Abstract
재건 수술에서, 서로에 대한 복잡하고 비용이 많이 드는 무역 하나의 결함있는자가 재건의 현재의 방법에 대한 대안에 대한 임상이 필요하다. 조직 공학이 수요 증가를 해결하기 위해 약속을 보유하고있다. 그러나, 대부분의 조직 공학 전략 인해 열악한 혈관 안정 기능적 조직 대체물을 생성하지 못한다. 본 논문은 관류 동맥과 정맥 중 하나 동정맥 루프 또는 흐름을 통해 척추 경 구성으로는 보호 중공 챔버 내부 지향 내장 혈관의 생체 조직 공학 챔버 모델에 초점을 맞추고있다. 이 챔버 기반 시스템에서 혈관 신생 발아는 동정맥 혈관에서 발생하고,이 시스템은 점차적으로 석면 혈관 조직과 챔버 공간을 채우고 구동 허혈성 염증 내생 세포 이동을 끈다. 외인성 세포 / 챔버 구축시에 매트릭스 주입 셀 SUR 향상천공되지 및 개발하는 엔지니어링 조직의 특이성을 결정한다. 우리의 연구는 이러한 챔버 모델이 성공적 지방, 심장 근육, 간 등의 다른 조직을 생성 할 수 있다는 것을 보여 주었다. 그러나, 수정 및 개선이 형성이 일관되고 재현 표적 조직을 보장하기 위해 필요합니다. 이 문서는 생체 내에서 두 개의 서로 다른 혈관 조직 공학 챔버 모델의 제조를위한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
재생 의학의 새로운 패러다임은 조직 공학 방법을 사용하여 기능 혈관 조직입니다 제조. 1,2 많은 방법을 손상된 조직이나 결함이있는 장기의 교체를 위해 새롭고 건강한 조직을 설계하는 것은, 3-6 실험적으로 작은 동물 모델을 개발되었다 유망한 임상 잠재력. 7,8 그러나, 혈관이 임상 적 크기의 조직을 성장 잠재력을 제한하는 조직 공학에 대한 큰 과제 중 하나 남아있다. (9)
현재 접근 방식은 새로운 혈관이받는 혈관 침대에서 성장 곳 외인성 경로를 따라 조직을 vascularize와 이식 된 조직이 10 혈관이 성장하고 새로 개발 조직과 한마음으로 확장 고유 혈관 통로를 구축을 통해 침입합니다. (11)를 외부 접근 전통적으로 지지체 상에 파종 세포를 포함시험관과 영양분은 이전 배지에 의해 공급되는 기대와 살아있는 동물에 완전한 구조를 주입에 혈관 내 증식이 너무 느리고 매우 얇은 임플란트 (AS 12,13 개념은 단순하다. 순환로부터 공급 <될 1-2mm 두께는) 가능한 유지됩니다. 충분한 신속한 혈관을 통해 영양분과 산소를 제공하는 것은 뼈, 근육, 지방, 고체 기관으로 더 복잡하고 더 큰 조직 공학적 대체를 성장하는 성공적인 시도의 핵심입니다. 14, 15 내장 혈관이의 가능성을 제공합니다 더 큰 구조는 확대 혈액 공급에 상응하는 진보적 조직 성장에 의해 개발. 하나의 디자인 또는 셀 시드 발판없이 혈관 유경의 챔버에 생체 주입입니다.이 두꺼운 본질적으로 혈관 조직의 생성을위한 새로운 절차에 도로를 포장하고있다 5,6. 16, 17 </ P>
최근 전략 이식하기 전에 조직 이식, - vascularize 미리 개발되었다. 이러한 통합 혈관 네트워크는 이식 두꺼운 조직 이식편의 모든 부분의 생존을 향상시키기 위해 전체 혈액 공급의 신속한 공급을 허용 주입시에 호스트 용기에 접합하다보고자한다. 18
