Abstract
В реконструктивной хирургии, существует клиническая необходимость альтернативы нынешним методам аутогенной реконструкции, которые являются сложными, дорогостоящими и торговли один недостаток для другого. Тканевая инженерия держит обещание для решения этого растущего спроса. Тем не менее, большинство тканевой инженерии стратегии не генерировать стабильные и функциональные заменители тканей из-за плохой васкуляризации. Эта статья фокусируется на в естественных условиях тканевой инженерии камерной модели внутренней васкуляризации , где перфузировались артерии и вены либо как петли артериовенозной или конфигурации педикулярного проточного направляется внутри защищенной полой камеры. В этой камере на основе системы ангиогенеза происходит из артериовенозных сосудов и эта система привлекает ишемический и воспалительный приводом эндогенный миграцию клеток, которая постепенно заполняет камеру пространство с фиброзно-сосудистой ткани. Экзогенный клеток / матрица имплантации во время строительства камеры усиливает клеточную Сюрvival и определяет специфику инженерно-технических тканей, которые развиваются. Наши исследования показали, что эта камера модель может успешно генерировать различные ткани, такие как жир, сердечной мышцы, печени и других. Тем не менее, изменения и уточнения необходимы для обеспечения ткани-мишени образование последовательна и воспроизводимым. В данной статье описывается стандартизированный протокол для изготовления двух различных моделей васкуляризированных тканевой инженерии камеры в естественных условиях.
Introduction
Перерабатывающие функциональной васкуляризированных ткани с использованием тканевой инженерии подход является новой парадигмой в регенеративной медицине. 1,2 Многие подходы для конструирования новой и здоровой ткани для замены поврежденной ткани или дефектных органов были разработаны, 3-6 экспериментально в небольших животных моделей с многообещающий клинический потенциал. 7,8 Однако, васкуляризация остается одной из самых больших проблем для тканевой инженерии , ограничивающих ее потенциал для роста тканей клинически значимого размера. 9
Современные подходы к vascularize ткани следуют либо внешний путь , где новые сосуды растут от реципиента сосудистого русла и вторгнуться на протяжении всего имплантированный ткани создает 10 или внутреннюю васкуляризации путь , где васкулатура растет и расширяется в унисон с вновь развивающейся ткани. 11 Внешняя подход традиционно включает в себя высева клеток на эшафотв пробирке и имплантация полную конструкцию в живом организме животного с ожиданием того, что питательные вещества, ранее предоставленной культуральной среды, будут получены из обращения. 12,13 Концепция упрощенно , как сосудистая врастание происходит слишком медленно , и только очень тонкие имплантаты (< толщиной 1-2 мм) остаются жизнеспособными. Обеспечение питательных веществ и кислорода при помощи достаточного и быстрого васкуляризации лежит в основе каких - либо успешных попыток становятся все более сложными и более крупные тканевой инженерии заменители , такие как кости, мышцы, жир и солидных органов. 14,15 искробезопасности васкуляризация предлагает потенциал более крупные конструкции для развития путем роста прогрессивной ткани, соизмеримых с ее расширяющейся кровоснабжения. Один дизайн имплантации в естественных условиях в камере сосудистой ножке с или без затравки эшафот клеток. 5,6 Это открыло путь к новым процедурам для генерации более толстых внутренне васкуляризированных тканей. 16,17 </ Р>
В последнее время были разработаны стратегии для предварительного vascularize трансплантатов ткани, до имплантации. Эти объединенные сети кровеносных сосудов направлены на срастаться с принимающими судами при имплантации позволяет обеспечить быстрое предоставление полного снабжения кровью , чтобы улучшить выживание всех частей пересаженного трансплантата толстой ткани. 18
