Abstract
I rekonstruktiv kirurgi, det finns ett kliniskt behov av ett alternativ till de nuvarande metoderna för autolog rekonstruktion som är komplicerade, kostsamma och handel ett fel för en annan. Vävnadsteknik håller löftet att ta itu med denna ökande efterfrågan. Men de flesta vävnadstekniska strategier misslyckas med att generera stabila och funktionella vävnadsersättning på grund av dålig vaskularisering. Detta dokument är inriktat på en in vivo vävnadsteknik kammarmodell inneboende kärlbildning där en perfusion artär och en ven antingen som en arteriovenös slinga eller en genomströmningsBLOMSTJÄLK konfiguration riktas i en skyddad ihålig kammare. I denna kammare baserat system angiogena groning sker från arteriovenösa fartyg och detta system lockar ischemisk och inflammatorisk driven endogen cell migration som gradvis fyller kammarutrymmet med fibro-kärlvävnad. Exogent cell / matris implantation vid kammarens konstruktion ökar cell surlevnad och bestämmer specificiteten hos de manipulerade vävnader som utvecklas. Våra studier har visat att denna kammare modell framgångsrikt kan generera olika vävnader såsom fett, hjärtmuskeln, levern och andra. Men ändringar och förbättringar som krävs för att säkerställa målet vävnadsbildning är konsekvent och reproducerbar. Den här artikeln beskriver ett standardiserat protokoll för tillverkning av två olika vaskulariserade tissue engineering kammarmodeller in vivo.
Introduction
Tillverka funktionella vaskulariserad vävnad med hjälp av en vävnadsteknik tillvägagångssätt är ett växande paradigm inom regenerativ medicin. 1,2 Många metoder för att konstruera nya och frisk vävnad för att ersätta skadad vävnad eller defekta organ har utvecklats, 3-6 experimentellt i små djurmodeller med lovande kliniska potentialen. 7,8 är dock fortfarande kärl en av de stora utmaningarna för tissue engineering begränsar dess potential att växa vävnader i kliniskt relevant storlek. 9
Nuvarande metoder för att vascularize vävnad följa antingen en yttre vägen där nya fartyg växa från mottagaren kärlbädd och invadera hela den implanterade vävnaden konstruerar 10 eller en inre vaskularisering väg där kärl växer och expanderar i samklang med den nya framväxande vävnaden. 11 yttre strategi traditionellt innebär sådd celler på en byggnadsställningin vitro och implantera hela konstruktionen i det levande djuret med förväntningen att näringsämnen, tidigare levererat av odlingsmedier kommer att hämtas från cirkulationen. 12,13 Konceptet är enkla som vaskulär inväxt är för långsam och endast mycket tunna implantat (< 1-2 mm tjock) kommer att förbli livskraftig. Tillhandahålla näringsämnen och syre med hjälp av en tillräcklig och snabb vaskularisering är i centrum för alla lyckade försök att växa mer komplexa och större vävnadstekniska substitut såsom ben, muskler, fett och fasta organ. 14,15 Egen vaskularisering ger möjlighet till större konstruktioner att utvecklas genom progressiv vävnadstillväxt i proportion till dess växande blodtillförsel. En design är implantering i en kammare i ett kärlBLOMSTJÄLK med eller utan en cell seedade byggnadsställning in vivo. 5,6 Detta har banat väg för nya förfaranden för generering av tjockare inneboende vaskulariserade vävnader. 16,17 </ P>
På senare tid har strategier utvecklats för att i förväg vascularize vävnadstransplantat, före implantation. Dessa ingår blodkärlsnätverk syftar till inosculate med värd fartyg vid implantation möjliggör att snabbt tillhandahålla en komplett blodtillförsel för att förbättra överlevnaden av alla delar av ett transplanterat tjock vävnadstransplantat. 18