우리는 관류 척추 경 혈관 세포 함유 생체 물질을 함유하는 피하 주입 된 반 강성 밀폐 챔버를 포함 작은 동물에서 생체 내 혈관 조직 공학 모델을 개척했다. 챔버는 이식 된 혈관에서 혈관 신생 발아를 자극 허혈성 환경을 만듭니다. 3 혈관 척추 경을 재구성 동정맥 루프 또는 손상 흐름을 통해 동맥과 정맥이 될 수 있습니다. 3-6,19이 혈관 척추 경 콩나물 기능과 광범위한 동맥의를 모두 예술에 연결 -capillary 정맥 네트워크eriole 정맥의 혈관 척추 경으로 끝난다. 3,20를 또한 둘러싸는 중공지지 챔버 혈관 생성을 향상시키기 위해. 3,21,22을 혈관 척추 경 간단히 주입되면 잠재적으로 기계적 힘을 변형되는 현상 조직을 보호하고 허혈성 드라이브 길어 정상 조직이 아닌 상기 챔버의 내부 공간에 보호, 혈관 발아는 정상 상처 척추 경 주위에 축적한다 새로운 조직과 같은 타임 라인을 따라 중단. 연구자들은 임상 관련 크기의 지원 혈관 3 차원 기능 혈관 조직 구조를 생산하는이 생체 구성을 사용하고 있습니다. 4,23는 또한 그것의 본래 혈관 척추 경으로 설계 혈관 조직 구조가 부상 사이트에서 후속 이식 수확 할 수있다 .보다 임상 적으로 가능한 시나리오는 재건의에 대한 확실한 사이트에서 실을 만드는 것 (24, 25)가슴으로 UCH. 따라서,이 새로이 조직 공학 방법은 재건 수술에 대한 기능적 대상 조직의 새로운 소스를 제공하기 위해 임상 적 잠재력을 가질 수있다. 26-28
다음 프로토콜은 상이한 동물 모델에서 적응 혈관 행렬 생성 및 세포 이동과 분화의 복잡한 과정을 조사하기 위해 이용 될 수있는 래트에서 생체 내 혈관 조직 공학 챔버를 구성하는 일반적인 지침을 제공 할 것이다.
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Protocol
여기에 설명 된 프로토콜은 세인트 빈센트 병원 멜버른, 호주의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었으며, 호주 국립 보건 의료 연구위원회 가이드 라인을 엄격하게 준수에 따라 실시 하였다.
참고 : 두 개의 챔버 프로토콜이 아래에 설명되어 있습니다. 두 가지 모델과 특정 실 디자인은도 1에 도시된다. 챔버 (1) (래트 동정맥 루프 챔버 모델) 폴리 카보네이트로 제조된다. 그것은 내부 직경 13mm, 높이 4mm 원통형이다. 벽에 한 지점에서의 창은 척추 경에 대한 방해받지 않고 액세스 할 수 있습니다. (쥐 관류 척추 경 챔버 모델) 제 모델에서, 챔버는 폴리 이루어지고, (10 × 8 × 4mm 3 내부 치수) 사각형이다. 그들이 챔버 범으로 대퇴 동맥 및 정맥을 수용하기 위해 양측에 두 개의 1.5 mm의 개구부를 갖는다.
1. 쥐 동정맥 루프 회의소 모델 (한 참BER 당 동물)
참고 : 수술을 시작하기 전에, 모든 악기가 제대로 살균되어 있는지 확인합니다. 마찬가지로, 멸균 수건 악기 받침대를 확인하고 절차를 수행하는 동안 오염을 방지하기 위해 수술 분야에서 적당한 거리에있다.
- 수술에 대한 동물의 준비
- 동정맥 루프의 창조를위한 선박의 그들의 큰 크기에 최소 250g의 무게 쥐를 사용합니다.
- 4 % 이소 플루 란 흡입과 동물을 마취. 발가락 핀치에 응답하지 않는 문제를 평가하여 마취의 적절한 깊이를 확증. 마취 후, 충분히 2 % 이소 플루 란과 절차 전반에 걸쳐 마취 동물을 유지합니다.