Мы впервые в естественных условиях васкуляризированных тканевой инженерии модель в мелких животных , которая включает подкожно имплантировали полужесткий закрытую камеру , содержащую перфузии сосудистую ножку и клеток , содержащих биоматериалов. Камера создает ишемический среду , которая стимулирует ангиогенеза из имплантированных сосудов. 3 сосудистая ножка может быть либо реконструированный петлю артериовенозной или проточный артерии и вены нетронутыми. 3-6,19 This сосудистая ножка рассаду функционирующей и обширная артерио -capillary-венозная сеть, которая связывает в обоих искусстваeriole и венозная заканчивается сосудистой ножке. 3,20 Кроме того, окружающие полые опорные камеры защищает развивающиеся ткани от потенциально деформирующего механические силы и увеличивает ишемические стремление повысить васкуляризации. 3,21,22 Если ножка судно просто имплантировать в нормальная ткань, а не внутри защищаемого пространства камеры, ангиогенеза прекращается по той же шкале, как и обычная рана и без новой ткани будет аккумулировать вокруг ножке. Исследователи использовали эту конфигурацию в естественных условиях для получения трехмерных функциональных конструкций васкуляризирована ткани с поддерживающей сосудистую сеть и клинически значимого размера. 4,23 Кроме того, сконструированные конструкции васкуляризирована ткани с ее неповрежденной сосудистой ножке можно собирать для последующей трансплантации в месте повреждения . 24,25 более клинически осуществимо сценарий будет создание камеры на месте окончательной реконструкции sуч как грудь. Таким образом, De Novo тканевой инженерии подход может иметь клинический потенциал , чтобы обеспечить новый источник функциональной ткани - мишени для реконструктивной хирургии. 26-28
Следующий протокол обеспечит общее руководство для построения васкуляризированных тканевой инженерии камеры в естественных условиях на крысах, которые могут быть адаптированы в различных животных моделях и используемых для изучения сложных процессов ангиогенеза, производства матрицы и клеточной миграции и дифференцировки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Описанные здесь протоколы были одобрены комитетом по этике животных в Сент-Винсент больницы Мельбурна, Австралии, и были проведены при строгом соблюдении австралийских руководящих принципов Национального совета здравоохранения и медицинских исследований.
Примечание: два протокола камеры описаны ниже. Две разные модели и их специфические конструкции камеры показаны на рисунке 1. Камера (1) изготовлен из поликарбоната (для петли крысы артериовенозная модели камеры). Он имеет цилиндрическую форму с внутренним диаметром 13 мм и высотой 4 мм. Окно в одной точке в стене позволяет беспрепятственный доступ к ножке. Во второй модели (для крыс проточные камеры ножке модели), камера изготовлена из полиакриловой и имеет прямоугольную форму (10 х 8 х 4 мм 3 внутренние размеры). Он имеет два отверстия 1,5 мм на противоположных сторонах для размещения бедренную артерию и вену, как они преступают камеру.
1. Крыса Arteriovenous Loop камера модель (ЧамБер расчете на одно животное)
Примечание: Перед началом операции, убедитесь, что все инструменты были должным образом стерилизовать. Аналогичным образом, обеспечить остальные инструменты на стерильные полотенца и находятся на достаточном расстоянии от операционного поля, чтобы избежать загрязнения во время процедуры.
- Подготовка животных для хирургии
- Используйте крыс весом не менее 250 г за их большого размера судов для создания контура артериовенозного.
- Анестезировать животное с 4% изофлуран ингаляции. Подкреплять адекватной глубины анестезии путем оценки невосприимчивость к схождения крайнем случае. После анестезии, держать животное адекватно наркозом в течение всей процедуры с 2% изофлуран.
- Место животное в лежачем положении на разогреве площадку и применять стерильную смазку для глаз, чтобы предотвратить высыхание во время операции.
- Используя электрическую бритву, бритье оба паху и удалить волосы с куском влажной марлей.
- Приготовительный хирургические участки с хлоргексидином/ 70% раствор этанола и драпировка животное стерильным полотенца. Вводить одну дозу Carprofen (5 мг / кг, подкожно) в качестве анальгетика.
- Урожай бедренная вена Graft
- Использование # 15 лезвие, сделать длинный 4 см разрез кожи на левой паховой параллельно паховой связки. Это подвергает паховой жировой ткани.
- Разрезать жировой ткани по окружности с ножницами оставляя она придает ее сосудистой ножке на основе эпигастральной судов.