Vi var först ett in vivo vaskulariserad tissue engineering modell i små djur som innebär en subkutant implanterad halvstyv sluten kammare som innehåller en perfusion vaskulär pedicle och cellinnehållande biomaterial. Kammaren skapar en ischemisk miljö som stimulerar angiogen groning från de implanterade fartyg. 3 vaskulära BLOMSTJÄLK kan antingen vara en rekonstruerad arteriovenös slinga eller en intakt genomströmnings artär och ven. 3-6,19 Denna vaskulära BLOMSTJÄLK groddar en fungerande och omfattande arterio -capillary-venös nätverk som länkar till både konsteriole och venös slutar med vaskulära BLOMSTJÄLK. 3,20 Vidare omgivande ihåliga stödkammaren skyddar utveckla vävnad från potentiellt deformerande mekaniska krafter och förlänger den ischemiska strävan att öka vaskularisering. 3,21,22 Om fartyget BLOMSTJÄLK är helt enkelt implanteras i normal vävnad och inte inuti det skyddade utrymmet i kammaren, upphör angiogen groning längs samma tidslinje som en normal sår och ingen ny vävnad samlas runt BLOMSTJÄLK. Forskare har använt detta in vivo konfiguration för att producera tredimensionella funktionella vaskulariserade vävnad konstruktioner med stödjande kärl och kliniskt relevant storlek. 4,23 Dessutom kan de tekniska vaskulariserade vävnadskonstrukten med sin intakta kärl pedicle skördas för senare utplantering på skadestället . 24,25 En mer kliniskt möjligt scenario skulle vara att skapa kammaren i det slutgiltiga platsen för återuppbyggnad sn sådan som bröstet. Således kan detta de novo tissue engineering strategi har kliniska potentialen att ge en ny källa av funktionell målvävnaden för rekonstruktiv kirurgi. 26-28
Följande protokoll kommer att ge en allmän vägledning för att konstruera en in vivo vaskulariserad tissue engineering kammare hos råtta, som kan anpassas i olika djurmodeller och används för att undersöka de intrikata processer för angiogenes, matrisproduktion och cell migration och differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De protokoll som beskrivs här har godkänts av Animal etikkommitté St Vincent Hospital Melbourne, Australien, och genomfördes under strikt följsamhet till Australian National Health och Medical Research Council riktlinjer.
OBS: Två kammarprotokoll beskrivs nedan. De två olika modeller och deras specifika kammar mönster illustreras i Figur 1. Avdelningen (1) är tillverkad av polykarbonat (för rått-arteriovenös slinga kammarmodell). Det är cylindrisk med en inre diameter 13 mm och höjd 4 mm. Ett fönster på en punkt i väggen ger obehindrat tillträde för BLOMSTJÄLK. I den andra modellen (för rått genomströmningsBLOMSTJÄLK kammaren modell), är kammaren tillverkad av polyakryl- och är rektangulär (10 x 8 x 4 mm 3 invändiga mått). Den har två 1,5 mm öppningar på motsatta sidor för att rymma lårbensartären och anda som de överträda kammaren.
1. Rat Arteriovenösa Loop avdelningen Model (One ChamBer per djur)
OBS: Före start kirurgi, se till att alla instrument har ordentligt steriliserad. Likaså säkerställa instrument vila på sterila handdukar och befinner sig på ett rimligt avstånd från det kirurgiska området för att undvika kontaminering under förfarandet.
- Beredning av djur för kirurgi
- Använd råttor som väger minst 250 g för sin storlek av fartyg för skapandet av arteriovenösa slingan.
- Söva djuret med 4% isofluran inandning. Bekräfta adekvat anestesidjup genom att bedöma okontaktbarhet till tå-nypa. Efter anestesi, hålla djuret adekvat sövd under hela förfarandet med 2% isofluran.
- Placera djuret i ryggläge på en värmande dyna och tillämpa steril smörjmedel till ögonen för att förhindra uttorkning under operation.
- Använda en elektrisk rakapparat, raka båda ljumskarna och ta bort hår med en bit fuktig gasväv.
- Prep kirurgiska platser med klorhexidin/ 70% etanollösning och drapera djuret med sterila handdukar. Administrera en enda dos av karprofen (5 mg / kg, subkutant) som smärtstillande medel.
- Skörd av femoralvenen Graft
- Med användning av en # 15 blad, göra en 4 cm lång hudsnitt på vänster ljumske parallellt med det inguinala ligamentet. Detta exponerar inguinal fettkudden.
- Skär genom fettkudden perifer med sax lämnar den fäst vid sin vaskulära BLOMSTJÄLK baserat på epigastrisk fartyg.
