önce, daha sonra yapılabilir.
- heparinize tuzlu su çözeltisi (heparin 10 U / ml) ile ven greft yıkayın ve çözelti içinde dinlenmeye bırakın. Sürekli çalışan 4/0 ipek sütür artı iki veya üç ek basit kesintiye dikiş kullanarak yarayı kapatmak.
- Odası Arteriovenöz Döngü ve İmplantasyonu oluşturulması
- Tekrarlayın kontralateral bacak üzerinde aynı şekilde 1.2.4 için 1.2.1 adımları.
- Mikro forseps kullanarak, incelemek ve epigastrik arter hem izole ve çevresindeki yağ yastığı oluşturur ven. yavaşça gemilerin uzak doku çekerek bunu
- Mikro forseps kullanarak, çevre dokulardan femoral onun adventisya tarafından arter ve ücretsiz pick up. Mikro forseps ve kavisli yuvarlak uçlu mikrofon ile bunubirbirinden doku çekerek ve bunun üzerinden keserek ro makas. Arter veya yan dalları koagüle.
- femoral arter bağlanır ve 4/0 ipek sütür ile epigastrik damarların ortaya çıkmasına uzak ven.
- femoral arter ve ven her birinde proksimal tek kelepçe yerleştirin. keskin bir düz mikro makas kullanılarak, epigastrik dalları ortaya çıkması her gemi distalinde kesilmiş temiz bir çapraz yapmak. gemilerin altında steril plastik kontrast arka plan yerleştirin.
- Tüm kan lümeni kaldırılana kadar heparinize salin cömert miktarda şiddetle gemileri yıkayın.
- operatif alana ven grefti getirin ve gerekirse adım 1.2.10 göre gemilerin uçlarından herhangi gereksiz adventisya kaldırın.
- 10/0 naylon sütür ile hem mikrocerrahi anastomoz yaparlar. femoral ven ve femoral arter distal ucuna ven grefti proksimal ucunu anastomoz. Bu f kan akmasına izin verecekven greft içinde vanalar direniş olmadan venöz tarafına arteriyel rom.
NOT: herhangi bir bükülme olmadan femur damarları ve doğal bir pozisyonda ven greft dinlenme emin olun. - anastomoz sitelerde hem de sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Üstte yağ küçük bir parça yerleştirerek ve yavaşça 5-10 dakika sıkıştırarak kan anastomoz çıkan olmayan titreşimli benzeyen küçük sızıntıları çözmek. Hızla tüm alan sel büyük zonklayan sızıntı ek dikiş gerekir.
- arteriovenöz döngü açıklığını kontrol edin. femoral arterin nazik tıkanma femoral ven aynı o engorge gerekir iken küçültmek yapmak gerekir.
- katlanmış veya kırıksız doğal pozisyonunda ikinci dinlenme ile arteriovenöz döngü altında doku mühendisliği odasının tabanını yerleştirin.
- 6/0 naylon sütür ile inguinal ligament ve altta yatan kas fasya odanın tabanını sabitleyin.
- üzerinde kapak yerleştirinBaz femoral damarlar (odanın yan pencere) bir çentik içinden odasına girmek böylece. Kapağı kapatırken, bu bariyerler yerine arteriovenöz döngü tutmak için görevi odasının tabanı ve kapak arasında, epigastrik dalları yakalar emin olun.
- Sürekli çalışan 4/0 ipek sütür artı iki veya üç ek basit kesintiye dikiş kullanarak yarayı kapatmak.
- hayvan ısınma pad üzerinde anestezi kurtarmak için izin verin.
- sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar sahipsiz hayvan bırakmayın. Aynı şekilde, tamamen iyileşti kadar diğer hayvanların şirkete ameliyat geçirmiş bir hayvan dönmez. 24 saat sonra, analjezik olarak karprofen diğer tek doz (5 mg / kg, deri altına) tatbik.
- 5 gün boyunca topikal antibiyotik merhem yara davranın. yara açılırsa, 1.1.5 ile adım 1.1.2 deki gibi hayvan uyutmak ve 1.3 olarak yarayı kapatmak0,14. günlük hayvan sağlığını izlemek. Hayvan inacitivity, iştahsızlık, kilo kaybı ve renk kaybından birden fazla orta belirtileri gösterirse (23 G iğne ile 0.25 ml 163 mg / kg) periton içine lethabarb enjeksiyon öldürücü bir doz ile hayvan öldürülür.