- Использование микро-ножницы, освободить FILMY спаек соединительной ткани между брюшной стенкой и лежащих в основе бедренных сосудов.
- Поместите втягивающим на брюшной стенке и тянуть медиально. Это подвергает паховой связки и всю длину бедренных сосудов.
- Использование микро щипцами и изогнутые ножницы рассекают эпигастральной вены и изолировать его от окружающего его жира, осторожно потянув и резки. Эта вена действует как тросе при построении цикла.
- Usinг микро щипцами и изогнутые ножницы микро открыть периваскулярное оболочку, содержащую бедренные сосуды и нерв весь путь от паховой связки до ее бифуркации дистальнее эпигастральной ветви.
- Использование микро щипцов, возьмите бедренную вену его адвентиции и аккуратно отделить его от окружающих тканей и сопровождающих артерии. Делайте это с микро щипцами и изогнутыми круглыми однонаправленным микро ножницами, потянув ткани друг от друга и резки через него.
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не захватить всю толщину стенки вены, так как это может привести к травме интиме, что делает его склонным к тромбообразованию. - Перевязывать боковые ветви найдены во время вскрытия с 10/0 нейлоновым швом или коагулировать их с помощью биполярного коагулятора.
- С бедренную вену полностью свободна, лигировать его проксимальный и дистальный концы, при помощи 4/0 шелковыми швами. Убедитесь в том, чтобы получить вены трансплантата, по меньшей мере, 10 мм длины и включают в себя приблизительно 0,5 см длины эпигастральной ветви, которые будут использоваться в качестве парень канатного тросапровести открытую петлю в камере.
- Использование микро щипцы и ножницы прямые микро, обрезать адвентиции из концов трансплантата путем осторожно потянув и резки. Это также может быть сделано позже, перед микрохирургических анастомозов.
- Промывка вены трансплантата с гепарином солевым раствором (10 ед / мл гепарина) и оставить его на отдых в растворе. Закройте рану с помощью непрерывной работы 4/0 шелковым швом плюс два или три дополнительных простых прерванные стежков.
- Создание артериовенозных Loop и имплантация палаты
- Повторите шаги 1.2.1 1.2.4 в точно так же на контралатеральной конечности.
- Использование микро щипцов, рассекают и изолировать как эпигастральной артерии и вены образуют окружающий жировой ткани. Делайте это осторожно потянув ткани от сосудов
- Использование микро щипцов, поднимите бедренной артерии по ее адвентиции и освободить его от окружающих тканей. Делайте это с микро щипцами и изогнутым круглым однонаправленным микрофономро ножницы, потянув ткани друг от друга и резки через него. Перевязывать или коагулировать его боковые ветви.
- Лигирования бедренной артерии и вены дистально по отношению к появлению эпигастральной сосудов с использованием 4/0 шелковым швом.
- Поместите один зажим в проксимальном направлении на каждом из бедренной артерии и вены. Используя острый прямой микро ножницами, сделать чистый поперечный разрез в каждом дистальных сосуда к появлению эпигастральной ветвей. Поместите стерильную фон пластиковый контраст под сосуды.
- Промывка сосуды энергично с щедрым количеством гепаринизированной физиологическим раствором, пока вся кровь не будет удалена из просвета.
- Доведите вены трансплантата в операционном поле и удалите избыточную адвентиции из концов сосудов ", как на шаг 1.2.10, если это необходимо.
- Выполните оба микрохирургических анастомозов с 10/0 нейлоновым швом. Анастомозировать проксимальный конец вены трансплантата к бедренную вену и дистальный конец бедренной артерии. Это позволит крови течь FПЗУ артериальной венозной стороне без сопротивления со стороны клапанов внутри вены трансплантата.
Примечание: Убедитесь, что бедренных сосудов и привитого остальные вены в их естественном положении без каких-либо завихрений. - Проверить на наличие утечек на обоих анастомоза сайтах. Устранение небольших утечек, которые выглядят как не-пульсирует кровь, вытекающую из анастомоза, путем размещения небольшой кусочек сала на вершине и осторожно сжимая в течение 5-10 мин. Большие пульсирующие утечки, которые быстро затопить все поле будет нуждаться в дополнительных швов.