- Genom att använda mikro sax, befria filmy bindvävs sammanväxningar mellan bukväggen och underliggande lårbens fartyg.
- Placera en indragare på bukväggen och dra medialt. Detta exponerar inguinal ligament och hela längden av de femorala fartyg.
- Med hjälp av mikro pincett och böjd sax dissekera epigastrisk venen och isolera den från omgivande fett genom att dra och skärning. Denna ven fungerar som en tjuder vid konstruktion slingan.
- usinG Micro pincett och krökta mikro sax öppna perivaskulära manteln innehåller de femorala fartyg och nerv hela vägen från det inguinala ligamentet till dess bifurkation distalt om epigastrisk grenen.
- Med hjälp av mikro pincett, plocka upp lårvenen genom sin adventitia och försiktigt separera den från de omgivande vävnaderna och åtföljande artär. Gör detta med mikro pincett och böjda rund pekade mikro sax genom att dra vävnaden isär och skär igenom den.
OBS: ta aldrig hela tjockleken av venväggen som detta kan orsaka skada på intima gör det utsatt för trombos. - Ligera sidogrenar konstaterades under dissektion med 10/0 nylon sutur eller koagulera dem med en bipolär koagulator.
- Med lårbensvenen helt gratis, ligera dess proximala och distala ändar med 4/0 silkessuturer. Se till att erhålla en ventransplantat av åtminstone 10 mm längd och innefattar ca 0,5 cm längd av epigastrisk gren, som skall användas som en killen rep tjuderför att hålla öglan öppen i kammaren.
- Med hjälp av mikro pincett och raka mikro sax, trimma adventitia från transplantatet ändar genom att försiktigt dra och kapning. Detta kan också göras senare, innan mikrokirurgiska anastomoser.
- Spola venen transplantat med hepariniserad koksaltlösning (10 U / ml heparin) och låt den vila i lösningen. Stäng såret med hjälp av kontinuerlig drift 4/0 siden sutur plus två eller tre ytterligare enkla avbrutna stygn.
- Skapande av Arteriovenösa Loop och Implantation av avdelningen
- Upprepa steg 1.2.1 till 1.2.4 i exakt samma sätt på den kontra lemmen.
- Med hjälp av mikro pincett, dissekera och isolera både epigastrisk artär och ven bilda den omgivande fettkudden. Gör detta genom att försiktigt dra vävnaden bort från fartyg
- Med hjälp av mikro pincett, plocka upp lårbensartären genom sin adventitia och befria det från de omgivande vävnaderna. Gör detta med mikro pincett och böjda runt spetsiga micro sax genom att dra vävnaden isär och skär genom det. Ligera eller koagulerar dess sidogrenar.
- Ligate lårbensartären och ven distalt uppkomsten av epigastrisk fartyg som använder 4/0 siden sutur.
- Placera en enda klämma proximalt på var och en av lårbensartären och venen. Med hjälp av en vass rak mikro sax, gör en ren tvären i varje kärl distalt uppkomsten av epigastrisk grenarna. Placera en steril plast kontrast bakgrund i kärlen.
- Spola kärlen kraftigt med generösa mängder av hepariniserad saltlösning tills allt blod tas bort från lumen.
- Ta venen transplantatet i operationsområdet och ta bort eventuella överflödiga adventitia från fartygens ändarna enligt steg 1.2.10, om det behövs.
- Utför båda mikro anastomoser med 10/0 nylon sutur. Anastomos den proximala änden av ventransplantatet till den femorala venen och den distala änden till den femorala artären. Detta gör det möjligt för blodet att flöda from arteriell till den venösa sidan utan motstånd från ventiler inuti venen transplantat.
OBS: Se till att lårbens fartyg och ventransplantatet vila i sin naturliga ställning utan vändningar. - Kontrollera om läckage vid båda anastomotiska platser. Lösa små läckor, som ser ut som icke pulserande blod som kommer ut ur anastomistället, genom att placera en liten bit av fett på toppen och försiktigt komprimera för 5-10 min. Större pulserande läckor som snabbt översvämma hela fältet kommer att behöva ytterligare stygn.
- Kontrollera öppenheten hos arteriovenösa slingan. Gentle ocklusion av lårbensartären bör göra det krympa medan densamma i den femorala venen bör uppsluka den.