2. Flow-through Pedikül Odası (Animal başına iki Chambers)
- Cerrahi Animal hazırlanması
- Tekrarlayın 1.1.4 ile 1.1.1 adımları. İki oda, bir tek sıçan iki kasık bölgelerine implante edilebilir.
- Femoral Gemiler izolasyonu ve Odası Yerleştirme
- Tekrarlayın 1.2.8 ile 1.2.1 adımları.
- arter ve tamamen çevre dokulara ve dalları bağlandı kurtulan ven hem operatif alana odasına getirin.
- bölme tabanı herhangi bir bükülme veya kıvrımlar vardır emin karşılık gelen yarık üzerinde sağlam femoral damarların her koyun.
- attachi odacığı kapatıntabanına kapağı ng. Sürekli çalışan 4/0 ipek sütür artı iki veya üç ek basit kesintiye dikiş kullanarak yarayı kapatmak ve hayvan daha önce açıklandığı gibi kurtarmak için izin verir.
Türkiye Odalar ve Doku İşleme 3. Hasat
- Deneyin zaman noktalarında (4-6 hafta sonrası implantasyon) ulaşıldığında sonra, adım 1.1.2 deki gibi hayvan uyutmak ve 1.1.5 arasındaki adımları 1.1.3 tekrarlayın.
- Bir 15. bıçak kullanarak yara açın ve bölme tamamen maruz kadar makasla dokular kesti.
- sonra distal yönde kan süt, hafifçe iki mikroforcepslerle damarını tıkamak ve nihayet yakın forseps serbest: damar açıklığı için yapı ve test etmek için proksimal femoral damarlar Açığa. Tekne tekrar kanla dolarsa, bu açıklık doğruluyor. th durumunda hem proksimal ve distale arteriovenöz döngü halinde proksimale femoral damarlar ligateE akış yapılandırma ve en blok içeren doku ile odaları kaldırın.
- Deneyin sonunda, (23 G iğne ile 0.25 ml 163 mg / kg) periton içine lethobarb enjeksiyon öldürücü bir doz ile hayvan euthanize.
- 24 saat için oda sıcaklığında% 4 paraformaldehid içinde dokuların düzeltildi. (1-2 mm kalınlıkta) sırasıyla, parafin mumu ya da uygun kesme ısısı bileşiği parafin kesitler (5 um) veya dondurulmuş bölümleri (10 um) yerleştirmek, çok sayıda enine bölüme bölünür dokular. 3,4,8,17,22, 24
- Dokuların genel morfolojisi incelemek için böyle bir hematoksilen ve eozin gibi rutin histolojik boyama yapın. Kardiyomiyositlere için örnek cTnT'nin immün için ilgi hücre tipini, 3,4,8,17,22,24,29 tanımlamak için spesifik antikor ile immunohistokimyasal boyama yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda protokolde tarif edildiği gibi doku mühendisliği odaları mikrocerrahi oluşturma uygulandı. Odaları içinde oluşturulan Dokular 3. Çeşitli doku tipleri başarıyla in vivo vaskülarize odasını (Şekil 2) kullanılarak tasarlanmış olan protokol adımında tarif histolojik olarak incelenebilir. Bu yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde (Şekil 2A), adipoz doku, hücre dışı matris (Şekil 2C) elde edilen hidrojel sıçan iskelet miyoblastların (Şekil 2B) ve yağ dokusunda kas dokusu ile kardiyak doku içerir.
Dokuların morfometrik değerlendirmesini stereo Araştırmacı sistemi veya ImageJ yazılım ile ya gerçekleştirilebilir. Çeşitli doku bölümlerinin niteliksel değerlendirilmesine ek olarak 3,4,8,17,22,29, stereoloji sistemi quanti tarafsız sağlarspesifik doku hacminin Sınıflamasına. Örneğin, lektin (kemirgen endotel hücreleri için bir işaret) enine kesiti (Şekil 3) stereoloji sistemi ile görüntü mikroskopi kullanılarak hasat doku yapılarının vasküler hacmini tahmin etmek için kullanılabilir boyandı. Benzer miktar yöntemleri diğer doku tiplerinin hacmi değerlendirmek için uygulanabilir.