- Проверьте проходимость контура артериовенозного. Нежный окклюзия бедренной артерии должна сделать его сжать в то время как то же самое в бедренную вену следует проглатывать ее.
- Поместите основание тканевой инженерии камеры под петли артериовенозной с последним покоящихся в естественном положении без завихрений или перегибов.
- Закрепите основание камеры к паховой связки и основной фасции мышц с 6/0 нейлоновыми швами.
- Поместите крышку на свою сторонуоснование так, что бедренные сосуды входят в камеру через паз (окно в боковой стороне камеры). При закрытии крышки, убедитесь, что он ловит эпигастральной ветви, между камерой основания и крышки, которые выступают в качестве привязи держать петлю артериовенозного в рабочее положение.
- Закройте рану с помощью непрерывной работы 4/0 шелковым швом плюс два или три дополнительных простых прерванные стежков.
- Дайте животному, чтобы оправиться от наркоза на разогреве площадку.
- Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Точно так же, не возвращают животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью не выздоровел. 24 ч позже, администрировать другую разовую дозу Carprofen (5 мг / кг, подкожно) в качестве анальгетика.
- Обработать рану актуальной мази с антибиотиком в течение 5 дней. Если рана открыта, обезболить животное как на этапе 1.1.2 через 1.1.5 и закрыть рану, как в 1.3.14. Следить за здоровьем животных ежедневно. Усыпить животное, используя смертельную дозу внутрибрюшинной инъекции lethabarb (163 мг / кг в 0,25 мл на 23 G иглы), если животное показывает более чем один умеренные признаки inacitivity, плохой аппетит, потеря веса и потери цвета.
2. Проточные ножке палаты (две палаты на одно животное)
- Подготовка животных для хирургии
- Повторите шаги 1.1.1 через 1.1.4. Две камеры могут быть имплантированы в обеих паховых областей одной крысы.
- Выделение бедренных сосудов и вставка Палаты
- Повторите шаги 1.2.1 через 1.2.8.
- С обеих артерии и вены полностью освобождают от окружающих тканей и их ветви лигировали, принести камеру в операционном поле.
- Поместите каждый из неповрежденных бедренных сосудов на соответствующей щели камеры основание убедившись, что нет никаких завихрений или перегибов.
- Закройте камеру с помощью attachiнг крышку к основанию. Закройте рану с помощью непрерывной работы 4/0 шелковым швом плюс два или три дополнительных простых прерванные стежков и позволяют животному, чтобы восстановить, как описано выше.
3. Сбор камер и обработка ткани
- После того, как моменты времени эксперимента (в 4-6 недель после имплантации) достигаются, обезболить животное как на этапе 1.1.2 и повторить шаги 1.1.3 через 1.1.5.
- Откройте рану, используя # 15 лезвие и рассекают ткани с ножницами, пока камера не будет полностью подвергается.
- Вынести бедренных сосудов проксимальнее создание и тестирование на сосудистую проходимость: осторожно закупорить сосуд с двумя microforceps, затем молоко крови в дистальном направлении и, наконец, отпустить проксимальные щипцов. Если сосуд наполняется кровью снова, это подтверждает проходимость. Лигирования бедренных сосудов в проксимальном направлении в случае петли артериовенозной и как проксимально и дистально в случае йе проточный конфигурации, и снимите камеры с содержащей ткани единым блоком.
- В конце эксперимента, усыпить животное, используя смертельную дозу внутрибрюшинного введения lethobarb (163 мг / кг в 0,25 мл на 23 г иглы).