- Placera basen av vävnadsteknik kammaren under arteriovenös slinga med den senare vilar i sin naturliga position utan tvinningar eller veck.
- Fäst basen av kammaren till inguinal ligament och underliggande muskeln fascia med 6/0 nylon suturer.
- Placera locket överbasen så att de femorala fartyg inte inträder i kammaren genom ett hack (fönster i sidan av kammaren). När du stänger locket, se till att den fångar epigastrisk grenar, mellan kammaren basen och locket, som fungerar som tjuder att hålla arteriovenösa slingan på plats.
- Stäng såret med hjälp av kontinuerlig drift 4/0 siden sutur plus två eller tre ytterligare enkla avbrutna stygn.
- Låt djuret att återhämta sig från anestesi på en värmande dyna.
- Lämna inte djuret utan uppsikt tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. På samma sätt inte tillbaka ett djur som har opererats för sällskap med andra djur tills återhämtat sig helt. 24 h senare, administrera en annan enda dos av Karprofen (5 mg / kg, subkutant) som analgetikum.
- Behandla såret med topisk antibiotisk salva i 5 dagar. Om såret öppnas, söva djuret som i steg 1.1.2 till 1.1.5 och stänga såret som i 1.30,14. Övervaka hälsan av djuret dagligen. Avliva djuret med hjälp av en dödlig dos av intraperitoneal lethabarb injektion (163 mg / kg i 0,25 ml av 23 G-nål) om djuret visar mer än en måttliga tecken på inacitivity, dålig aptit, viktminskning och förlust av färg.
2. Genomflödes pedicle avdelningen (två kammare per djur)
- Beredning av djur för kirurgi
- Upprepa steg 1.1.1 till 1.1.4. Två kamrarna kan implanteras in i båda ljumsk regionerna i samma råtta.
- Isolering av Lårbens fartyg och Insättning av kammaren
- Upprepa steg 1.2.1 till 1.2.8.
- Med både artär och ven befriades fullständigt av omgivande vävnader och deras grenar ligeras, bringa kammaren in i operationsområdet.
- Placera var och en av de intakta lårbens fartyg på motsvarande slits av kammarens bas att se till att det inte finns några vändningar eller veck.
- Stäng kammaren genom attaching locket till basen. Stäng såret med hjälp av kontinuerlig drift 4/0 siden sutur plus två eller tre ytterligare enkla avbrutna stygn och tillåta djuret att återhämta sig så som tidigare beskrivits.
3. Skörd av Chambers och Tissue Processing
- När experimentets tidpunkter (4-6 veckor efter implantation) uppnås, söva djuret som i steg 1.1.2 och upprepa steg 1.1.3 till 1.1.5.
- Öppna sår med hjälp av en # 15 blad och skär igenom vävnaden med sax tills kammaren är helt exponerad.
- Exponera de femorala fartyg proximalt till konstruktionen och testa för vaskulär öppenhet: försiktigt ockludera kärlet med två microforceps, sedan mjölka blod i en distal riktning och slutligen frigöra de proximala pincett. Om fartyget fylls med blod igen, bekräftar denna öppenhet. Ligera femorala fartyg proximalt i fallet med den arteriovenösa slingan och både proximalt och distalt i fallet med the genomströmnings konfiguration och ta bort kamrarna med innehållande vävnad i klump.
- Vid slutet av experimentet, avliva djuret med användning av en letal dos av intraperitoneal lethobarb injektion (163 mg / kg i 0,25 ml av 23 G nål).
- Fix vävnader i 4% paraformaldehyd vid rumstemperatur under 24 h. Divide vävnader i flera tvärsektioner (1-2 mm tjocka) och bädda in i paraffin eller optimal skärtemperaturen förening för paraffin (5 um) eller frusna sektioner (10 nm), respektive. 3,4,8,17,22, 24
- Utför rutin histologiska färgning såsom hematoxylin och eosin för att undersöka den allmänna morfologi av vävnader. Utför immunhistokemisk färgning med specifik antikropp för att identifiera celltyp av intresse, 3,4,8,17,22,24,29 exempelvis kardiellt troponin T immunfärgning för kardiomyocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det mikrokirurgiska skapande av vävnadstekniska kamrarna utfördes såsom beskrivs i protokollet ovan. Vävnader som genereras inuti kamrarna kan undersökas histologiskt som beskriver protokoll steg 3. Olika vävnadstyper har framgångsrikt konstruerats med hjälp av vaskulariserad kammaren in vivo (Figur 2). Dessa inkluderar hjärtvävnad med neonatala råttkardiomyocyter (figur 2A), muskelvävnad med råttskelett myoblaster (figur 2b), och fettvävnad med en hydrogel härledd från fettvävnad extracellulär matrix (Figur 2C).