Doku mühendisliği odaları da in vivo implantasyonu aşağıdaki hücre kaderi izlemek için kullanılabilir. Hücreler, örneğin DII, PKH26 veya implantasyondan önce kuantum noktaları gibi floresan boyalar ile ön-etiketlenebilir. Örneğin, DII önceden etiketlenmiş yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde 3 günlük implantasyon sonrası (Şekil 4A) hasat doku yapıları tespit edilebilir. Biz de başarıyla kadar 4 hafta sonrası implantasyon için DII önceden etiketlenmiş olan implante hücreleri izlenir var. Alternatif olarak, türe-özgü antikorlar i için kullanılabilirksenonakli çalışmalarında implante edilmiş hücreler tarafından dentify. Örneğin, immün yetmezlik sıçanlarda doku mühendisliği odası içinde implante edilmiş insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin insana özgü KU80 antikor (Şekil 4B) ile birlikte immün hasat doku yapıları tespit edilebilir.
Şekil 1: in vivo vaskülarize odası ile kardiyak doku mühendisliği arteriovenöz döngü odası modeli ve akış pedikül odası modeli ile ıntrinsic vaskülarizasyon yaklaşımı.. Chambers, polikarbonat ya da poliakrilik ya da yapılmıştır, bu malzeme, in vivo olmayan enflamatuar ve toksik olmaması için test edildi. Ölçek çubuğu = 5 mm. 30 izniyle. Baskılı Re Plea se, bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2:. Yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde in vivo vaskülarize odalarından mühendislik dokular (A) Kalp dokusu. Kardiyomiyositlerde cTnT'nin antikor (kahverengi) ile boyama yapıldı. Sıçan iskelet iskelet hücreleri ile (B) Kas dokusu. Kas hücreleri desmin antikoru (kahverengi) ile boyama yapıldı. Adipoz doku, hücre dışı matris elde edilen bir hidrojel olan (C) yağ dokusu. 31 hematoksilen ve eozin boyama. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/files/ftp_upload/54099/54099fig3.jpg "/>
Şekil 3: implantasyon sonrası 4 hafta hasat bir doku yapılarının kanlanmasını lektin-boyanan kesitler Temsilcisi görüntüler.. Femoral arter (*) çimlenme kan damarları lektin (kahverengi) ile işaretlendi. Ölçek çubuğu = 200 (solda) um ve 100 mikron (sağda). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Doku yapılarında nakledilen hücrelerin tanımlanması (A) DII etiketli yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerde (kırmızı ve beyaz oklar) implantasyon sonrası 3 günde hasat sıçan dokusu yapısında. (B) bir fare Tissu'dan hasat doku yapısının bir temsili insana özgü KU80 lekeli histoloji resmiE mühendislik odası implantasyon sonrası 28 günde insan uyarılmış pluripotent kök hücreleri ile implante. İnsan çekirdekler insan hücreleri reddini önlemek için immüno-etiketli kahverengi immün yetmezlik sıçan kullanıldı edildi. Ölçek çubuğu = 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mikrosirkülasyonun Mühendislik anda iki yaklaşımlarla esasen araştırılmaktadır. Implante edildiğinde, böylece ilk konak vasküler yataktan kılcal damarlar olanlar ile bağlantı, in vitro yapı içinde son derece birbirine damar ağı geliştirme içerir ve böylece besinlerin teslimat sağlanması, bir süreç olarak adlandırılan kaynaştırma yoluyla inşa nakledilen sadece çevresine değil Ayrıca, çekirdek. 21,32,33 Bu ön-vaskülarizasyon olarak adlandırılır. Bu kılcal filizlenmesi önce veya eş zamanlı olarak implante hücre farklılaşmasının ve doku büyümesi ile herhangi biri meydana böylece ikinci yaklaşım, in vivo doğrudan ev sahibinin kendi damarsal geliştirmek için çalışır. 17,34
Burada sunulan in vivo doku mühendisliği odası protokolü bir arter ve bir damar yerleştirerek ikinci kavram yararlanan, ya bir arteriovenöz döngü veya bir akış pedikül yapılandırma olarak,zaman içinde önemli filizlenme ve yeni kılcal damarların oluşumunu sağlayan bir korunmuş boş alan içinde odasının 3 avantajları, (1), in vitro manipülasyon olmaması.; (2) ev sahibi tarafından reddedildi olmayacak tamamen otolog damar ağının oluşumu; ve iskemi eğilimli inşa render 1 ila 7 gün arasında sürebilir bir kaynaştırma dönemi ihtiyacı olmadığını (3) gerçeği. 35,36