- Закрепить ткани в 4% параформальдегида при комнатной температуре в течение 24 ч. Разделить тканей в нескольких поперечных срезах (толщиной 1-2 мм) и встраивать в парафин или оптимального соединения температуры резания для парафиновых срезов (5 мкм) или замороженных срезов (10 мкм), соответственно. 3,4,8,17,22, 24
- Выполнение последующего гистологического окрашивания, такие как гематоксилином и эозином для изучения общей морфологии тканей. Выполните иммуногистохимическое окрашивание с специфическими антителами для идентификации типа клеток , представляющих интерес, например 3,4,8,17,22,24,29 сердечного тропонина Т иммунным окрашиванием для кардиомиоцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Микрохирургического создание тканевой инженерии камер проводили, как описано в протоколе выше. Тканей , генерируемые внутри камер могут быть гистологическое исследование , как описано на стадии протокола 3. Различные типы тканей были успешно разработаны с использованием васкуляризованная камеры в естественных условиях (рисунок 2). К ним относятся сердечную ткань с неонатальных кардиомиоцитов крысы (рис 2А), мышечной ткани крыс с скелетных миобластов (Фигура 2В) и жировой ткани с гидрогелем , полученной из жировой ткани внеклеточного матрикса (фиг.2с).
Оценка Морфометрические тканей может быть выполнена либо с системой стерео исследователем или программного обеспечения ImageJ. 3,4,8,17,22,29 В дополнение к качественной оценке различных компонентов ткани, система стереологии также позволяет несмещенная количественнофикации удельного объема ткани. Например, лектин (маркер для грызунов эндотелиальных клеток) окрашивали поперечные срезы (рис 3) могут быть использованы для оценки сосудистого объема собранных конструкций тканей с применением видеомикроскопия с системой стереологии. Подобные методы количественного определения могут быть применены для оценки объема других типов тканей.
Ткань инженерные камеры также могут быть использованы для отслеживания судьбы клеток после имплантации в естественных условиях. Клетки могут быть предварительно меченных флуоресцентными красителями, такими как DiI, PKH26 или квантовых точек перед имплантацией. Например, неонатальных кардиомиоцитах крысы предварительно меченных с DiI могут быть обнаружены в конструкциях ткани добываемых на 3 день после имплантации (фиг.4А). Мы также успешно отслеживаются имплантированные клетки, которые были предварительно помечены DiI до 4-х недель после имплантации. В качестве альтернативы, видовой специфические антитела могут быть использованы для Identify имплантированных клеток в исследованиях ксенотрансплантации. Например, стволовые клетки человека плюрипотентных индуцированных имплантированных внутри тканевой инженерии камер в иммунокомпрометированных крыс могут быть идентифицированы в заготовленных конструктов ткани иммунным окрашиванием с человеческим конкретным Ku80 антителом (фиг.4В).
Рисунок 1: Сердечный тканевой инженерии с сосудами камеры в естественных условиях искробезопасности васкуляризация подход с контуром артериовенозная модели камеры и проточного модели ножка камеры.. Камеры были сделаны либо из поликарбоната или полиакрилат, эти материалы были протестированы на невоспалительного и нетоксичными в естественных условиях. Шкала бар = 5 мм. Перепечатана с разрешения 30. Мольба се нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Тканей сконструированные из васкуляризированных камер в естественных условиях (А) сердечной ткани с неонатальных кардиомиоцитов крыс. Кардиомиоцитов иммуноокрашиванию с кардиального тропонина Т антителом (коричневый). (B) Мышечная ткань с крысиным скелетных миобластов. Мышечные клетки подвергали иммунному с Desmin антителом (коричневый). (C) Жировая ткань с гидрогеля , полученной из жировой ткани внеклеточного матрикса. 31 гематоксилином и эозином. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
/files/ftp_upload/54099/54099fig3.jpg "/>