Morfometrisk utvärdering av vävnader kan utföras med antingen en stereo Investigator system eller ImageJ programvara. 3,4,8,17,22,29 Utöver kvalitativ bedömning av olika vävnadskomponenter, den stereology systemet möjliggör också förutsättningslös quantifiering av specifik vävnadsvolym. Exempelvis lektin (en markör för gnagare endotelceller) färgades tvärgående sektioner (Figur 3) kan användas för att uppskatta den vaskulära volymen hos de skördade vävnadskonstrukten som använder video-mikroskopi med stereology systemet. Liknande kvantifieringsmetoder kan användas för att bedöma omfattningen av andra vävnadstyper.
De vävnadsutvecklings kamrarna kan också användas för att spåra cell öde efter implantation in vivo. Celler kan i förväg märkta med fluorescerande färgämnen som DII, PKH26 eller kvantprickar före implantation. Till exempel, kan neonatala råttkardiomyocyter pre-märkta med Dil detekteras i de vävnadskonstrukten skördas vid 3 dagars post-implantation (Figur 4A). Vi har också framgångsrikt spåras implanterade celler som har pre-märkta med Dil för upp till fyra veckor efter implantation. Alternativt kan artspecifika antikroppar användas för att identify implanterade cellerna i xenotransplantation studier. Till exempel kan humana inducerade pluripotenta stamceller implanteras inuti vävnadsutvecklingskamrarna i immunocompromized råttor identifieras i de skördade vävnadskonstrukten genom immunfärgning med humanspecifik Ku80 antikropp (Figur 4B).
Figur 1: Hjärt tissue engineering med vaskulariserade kammaren in vivo Intrinsic vaskularisering strategi med arteriovenös slinga kammarmodell och genomströmningsBLOMSTJÄLK kammarmodell.. Kamrarna gjordes från antingen polykarbonat eller polyakrylsyra, var dessa material testades för att vara icke-inflammatoriska och icke-toxiska in vivo. Skalstreck = 5 mm. Re-tryckt med tillstånd från 30. Grunden SE klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Vävnader konstruerade från vaskulariserade kamrarna in vivo (A) hjärtvävnad med neonatala råttkardiomyocyter. Kardiomyocyter immunfärgades med kardiellt troponin T antikropp (brun). (B) Muskelvävnad med råttskelett myoblaster. Muskelceller immunfärgades med desmin antikropp (brun). (C) Fettvävnad med en hydrogel härrörande från fettvävnad extracellulära matrisen. 31 Hematoxylin och eosin färgning. Skala bar = 50 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
/files/ftp_upload/54099/54099fig3.jpg "/>
Figur 3: kärl av ett vävnadskonstruktioner skördas vid 4 veckor efter implantation Representativa bilder av lektin-färgade sektioner.. Blodkärlen groning från lårbensartären (*) märktes med lektin (brun). Skalstreck = 200 pm (till vänster) och 100 m (till höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Identifiering av transplanterade celler i vävnads konstruktioner (A) Dil-label neonatala råttkardiomyocyter (röd och vita pilar) i en råttvävnad konstruktion skördades 3 dagar efter implantation. (B) Ett representativt humanspecifik Ku80 färgade histologi bild av en vävnads konstruktion som skördats från en råtta tissue ingenjörskammaren implanterades med humana inducerade pluripotenta stamceller efter 28 dagar efter implantation. Humana kärnor immuno-märkta bruna och immunocompromized råtta användes för att förhindra avstötning av mänskliga celler. Skala bar = 50 um. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konstruktion av mikrocirkulationen utreds för närvarande i huvudsak genom två metoder. Den första innefattar utveckling av ett tätt sammanlänkad vaskulära nätverket inom konstruktet in vitro, så att när den är implanterad, kapillärer från värdkärlbädd ansluta med de hos det transplanterade konstruera genom en process som kallas inosculation, vilket säkerställer leverans av näringsämnen som inte enbart till periferin men även till 21,32,33 kärnan. Detta kallas pre-kärlbildning. Den andra metoden försöker att förbättra värdens egen vaskulatur direkt in vivo, så att kapillär groning sker antingen före eller samtidigt med implanterad celldifferentiering och vävnadstillväxt. 17,34