Bununla birlikte, implante dokusu zayıf tedarik edildiği bir dönem ortaya çimlenme önemli bir kılcal boru için yaklaşık 3-7 gün sürer olduğunu belirtmek gerekir. Bölme kez 3 Gecikmeli hücre implantasyonu yeterli aslında geliştirilmiş hayatta göstermiştir damarlıdır. 17 bir başka avantajı biyo-uyumluluk ve Odaların malzemenin olmayan bağışıklık (örneğin polikarbonat ve poliakrilik) içerir. Buna ek olarak, rijit olmayan katlanabilir chamber doku ve birleştirme ve aksi takdirde genişleme engel ve yeni oluşan doku hasat zor kılacak çevresini, ile entegre olmadan büyümeye damarsal için korumalı bir alan sağlar. Buna karşın bir, odalar kapalı olması doku büyümesini sınırlayabilir. Ancak bu, hemen kapalı bir daha etkili bir şekilde doku büyümesi gösterilmiştir delikli bir bölme kullanan arteriovenöz köprüsü modelinde, ele alınmıştır. 37
Burada sunulan doku mühendisliği odası protokolleri son derece tekrarlanabilir ancak odaları nadiren genellikle yaklaşık% 70 kapasite, tamamlanma dolgu olduğu vurgulanmalıdır. Tutarlı sonuçlar bazı kritik adımlar ve teknik konular dikkate alınır şartıyla elde edilir. kan damarları ile çalışırken Pedikül açıklığı mikrocerrahi anastomoz yapılır, özellikle nihai amaçtır. Biz sürekli hiçbir doku Vasc eğer büyür buldukular pedikül trombozları erken post-cerrahi. açıklığını etkileyen faktörler genel olarak dört kategoriye, yani cerrahi teknik, kan akımı, tromboz ve spazm halinde gruplandırılmış olabilir.
İlk olarak, hassas bir cerrahi teknik başarının anahtarıdır. Bu anlamda, bu işlemler, bir arteriovenöz döngü oluşturulmasını kapsayan, özellikle bir kişi, aşağıdaki cansız modellerinde ve daha sonra sıçan femoral damarların ilk uygulayarak elde edilebilir cerrahi tecrübeli belirli bir düzeyde ihtiyaç unutulmamalıdır ilke ve teknikleri burada ve başka yerlerde nitelendirdi. damar duvarında, özellikle intima 38 Hasar, kaçınılması gereken her zaman asla akılcı, germe aşırı önlenmesi, damar duvarının tam kalınlığını kapma içeren gemilerin uygun taşıma ile bipolar pıhtılaştırıcı kullanımı ve arteriovenöz döngü halinde, titiz ve atravmatik mikrocerrahi anastomoz performansı. heparinli serum fizyolojik ile yıkama pıhtılaşmayı önler rağmen, ince cerrahi tekniği yerini asla. İkincisi, kan akımı faktörleri esas türbülansa ve durağanlık ile ilgilidir. katlanmış sekonder türbülanslı akış, eğilir ya da gemilerin karışıklığı trombus oluşumunu hızlandırır. Bu nedenle düzene sınırsız akış arteriovenöz döngüsü ve akış modelleri hem de sağlanmalıdır. Bu anlamda, arteriovenöz döngü modelinde epigastrik şube bağlama etkisi bükme önlemek için gereklidir; Herhangi bir nedenle, bu dal kullanılamaz eğer çevre dokulara damar duvarı basit 10/0 naylon dikiş dikkatle yerine konulmalıdır. arteriovenöz döngü işlemi sırasında anastomoz yerinde statik kan da büyük oranda trombojeniktir ve önce ve anastomoz boyunca heparinli serum fizyolojik ile kuvvetlice gemi püskürtülerek önlenmelidir. Böyle ameliyat alanında ve en importa gelen kirletici olarak Üçüncüsü, pro-trombotik faktörlerntly anastomoz içinde adventisyasında parçalarının varlığı kaçınılması gereken vardır. gemi hazırlanması mikrocerrahi sütür ve arteriovenöz döngü oluştururken dikkate düzenli olarak temizlenerek temiz önemli yönlerini alanını ve anastomoz edilir tutmak doğru önce biter. Son ama en az, damar spazmı sorunu vardır. damar spazmı patofizyolojisi tam açıklanamamıştır olsa da, hem lokal hem de sistemik faktörler nedeniyle olması muhtemeldir. Lokal faktörler damar yaralanması, ameliyat alanını ve doku kuruma kan varlığı bulunmaktadır. Diğer yandan, düşük çekirdek sıcaklığı, hipotansiyon ve ağrı sempatik yanıt içermektedir sistemik faktörler. 38