Рисунок 3: венозность тканевого конструкций заготовленной через 4 недели после имплантации Типичные изображения лектин-окрашенных участков.. Кровеносные сосуды прорастают из бедренной артерии (*) были помечены лектина (коричневый). Шкала бар = 200 мкм (слева) и 100 мкм (справа). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Идентификация трансплантированных клеток в ткани конструкций (A) DiI маркировать неонатальных кардиомиоцитов крысы (красные и белые стрелки) в конструкции крысы ткани заготовленной в 3 -х дней после имплантации. (Б) представитель человеческого специфических Ku80 окрашивали гистологии изображение конструкции ткани собирали из Tissu крысые инженерно камера имплантировали человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток через 28 дней после имплантации. Человеческие ядра были иммуно-меченых коричневую и иммунокомпрометированных крысу использовали для предотвращения отторжения клеток человека. Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Проектирование микроциркуляции в настоящее время исследуется главным образом с помощью двух подходов. Первый включает в себя разработку высоко взаимосвязанную сосудистую сеть внутри конструкции в пробирке , так что при имплантации, капилляры от хозяина сосудистого русла соединиться с теми пересаженный построить посредством процесса , называемого сращивания, тем самым обеспечивая доставку питательных веществ не только на периферии , но также к ядру. 21,32,33 Это называется предварительно васкуляризации. Второй подход пытается улучшить собственную сосудистую сеть хозяина прямо в естественных условиях, так что капиллярная прорастание происходит либо до , либо одновременно с имплантированным дифференцировки и роста клеток ткани. 17,34
В естественных условиях тканевой инженерии протокол камеры , представленные здесь использует последнюю концепцию, помещая артерию и вену, либо в виде петли или артериовенозной конфигурации педикулярного проточный,внутри защищенной пустого пространства, что позволяет значительное прорастание и образование новых капилляров с течением времени 3 Преимущества камеры включают в себя (1) отсутствие манипуляций в пробирке. (2) генерация полностью аутологичных сосудистой сети, которая не будет отвергнута хостом; и (3) тот факт , что он не нужен период сращивания , который может занять от 1 до 7 дней рендеринга ткани построить склонны к ишемии. 35,36
Тем не менее, следует отметить , что она занимает около 3-7 дней для значительного капилляра прорастает произойти, период времени, в течение которого имплантированный ткани также плохо снабжаться. 3 Delayed клеток имплантации , как только камеры адекватно васкуляризации, по сути , показали улучшение выживаемости. 17 Еще одно преимущество состоит из биосовместимости и не-иммуногенность материала палат (т.е. поликарбонатной и полиакриловой). Кроме того, жесткая нескладной чамбер обеспечивает защищенное пространство для ткани и сосудистую систему, чтобы расти без слияния и интеграции с окружающей средой, которая в противном случае тормозить расширение и сделать урожай вновь образованной ткани трудно. Контрастно, тот факт, что камеры закрыты могут ограничить рост ткани. Это, однако, была решена в модели артериовенозного петли, которая в настоящее время использует перфорированную камеру , которая была показана , чтобы более эффективно выращивать ткани , чем закрытому. 37
Камерные протоколы тканевого инженерные, представленные здесь, являются весьма воспроизводимыми, но следует подчеркнуть, что камеры редко заполняют до завершения, как правило, около 70% своей емкости. Последовательные результаты достигаются при условии, что некоторые важные шаги и технические вопросы принимаются во внимание. Ножке проходимость является конечной целью при работе с кровеносных сосудов, особенно если микрохирургических анастомозов выполняются. Мы последовательно обнаружили никаких тканей не растет, если VascУлар педикулярные тромбозы рано послеоперационные. Факторы, влияющие на проходимость могут быть широко сгруппированы в четыре категории, а именно хирургического технического, кровотока, тромбоза и спазма.