- 온난화 패드에 부정사 위치에 동물을 배치하고 수술 중 탈수를 방지하기 위해 눈에 멸균 윤활제를 적용합니다.
- 전기 면도기를 사용하여, 두 사타구니 면도 촉촉한 거즈 조각으로 머리를 제거합니다.
- 클로르헥시딘과 수술 사이트를 준비/ 70 % 에탄올 용액 및 멸균 수건 동물 드레이프. 진통제로 카프로 펜의 단일 용량 (5 ㎎ / ㎏, 피하)를 관리 할 수 있습니다.
- 대퇴 정맥 이식의 수확
- A # (15) 블레이드를 사용하여, 사타구니 인대에 왼쪽 사타구니 평행에 4cm 길이의 피부 절개를합니다. 이 사타구니 지방 패드를 노출합니다.
- 가위는 상복부의 선박에 따라 혈관 척추 경에 부착 떠나와 원주 지방 패드를 통해 절단.
- 마이크로 가위를 사용하여 복벽 및 하부 대퇴 혈관의 필름 상 결합 조직 유착 해방.
- 복부 벽에 트랙터를 놓고 내측 당깁니다. 이 사타구니 인대와 대퇴 혈관의 전체 길이를 노출합니다.
- 마이크로 집게를 사용하여 곡선 가위 부드럽게 당겨 및 절단하여 상복부 정맥을 해부와 그 주변 지방에서 격리. 루프를 구성 할 때이 정맥은 밧줄 역할을합니다.
- 날기g 마이크로 집게 곡선 마이크로 가위는 대퇴 혈관과 신경 상복부 분기에 그 분기의 말단에 사타구니 인대에서 모든 방법을 포함하는 혈관 주위 덮개를 엽니 다.
- 마이크로 집게를 사용하여 외막에 의해 대퇴 정맥을 선택하고 조심스럽게 주위 조직에서 분리하고 동맥을 동반. 마이크로 집게와 떨어져 조직을 당겨 그것을 통해 절단에 의해 곡선 라운드 지적 마이크로 가위로이 작업을 수행합니다.
참고 :이 혈전증에이 경향이 만드는 내막에 외상이 발생할 수 있습니다 정맥 벽의 전체 두께를 잡아하지 마십시오. - 결찰 측 분기 10/0 나일론 봉합사와 절개 중에 발견 또는 바이폴라 coagulator로 응고.
- 대퇴 정맥 완전 무료로, 4/0 실크 봉합사와의 근위 및 원위 끝을 결찰. 적어도 10mm 길이의 정맥 이식을 얻을 수 있는지 확인하고 약 상복부 분기의 0.5 cm 길이가 남자 로프 밧줄로 사용할 수 포함챔버의 개방 루프를 개최합니다.
- 마이크로 집게 똑바로 마이크로 가위를 사용하여 부드럽게 당겨 절단하여 이식의 끝에서 외막 트림. 이것은 또한 미세 수술 문합 전에 나중에 수행 될 수있다.
- 헤파린 생리 식염수 (헤파린의 10 U / ㎖)와 정맥 이식을 세척하고, 용액에서 휴식을 둡니다. 지속적인 실행을 4/0 실크 봉합사 플러스 두 개 또는 세 개의 추가 간단한 중단 바늘을 사용하여 상처를 닫습니다.
- 상공 회의소의 동정맥 루프 및 주입의 창조
- 반복 반대쪽 다리에 동일한 방식으로 1.2.4에 1.2.1 단계를 반복합니다.
- 마이크로 집게를 사용하여, 해부 및 상복부 동맥을 모두 분리하고 주변의 지방 패드를 형성 정 맥. 부드럽게 혈관에서 떨어져 조직을 당겨이 작업을 수행
- 마이크로 집게를 사용하여 주변 조직에서 대퇴의 외막에 의해 동맥과 무료 픽업. 마이크로 집게 및 곡선 라운드 지적 마이크와 함께이 작업을 수행떨어져 조직을 당겨 그것을 통해 절단에 의해 RO 위입니다. 결찰 또는 옆으로 가지를 응고.