In vivo vävnadsteknik kammaren Protokollet presenteras här utnyttjar det senare begreppet genom att placera en artär och en ven, antingen som en arteriovenös slinga eller en genomströmnings pedicle konfiguration,i en skyddad tomt utrymme, så att betydande groning och bildningen av nya kapillärer över tiden 3 Fördelar med kammaren inkluderar (1) avsaknad av in vitro-manipulationer. (2) generering av en helt autologa vaskulär nätverk som inte kommer att förkastas av värden; och (3) det faktum att det inte behöver en inosculation period som kan ta mellan 1 till 7 dagar gör vävnaden konstruera benägna att ischemi. 35,36
Trots detta måste det påpekas att det tar ca 3-7 dagar för betydande kapillär groning att inträffa, en period under vilken den implanterade vävnaden också dåligt levereras. 3 Fördröjd cell implantation när kammaren är tillräckligt vaskulariserade har i själva verket visat förbättrad överlevnad. 17 En ytterligare fördel inkluderar biokompatibilitet och icke-immunogenicitet av kamrarna "material (dvs polykarbonat och polyakryl). Dessutom den styva icke-hoptryckbara chamber ger ett skyddat utrymme för vävnaden och kärlsystemet att växa utan sammanslagning och integrering med den omgivande miljön, som annars skulle hindra expansion och göra skörd av den nybildade vävnaden svårt. I motsats, kan det faktum att kamrarna är stängda begränsa vävnadstillväxt. Detta har dock tagits upp i arteriovenös loopmodellen, som nu använder en perforerad kammare som har visat sig öka vävnads mer effektivt än den slutna en. 37
Vävnadstekniska kammarprotokoll som presenteras här är mycket reproducerbar men det bör understrykas att kamrarna sällan fylla till fullbordan, vanligtvis till ca 70% kapacitet. Konsekventa resultat uppnås under förutsättning att vissa kritiska steg och tekniska frågor beaktas. BLOMSTJÄLK öppenhet är det slutliga målet när man arbetar med blodkärl, i synnerhet om mikro anastomoser utförs. Vi har genomgående funnit några vävnad växer om VaseUlar BLOMSTJÄLK tromboser tidigt efter operationen. Faktorer som påverkar öppenhet kan grovt delas in i fyra kategorier, nämligen kirurgisk teknik, blodflöde, trombos och kramp.
För det första är en känslig kirurgisk teknik är nyckeln till framgång. I denna mening, bör det noteras att dessa förfaranden, särskilt en som involverar skapandet av en arteriovenös slinga kräver en viss nivå av kirurgisk färdighet som lätt kan förvärvas genom att öva först i icke-levande modeller och därefter i råttans lårbens fartyg efter principer och tekniker som beskrivs här och på andra håll. 38 Skador på kärlväggen, i synnerhet intima, måste undvikas vid alla tillfällen genom korrekt hantering av kärlen, som innehåller aldrig tag i hela tjockleken av kärlväggen, vilket förhindrar överdriven stretching, förnuftig användning av den bipolära koagulatorn, och i fallet av det arteriovenösa slingan, utförande av noggranna och atraumatiska mikrokirurgiska anastomoser. Även spolning med hepariniserad koksaltlösning hjälper till att förhindra koagulering, kommer det aldrig ersätta en fin kirurgisk teknik. För det andra, blodflödes faktorer hänför sig huvudsakligen till turbulens och stasis. Turbulent flöde sekundärt till vändningar, böjer eller veck av fartyg främjar blodproppar bildas. Därför är en strömlinje obegränsat flöde måste säkerställas både i arteriovenös slingan och genomströmnings modeller. I denna mening är absolut nödvändigt att tjudra effekten av epigastrisk grenarna i arteriovenös slinga modell för att förhindra böjning; om av någon anledning dessa grenar inte kan användas, bör enkla 10/0 nylonstygn från kärlväggen till de omgivande vävnaderna noggrant placeras i stället. Statisk blod på anastomistället under förfarandet arteriovenös slingan är också mycket trombogen och måste förhindras genom att spola kärlet kraftigt med hepariniserad koksaltlösning före och under anastomosen. För det tredje, pro-trombotiska faktorer såsom föroreningar från operationsfältet och mest importantly närvaro av bitar av adventitia inuti anastomos är som bör undvikas. Förbereda fartyget slutar korrekt innan mikrosuturering och hålla området och anastomos rent genom att spola regelbundet viktiga aspekter att tänka på när konstruera arteriovenös slingan. Sist men inte minst, det är frågan om fartygets spasm. Även om patofysiologin fartygs spasm inte har varit helt klarlagd, är det troligt att bero på både lokala och systemiska faktorer. Lokala faktorer inkluderar kärltrauma, närvaron av blod i operationsfältet och vävnads uttorkning. Systemiska faktorer, å andra sidan, innefattar låg kärntemperatur, hypotension och sympatiska svar på smärta. 38