Во-первых, тонкая хирургическая техника является ключом к успеху. В этом смысле следует отметить, что эти процедуры, особенно тот, в том числе создания артериовенозной петли требуют определенного уровня хирургического мастерства, который может быть легко приобретенную практиковать сначала в неживых моделей, а затем в бедренных сосудах крысы следующим принципы и методики , описанные здесь и в других местах. 38 Повреждение стенки сосуда, особенно интиму, следует избегать во все времена надлежащей обработки судов, которая включает в себя никогда не захватывая полную толщину стенки сосуда, предотвращая чрезмерное растяжение, рассудительный использование биполярного коагулятора, и в случае цикла артериовенозной, выполнение тщательных и атравматическими микрохирургических анастомозов, Хотя промывка с гепарином физиологическим раствором помогает предотвратить свертывание, он никогда не заменит тонкой хирургической техники. Во-вторых, факторы кровотока относятся в основном к турбулентности и стаз. Турбулентный поток вторичных завихрений, изгибов или изломов сосудов способствует образованию тромбов. Поэтому обтекаемая неограниченный поток должен быть обеспечен как в петле артериовенозной и моделей проточных. В этом смысле привязывать эффект эпигастральной ветвей в модели артериовенозного петли имеет важное значение для предотвращения изгиба; если по какой-либо причине не могут быть использованы эти ветви, простые 10/0 нейлоновые стежки от стенки сосуда к окружающим тканям, должны быть тщательно помещены вместо этого. Статическая кровь на месте анастомоза во время процедуры петлевой артериовенозная также сильно тромбогенная и должен быть предотвращен с помощью промывки сосуда энергично с гепарином физиологическим раствором до и в течение всего анастомоза. В-третьих, про-тромботические факторы, такие как загрязняющие вещества из операционного поля и наиболее IMPORTAntly наличие кусков адвентиции внутри анастомоза и следует избегать. Подготовка судна заканчивается правильно до микрохирургической ушивание и поддержанию поля и анастомоза в чистоте, регулярно промывке важные аспекты необходимо учитывать при построении контура артериовенозного. И последнее, но не в последнюю очередь, есть вопрос о спазме сосудов. Даже несмотря на то, патофизиология спазма сосудов не была полностью выяснена, это, вероятно, будет из-за локальных и системных факторов. Местные факторы включают травмы сосудов, наличие крови в операционном поле и ткани высыханию. Системные факторы, с другой стороны, включают низкую температуру ядра, гипотонии и симпатическая реакция на боль. 38
Таким образом, в обоих цикле артериовенозной и проточных моделей, надлежащей обработки и подготовки животного вместе с деликатной хирургической техникой, не может быть переоценена. Стратегии по разрешению спазма включают орошение с теплым физиологическим раствором или неразбавленной1% Xylocaine и имеющий период отдыха продолжительностью 5-10 мин. Судно дилатации и стриппинг адвентиции также может помочь облегчить судорогу из - за своего локального эффекта симпатэктомия. 38 Для того, чтобы обойти необходимость выполнения микрохирургических анастомозов и сложную техническую задачу он предполагает, метод манжета может быть использован , как описано в другом месте. 39 Этот метод состоит вставки одного из сосуда заканчивается в манжете, выворачивания и закрепить его с круговой 6/0 нейлоновой нити. Далее, другой конец сосуда скользит по манжеты и закреплены таким же образом.
Ткань-инжиниринг камеры открыл новое окно возможностей в экспериментальных исследованиях и неуклонно продвигается к потенциальной клинической цели. До сих пор модели , представленные здесь , не были использованы в основном для производства тканей различных линий. 4,7,8,17,22,, 24,25,27-29,37,40 Тем не менее, они имеют ряд другие возможные области применения. Например, мы гауже использовали камеру проточного как эффективный и сравнительно быстрой моделью для формирования тератомы после имплантации плюрипотентных стволовых клеток человека , индуцированный. 41,42 Таким образом, этот подход может быть использован в качестве "контроля качества" инструмент для достижения без опухолей тканевой инженерии с плюрипотентных стволовых клеток. Кроме того, исследования токсикологии наркотиков можно было бы изучить в тканях человека, выращенных внутри камеры. Точно так же, поколение патологической ткани может дать интересный подход к моделированию болезни и тестирования на наркотики. И, наконец, ткань-инжиниринговая камера может также стать потенциальной моделью для изучения роста ткани и отслеживания судьбы клеток в естественных условиях.