- 대퇴부 동맥을 결찰 및 4/0 실크 봉합사를 이용하여 상복부 혈관의 출현 말초 정맥.
- 대퇴 동맥과 정맥의 각 근위 하나의 클램프를 놓습니다. 날카로운 직선 마이크로 가위를 사용하여, 상복부 가지의 출현에 각 혈관 원위부 절단 깨끗한 가로을합니다. 선박에서 멸균 플라스틱 대비 배경을 놓습니다.
- 모든 혈액이 루멘에서 제거 될 때까지 헤파린 생리 식염수의 관대 한 양 적극적으로 혈관을 플래시합니다.
- 수술 필드에 정맥 이식을 가져와 필요한 경우, 단계 1.2.10에 따라 선박 '끝에서 어떤 여분의 외막을 제거합니다.
- 10/0 나일론 봉합사와 두 미세 수술 문합을 수행합니다. 대퇴 정맥과 대퇴 동맥에 선단 정맥 이식편의 기단부를 문합. 이 F 피가 흐를 수 있습니다정맥 이식 내 밸브에서 저항없이 정맥 측에 동맥을 ROM.
참고 : 어떤 왜곡없이 대퇴 혈관과 자연 위치에있는 정맥 이식의 나머지 부분을 확인합니다. - 문합 부위 모두에서 누수가 있는지 확인합니다. , 상단에 지방의 작은 조각을 배치하고 부드럽게 5 ~ 10 분 동안 압축하여 혈액이 문합 부위에서 나오는 비 맥동처럼 작은 누수를 해결합니다. 빠르게 전체 필드 홍수 큰 맥동 누수 추가 바늘이 필요합니다.
- 동정맥 루프의 개통을 확인합니다. 대퇴 동맥의 부드러운 폐색은 대퇴 정맥에서 같은 그것을 충혈해야하면서 축소해야한다.
- 왜곡 또는 꼬임이없는 자연 위치에 후자의 휴식과 동정맥 루프 아래의 조직 공학 챔버의 기초를 놓으십시오.
- 6/0 나일론 봉합사와 사타구니 인대 및 기본 근육의 근막에 챔버의베이스를 고정합니다.
- 오버 덮개를 놓습니다기본 대퇴 혈관 (챔버의 측면에 창) 노치 (notch)를 통해 챔버를 입력 있도록. 뚜껑을 닫을 때, 테더가 위치로 동정맥 루프를 유지하는 역할을 챔버 기지와 뚜껑 사이 상복부 지점을 포착해야합니다.
- 지속적인 실행을 4/0 실크 봉합사 플러스 두 개 또는 세 개의 추가 간단한 중단 바늘을 사용하여 상처를 닫습니다.
- 동물이 온난 패드에 마취에서 회복 할 수 있습니다.
- 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 마찬가지로, 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. 24 시간 후, 진통제 등의 카프로 펜의 또 다른 하나의 용량 (5 ㎎ / ㎏, 피하)를 관리 할 수 있습니다.
- 5 일간 국소 항생제 연고와 상처 치료. 상처가 개방되는 경우, 단계별 1.1.5 1.1.2 에서처럼 동물을 마취 및 1.3과 상처습니다0.14. 매일 동물의 상태를 모니터링합니다. 동물 inacitivity, 식욕 부진, 체중 감소 및 색의 손실 이상의 적당한 흔적이있는 경우 (23 G 바늘 0.25 ㎖에 163 ㎎ / ㎏)을 복강 lethabarb 분사의 치사량을 사용하여 동물을 안락사.
2. 플로우를 통해 척추 경 회의소 (동물 당 2 개의 챔버)
- 수술에 대한 동물의 준비
- 반복 1.1.4을 통해 1.1.1 단계를 반복합니다. 두 개의 챔버는 단일 래트 모두 서혜부 영역에 주입 할 수있다.
- 대퇴 선박의 분리 및 상공 회의소의 삽입
- 반복 1.2.8을 통해 1.2.1 단계를 반복합니다.