Således, i både arteriovenös slinga och genomflödes modeller, korrekt hantering och beredning av djuret tillsammans med en känslig kirurgisk teknik kan inte nog understrykas. Strategier för att lösa kramp inkluderar bevattning med varm saltlösning eller outspädd1% Xylocain och har en viloperiod på 5-10 minuter. Kärlet dilatation och strippning av adventitia kan också hjälpa till att lindra spasm beror på dess lokala sympatektomi effekt. 38 För att kringgå behovet att utföra mikrokirurgiska anastomoser och den tekniska utmaningen det innebär, kan manschetten teknik användas såsom beskrivits på annat ställe. 39 Denna teknik består att införa en av fartyget slutar i en manschett Evert det och säkra den med en periferi 6/0 nylon sutur. Därefter den andra änden kärlet glida över manschetten och säkras på ett liknande sätt.
Den vävnadsteknik kammare har öppnat ett nytt fönster av möjligheter i experimentell forskning och stadigt framåt mot en potentiell klinisk ändamål. Fram till nu har de modeller som presenteras här huvudsakligen använts för genereringen av vävnader av olika härstamningar. 4,7,8,17,22,, 24,25,27-29,37,40 Ändå har de ett antal andra potentiella tillämpningar. Till exempel, vi hahar använt genomflödeskammaren som en effektiv och förhållandevis snabb modell för teratom bildning efter implantation av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller. 41,42 Således kan detta tillvägagångssätt användas som en "kvalitetskontroll" verktyg för att uppnå tumörfria vävnadsteknik med pluripotenta stamceller. Dessutom kan läkemedels toxikologiska studier att utforskas i humana vävnader odlade inuti kammaren. Likaså generation av patologisk vävnad skulle kunna ge en intressant strategi för sjukdoms modellering och drogtestning. Slutligen kan den vävnadsteknik kammaren också blivit en tänkbar modell för att studera tillväxt av vävnad och spårning av cellernas öde in vivo.
Sammanfattningsvis har vi beskrivit ett protokoll som involverar placeringen av en subkutan kammare i djur genom två olika metoder: med hjälp av en mikro arteriovenös slinga eller en genomströmnings pedicle konfiguration. Tekniken är mycket reproducerbar och ger konsekventa resultat. Dess användning hsom utnyttjats främst inom vävnadsteknik hittills, men det finns andra potentiella forskningsområden där dessa kamrar kan vara av bra program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från NHMRC och Stafford Fox Medical Foundation. Författarna erkänner kirurgisk hjälp av Sue McKay, Liliana Pepe, Anna Deftereos och Amanda Rixon i experimentell medicinsk och kirurgisk Unit, St Vincents sjukhus, Melbourne. Stöd ges också av den viktorianska delstatsregering Department of Innovation, industri och regional utveckling Operational Infrastruktur Support Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors - Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors - Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5,000 UI/ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/ml |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/ml |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/ml |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/ml |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
| Lethabarb (sodium pentobarbitone) |  Virbac Animal Health |
LETHA450 | 325 mg/ml |
| Heat pad flexible | Redzone Heating |
RZ/Medium |
References
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al.
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M.
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