В заключение, мы описали протокол, связанных с помещением подкожной камеры у животных с помощью двух различных подходов: с использованием микрохирургической цикла артериовенозной или конфигурацию ножке проточный. Методика хорошо воспроизводим и дает устойчивые результаты. Его использование ча эксплуатировались в основном в области тканевой инженерии до сих пор, однако, есть и другие потенциальные направления исследований, для которых эти камеры могли бы быть большой применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при поддержке гранта финансирование из NHMRC и Стаффорд Fox Medical Foundation. Авторы признают хирургической помощи Сью Маккей, Лилиана Пепе, Анна Deftereos и Аманда Риксон опытной медико-хирургического отделения, больницы Сент-Винсент, Мельбурн. Поддержка также обеспечивается Департаментом штата Виктория правительства инноваций, промышленности и Операционной программы Инфраструктура поддержки региональному развитию.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 15 Blade Scalpel | Braun | BB515 | |
| 1 Toothed Adson Forceps | Braun | BD527R | |
| 1 Needle Holder | Braun | BM201R | |
| 1 Bipolar Coagulator | Braun | US335 | |
| 1 Micro Needle Holder B-15-8.3 | S & T | 00763 | |
| 1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 | S & T | 00125 | |
| 1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 | S & T | 00108 | |
| 1 Micro Scissors - Straight SAS-11 | S & T | 00098 | |
| 1 Micro Scissors - Curved SDC-11 | S & T | 00090 | |
| 2 Single Clamps B-3 | S & T | 00400 | |
| 2 10/0 nylon suture | S & T | 03199 | |
| 1 6/0 nylon suture | Braun | G2095469 | |
| 2 4/0 Silk Sutures | Braun | C0760145 | |
| Xilocaine 1% | Dealmed | 150733 | 10 mg/ml |
| Heparin Sodium | Dealmed | 272301 | 5,000 UI/ml |
| Ringer Lactate | Baxter | JB2323 | 500 ml |
| 1 dome-shaped tissue engineering chamber | custom made | ||
| 1 flow-through chamber | custom made | ||
| Lectin I, Griffonia Simplicifolia | Vector Laboratories | B-1105 | 1.67 μg/ml |
| Troponin T antibody | Abcam | Ab8295 | 4 μg/ml |
| Human-specific Ku80 antibody | Abcam | Ab80592 | 0.06 μg/ml |
| Desmin antibody | Dako | M0760 | 2.55 μg/ml |
| Cell Tracker CM-DiI dye | Thermo Fisher Scientific | C-7000 | 3 mg/106 cells |
| Lethabarb (sodium pentobarbitone) |  Virbac Animal Health |
LETHA450 | 325 mg/ml |
| Heat pad flexible | Redzone Heating |
RZ/Medium |
References
- Spiliopoulos, K., et al. Current status of mechanical circulatory support: A systematic review. Cardiol Res Pract. , 574198 (2012).
- Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook. Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).
- Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct. FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).
- Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).
- Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report. B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).
- Cronin, K. J., et al. New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials. Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).
- Forster, N. A., et al. A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice. Islets. 3 (5), 271-283 (2011).
- Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).
- Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).
- Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. Vascularization strategies for tissue engineers. Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).
- Weigand, A., et al. Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization. Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).
- Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).
- Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. Progress in adipose tissue construct development. Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).
- Vunjak-Novakovic, G., et al.
- Garcia, J. R., Garcia, A. J. Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
- Forster, N., et al. Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice. Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).
- Tilkorn, D. J., et al. Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model. Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).
- Chang, Q., Lu, F. A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold. Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).
- Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. De novo adipose formation in a vascularized engineered construct. Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).
- Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model. J Tissue Eng Regen Med. , (2015).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M.
- Yap, K. K., et al. Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber. Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).
- Findlay, M. W., et al. Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans. Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).
- Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).
- Sekine, H., et al. Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts. Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).
- Ting, A. C., et al. The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber. Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).
- Zhan, W., et al. Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber. Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).
- Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source. FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).
- Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. Growing vascularized heart tissue from stem cells. J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).
- Poon, C. J., et al. Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue. Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).
- Dilley, R. J., Morrison, W. A. Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair. Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).
- Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Hussey, A. J., et al. Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers. Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).
- Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts. Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).
- Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature. Methods. 56 (3), 440-451 (2012).
- Dolderer, J. H., et al. Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space. Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).
- Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. Plastic Surgery. Volume 1. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).
- Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).
- Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering. Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).
- Lim, S. Y., et al. In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).
- Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors. Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).