- 동맥 완전히 조직을 둘러싼 및 분기 결찰의 해제 정맥 모두, 수술 필드에 실을 가지고.
- 챔버베이스가 더 왜곡 또는 꼬임이 없는지 확인하고의 대응하는 슬릿에 그대로 대퇴 혈관의 각 놓습니다.
- attachi에 의해 챔버를 닫습니다베이스에 뚜껑을 ng를. 지속적인 실행을 4/0 실크 봉합사 플러스 두 개 또는 세 개의 추가 간단한 중단 바늘을 사용하여 상처를 닫고 동물이 앞서 설명한 복구 할 수 있습니다.
챔버 및 조직 처리 3. 수확
- 실험의 시점 (4~6주 후 주입)에 도달하면, 단계 1.1.2에서와 같이 동물을 마취와 1.1.5 단계를 1.1.3를 반복합니다.
- A # 15 블레이드를 사용하여 상처를 열고 챔버가 완전히 노출 될 때까지 가위로 조직을 잘라.
- 다음 원위 방향으로 피를 우유, 부드럽게 두 microforceps과 용기를 폐색 마지막 근위 집게를 해제 : 혈관 개통의 구조 및 시험에 근위 대퇴 혈관을 노출. 선박이 다시 혈액으로 채워지면,이 개통을 확인합니다. 일 경우에 모두 근위 및 원위 동정맥 루프의 경우 근위 대퇴부 혈관을 결찰전자의 흐름을 통해 구성 및 블록 엉 포함하는 조직으로 챔버를 제거합니다.
- 실험의 끝에서, (23 G 바늘 0.25 ㎖ 중의 163 ㎎ / ㎏)을 복강 내 주사 lethobarb의 치사량을 사용하여 동물을 안락사.
- 24 시간, 실온에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 조직을 고정한다. (1-2 mm 두께) 각각 파라핀 왁스 또는 최적의 절단 온도 화합물 파라핀 섹션 (5 μm의) 또는 동결 절편 (10 μm의)에 포함 된 여러 가로 섹션으로 나눈다 조직. 3,4,8,17,22, (24)
- 조직의 일반적인 형태를 조사하는 등의 헤 마톡 실린 및 에오신으로 일상적인 조직 학적 염색을 수행합니다. 심근 예를 들어 심장 트로포 닌 T의 면역 염색에 대한 관심의 세포 유형, 3,4,8,17,22,24,29을 식별하기 위해 특정 항체와 면역 조직 화학 염색을 수행합니다.
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Representative Results
상기 프로토콜에 기재된 바와 같이 조직 공학 챔버들의 생성은 미세 수술을 실시 하였다. 챔버 내부에서 발생하는 조직 3. 다양한 조직 유형이 성공적으로 생체 내 혈관 챔버 (도 2)를 이용하여 설계 한 프로토콜 단계에서 설명하는 바와 같이 조직 학적으로 관찰 할 수있다. 이러한 신생아 쥐의 심근 (그림 2A), 지방 조직 세포 외 기질 (그림 2C)에서 파생 된 하이드로 겔와 쥐 골격 근육 아세포 (그림 2B), 및 지방 조직과 근육 조직과 심장 조직을 포함한다.
조직의 형태 학적 평가 스테레오 조사원 ImageJ에 시스템 또는 소프트웨어 중 하나를 수행 할 수있다. 다양한 조직 성분의 질적 평가 외에도 3,4,8,17,22,29 상기 Stereology를 시스템은 정량화 바이어스 허용특정 조직의 체적을 없애는. 예를 들어, 렉틴 (쥐 내피 세포 마커)의 횡단면 (도 3) Stereology를 시스템의 비디오 현미경을 사용하여 수확 된 조직 구조의 혈관 용적을 추정하는데 사용될 수있는 염색. 유사 정량화 방법은 다른 조직 유형의 양을 평가하기 위해 적용될 수있다.