Böylece, hem arteriovenöz döngü ve akış modelleri, uygun taşıma ve hassas bir cerrahi teknik ile birlikte hayvanın hazırlanmasında yadsınamaz. spazm gidermek için Stratejiler ılık serum fizyolojik veya sulandırılmamış ile sulama dahil% 1 xylocaine ve 5-10 dakika bir dinlenme süresine sahip. Gemi dilatasyon ve adventisyanın sıyırma nedeniyle de yerel sempatektomi etkisi spazmını çözmek yardımcı olabilir. 38 mikrocerrahi anastomoz ve ima teknik meydan gerçekleştirmek için ihtiyaç aşmak için, manşet tekniği başka bir yerde anlatıldığı gibi istihdam edilebilirler. 39 Bu teknik oluşur geminin birini ekleyerek bir manşet haline biter ve bunu tersine çevrilmesi ve çevresel 6/0 naylon sütür ile sabitleyin. Daha sonra, başka bir kap ucu manşonun üzerine geçirilen ve benzer bir şekilde sabitlenir.
Doku mühendisliği odası deneysel araştırma olanakları yeni bir pencere açtı ve sürekli bir potansiyel klinik amaca yönelik ilerlemektedir. Şimdiye kadar, burada sunulan model farklı soy dokularının üretilmesi için esas olarak kullanılmaktadır. 4,7,8,17,22, 24,25,27-29,37,40 Yine de, bir dizi var diğer potansiyel uygulamaları. Örneğin, haİnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin implantasyonu sonrası teratom oluşumu için etkili ve nispeten hızlı bir model olarak akış odası kullandım. 41,42 Bu durumda, bu yaklaşım, tümörsüz doku mühendisliği elde etmek için bir "Kalite Kontrol" aracı olarak kullanılabilmektedir pluripotent kök hücreleri ile. Ayrıca, ilaç toksikoloji çalışmaları odasının içine yetiştirilen insan dokularında araştırılabilir. Aynı şekilde, patolojik doku nesil hastalığı modelleme ve uyuşturucu testi doğru ilginç bir yaklaşım verim verebilir. Son olarak, doku mühendisliği bölmesi de in vivo olarak, hücre kaderin dokunun büyümesini ve izleme çalışması için potansiyel bir model haline gelebilir.
Sonuç olarak, iki farklı yaklaşımlar ile hayvanlarda deri altı odasının yerleşimi kapsayan bir protokol tanımlanmıştır: Bir mikrocerrahi arteriovenöz döngü ya da bir flow-through pedikül yapılandırma kullanarak. teknik yüksek tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçlar verir. Kullanımı hBugüne kadar doku mühendisliği alanında ağırlıklı olarak istismar edilmiş, ancak, bu odalar büyük bir uygulama olabilir ki diğer potansiyel araştırma alanları vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma NHMRC ve Stafford Fox Tıp Vakfı hibe finansmanı tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos ve Deneysel Tıp Amanda Rixon ve Cerrahi Ünitesi, St. Vincent Hastanesi, Melbourne cerrahi yardım kabul. Destek ayrıca Yenilik, Sanayi Victoria Eyalet Hükümeti'nin Bakanlığı ve Bölgesel Kalkınma Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından sağlanmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors - Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors - Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5,000 UI/ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/ml |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/ml |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/ml |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/ml |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
| Lethabarb (sodium pentobarbitone) |  Virbac Animal Health |
LETHA450 | 325 mg/ml |
| Heat pad flexible | Redzone Heating |
RZ/Medium |
References
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al.
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M.
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