조직 공학 챔버는 또한 생체 내 주입에 다음 세포의 운명을 추적하기 위해 사용될 수있다. 세포 등의 DII, PKH26 또는 주입 전에 양자점 형광 염료로 미리 표시 할 수 있습니다. 예를 들어, DII 미리 라벨링 된 신생아 래트 심근 삼일 후 주입 (도 4A)에서 수확 된 조직 구조로 검출 할 수있다. 우리는 또한 성공적으로 4 주 후 주입을 위해 DII가 미리 표시되어 이식 된 세포를 추적하고있다. 대안 적으로, 종 - 특이 적 항체는 I에 사용될 수있다이종 이식 연구에서 이식 된 세포를 dentify. 예를 들어, immunocompromized 래트에서 조직 공학 챔버 내부에 주입 된 인간 유도 만능 줄기 세포는 인간 Ku80 특이 항체 (도 4B)으로 면역 염색하여 수확 된 조직 구조에서 식별 될 수있다.
그림 1 : 생체 내 혈관 챔버와 심장 조직 공학 동정맥 루프 실 모델과 흐름을 통해 척추 경 챔버 모델과 내장 혈관 접근.. 챔버는 폴리 카보네이트 또는 폴리 어느 하나로부터 제조하고, 이들 물질은 생체 내에서 비 - 염증 및 비 - 독성으로 시험 하였다. 스케일 바 = 5 mm이다. (30)로부터 허가. 인쇄 다시 항변 그 자체로는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. 신생아 쥐의 심근 세포와 생체 내 혈관 챔버에서 설계 조직 (A) 심장 조직. 심근 세포가 심장 트로포 닌 T 항체 (브라운)로 면역 염색 하였다. 쥐 골격 근육 아세포와 (B) 근육 조직. 근육 세포는 최근 desmin 항체 (브라운)로 면역 염색 하였다. 지방 조직 세포 외 매트릭스로부터 유도 된 하이드로 겔로 (C) 지방층. 31 헤 마톡 실린 및 에오신 염색. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 : 착상 후 사주에 수확 조직 구조의 혈관 렉틴 스테인드 섹션의 대표 이미지.. 대퇴 동맥 (*)에서 돋 혈관은 렉틴 (갈색)으로 표시 하였다. 스케일 바 = 200 (왼쪽) μm의 100 μm의 (오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 조직 구조에 이식 된 세포의 식별 (A) DII 라벨 신생아 쥐 심근 (빨간색과 흰색 화살표) 후 주입 삼일 수확 쥐의 조직 구조에서. (B) 쥐에서 수확 tissu 조직 구조의 대표적인 인간 특정 Ku80 염색 조직학 이미지전자 공학 챔버는 이식 후 이십팔일에서 인간 유도 만능 줄기 세포 이식. 인간 핵는 인간 세포의 거부 반응을 방지하는 면역 표지 갈색 immunocompromized 래트를 사용 하였다 하였다. 스케일 바 = 50 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
미세 순환 공학은 현재 두 가지 방법을 통해 본질적으로 조사되고있다. 주입 된 때 상기 제 1 호스트 혈관 층에서 모세관의 것과 연결 체외 구조물 내의 높은 상호 혈관 네트워크 개발을 포함 이와 영양분의 전달을 보장하는 처리라고 inosculation 통해 구축 이식뿐만 아니라 주변뿐만 또한 핵심. 21,32,33에이 사전 혈관라고합니다. 그 모세관 발아 전 또는 병용 이식 세포 분화 및 조직 성장 중 발생하므로 두 번째 방법은, 생체 내에서 바로 호스트 자신의 혈관을 강화하려고. 17,34
여기에 제시된 생체 조직 공학 챔버 프로토콜은 동맥과 정맥을 배치하여 후자의 개념을 이용한다 어느 동정맥 루프 또는 관류 척추 경 구성으로서,시간이 지남에 따라 유의 발아 새로운 모세 혈관의 형성을 가능하게하는 빈 공간을 보호, 내부 챔버 (3) 등의 장점 (1) 시험 관내 조작의 부재.; (2) 호스트에 의해 거부되지 완전히자가 혈관 네트워크의 생성; 그것은 조직 허혈 경향 구성 렌더링 1~7 일 정도 소요될 수 inosculation 기간을 필요로하지 않는 (3) 실제로. 35, 36
그럼에도 불구하고, 이식 조직이 또한 제대로 공급하는 기간을 발생하는 돋아 중요한 모세관 주위에 3~7일 소요 주목해야한다. 챔버 번 3 지연 세포 주입 적절 실제로 개선 생존을 보여 주었다 혈관된다. (17) 또 다른 장점은 생체 적합성 및 챔버 '물질의 비 - 면역 원성 (즉, 폴리 카보네이트 및 폴리)를 포함한다. 또한, 경질 비 접힘 참BER은 조직과 병합과 달리 확장을 방해하고 새로 형성된 조직의 수확을 어렵게 만들 것 주변 환경과의 통합없이 성장하는 혈관에 대한 보호 공간을 제공합니다. 이에 대해서, 챔버가 폐쇄되어 있다는 사실은 조직 성장을 제한 할 수있다. 이것은, 그러나, 이제 닫힌 하나보다 효과적으로 조직을 성장 도시 된 천공 된 실을 사용 동정맥 루프 모델에서 설명되었다. 37
여기에 제시된 조직 공학 챔버 프로토콜 고도로 재현하지만 챔버 거의 일반적으로 약 70 %의 용량, 충전 완료 없다는 것을 강조한다. 일관된 결과는 몇 가지 중요한 단계 및 기술적 인 문제가 고려되도록 제공 달성된다. 혈관 작업을 할 때 척추 경 개통은 미세 수술 문합이 수행되는 경우 특히, 궁극적 인 목표입니다. 우리는 지속적으로 더 조직이 vasc 경우 성장하지 않습니다 발견울라 척추 경 혈전증 초기 수술 후. 개방성에 영향을 미치는 요인은 크게 네 가지 범주, 즉 수술 기술 혈류 혈전증 및 경련으로 분류 될 수있다.
첫째, 섬세한 수술 기술은 성공의 열쇠입니다. 이러한 점에서, 이러한 절차 동정맥 루프의 생성을 포함하는, 특히 사람이 용이하기 비 생활 모델이어서 래트의 대퇴부 혈관 제 실행에 의해 획득 될 수 수술 기술의 특정 수준을 필요로 주목해야한다 원리 및 기술은 여기에 다른 곳에 기재된. 혈관벽 특히 내막 38 데미지 회피되어야 항시 적이 현명 연신 과도한 방지 용기 벽의 전체 두께를 잡는하지 포함하는 혈관의 적절한 처리에 의해 바이폴라 coagulator 사용하고, 동정맥 루프의 경우, 치밀한 미세 수술 및 외상성 문합 성능. 헤파린 식염수로 세척하여 응고를 방지하는 데 도움이 있지만, 그것은 좋은 수술 기법을 대체하지 않습니다. 둘째, 혈류 요인은 주로 난류 및 정체에 관한 것이다. 왜곡에 차 난류는, 굴절 또는 선박의 꼬임은 혈전 형성을 촉진한다. 따라서 유선 무제한 흐름은 동정맥 루프와 흐름을 통해 모델을 모두 확보해야합니다. 이러한 의미에서, 동정맥 루프 모델 상복부 분기의 더링 효과 휨 방지하는 것이 필수적이다; 어떤 이유로 이러한 분기를 사용할 수없는 경우, 주위 조직의 혈관 벽에서 간단한 10/0 나일론 스티치 신중 대신에 배치되어야한다. 동정맥 루프 절차 중 문 합부 사이트에서 정적 피도 매우 혈전이며, 이전과 문합을 통해 헤파린 식염수로 적극적으로 용기를 세척 방지해야합니다. 이러한 수술 분야에서 가장 importa 오염물 등 셋째, 프로 혈전 인자ntly 문합 내부 외막 조각의 존재를 회피하여야한다. 용기를 준비 미세 수술 봉합 및 동정맥 루프를 구성 할 때 고려해야 할 정기적으로 세척하여 청결 중요한 측면을 필드와 문합을하는 유지에 제대로 이전에 끝납니다. 마지막으로, 혈관 경련의 문제가 있습니다. 혈관 경련의 병태 생리학이 완전히 해명되지 않았다하더라도, 로컬 및 조직 인자에 기인 할 가능성이 높다. 지역 요인은 혈관 외상, 수술 분야 및 조직 탈수 혈액의 존재를 포함한다. 한편, 낮은 코어 온도, 저혈압 및 통증 교감 반응을 포함 전신 요인. 38
따라서, 두 동정맥 루프와 흐름을 통해 모델, 적절한 취급과 섬세한 수술 기법과 함께 동물의 준비를 아무리 강조해도 지나치지 않다. 경련을 해결하기위한 전략 따뜻한 식염수 또는 희석와 관개를 포함1 % xylocaine 5 ~ 10 분의 휴식 시간을 갖는. 혈관 확장술과 외막의 박리도 인해 로컬 교감 효과 경련을 완화 할 수 있습니다. (38)을 미세 수술 문합과 암시 기술적 과제를 수행 할 필요를 회피하기 위해 커프스 기술은 다른 한 바와 같이 사용될 수있다.도 39는이 방법으로 구성 용기 중 하나를 삽입하는 것은 팔목에 종료, 그것은을 에버트와 원주 6/0 나일론 봉합사로 고정합니다. 다음에, 다른 용기 단부 커프 위에 미끄러와 유사한 방식으로 고정된다.
조직 공학 챔버 실험 연구의 가능성의 새 창을 열었다 꾸준히 잠재적 인 임상 목적으로 진행된다. 지금까지 여기에 제시된 모델은 서로 다른 계통의 조직의 생성을 위해 주로 사용되어왔다. 4,7,8,17,22을, 24,25,27-29,37,40 그럼에도 불구하고, 그들은의 번호를 가지고 수행 다른 잠재적 인 응용 프로그램. 예를 들어, 우리는 헥타르인간 유도 만능 줄기 세포 주입 후 기형 종 형성을위한 효과적이고 비교적 빠른 모델로 관류 챔버를 이용했습니다. (41, 42)을 따라서, 이러한 방법은 종양이없는 조직 공학을 달성하기 위해 "품질 관리"도구로 사용될 수있다 다 능성 줄기 세포. 또한, 약물 독성 연구는 챔버 내부 성장 인간의 조직에서 탐구 할 수있다. 마찬가지로, 병리 조직의 생성은 질병 모델링 및 약물 검사 대한 흥미로운 접근 방식을 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 조직 공학 챔버는 또한 생체 내에서 세포 운명의 조직의 성장과 추적을 공부하는 잠재적 인 모델이 될 수 있습니다.
결론적으로, 우리는 두 가지 방법을 통해 동물에 피하 챔버의 배치를 포함하는 프로토콜을 기술 하였다하십시오 미세 수술 동정맥 루프 또는 관류 척추 경 구성을 사용. 이 기술은 높은 재현성 및 일관된 결과를 산출한다. 그 사용 시간지금까지 조직 공학 분야에서 주로 이용 된 바와 같이, 그러나, 이들 챔버는 큰 응용 될 수있는 다른 잠재적 인 연구 분야가있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 이익을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NHMRC와 스탠 폭스 의료 재단 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 고소 맥케이, 릴리 아나 페페, 안나 Deftereos 및 실험 의학의 아만다 Rixon 외과 단위, 성 빈센트 병원, 멜버른의 수술 지원을 인정합니다. 지원은 혁신, 산업의 빅토리아 주 정부의 부서 및 지역 개발의 운영 인프라 지원 프로그램에 의해 제공됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors - Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors - Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5,000 UI/ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/ml |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/ml |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/ml |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/ml |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
| Lethabarb (sodium pentobarbitone) |  Virbac Animal Health |
LETHA450 | 325 mg/ml |
| Heat pad flexible | Redzone Heating |
RZ/Medium |
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