Introduction
프리온은 중추 신경계에 영향을 미치는 심각한 신경 퇴행성 질환이다. 프리온 질병은 PRP 해상도라는 감염 체에 의해 정상 세포 프리온 단백질 PRP C의 미스 폴딩 기인한다. 이 질병은 인간 1-3에서 소 해면상 소에 뇌증, 스크래피 양에, cervids 만성 소모성 질환, 및 크로이츠 펠트 - 야콥병 등 종의 다양한 영향을 미친다. 프리온은 시냅스 손실 시작하고, 공포 화하기 위해 진행 신경 퇴행, 신경교 증, 신경 세포의 손실 및 플라크 침착을 일으킬. 결국, 4 개인 동물 /의 죽음의 결과로. 수십 년 동안, 연구자들은 늦추거나 프리온 질병의 진행을 중지하는 것을 의미 화합물을 조사 하였다. 그러나 연구진은 성공적인 치료 또는 효과적인 전신 배달 차량 중 하나를 발견하지 않았습니다.
내인성 PRP C 발현 프리온 질병 (5)의 발전에 필요한 C 표현이 지연 또는 질병의 경감 될 수 있습니다. 몇몇 그룹은 프리온 질환 PRP C 발현 수준의 역할을 조사하기 위해 쥐 뇌 조직에 직접 shRNA를 발현 PRP C의 감소 수준 또는 주입 lentivectors와 트랜스 제닉 마우스를 만들었다. 신경 PRP C의 양을 감소 발견 이들 연구자 프리온 질병의 병리학 시브를 중지 결과 및 6-9 동물의 수명을 연장. 우리는 마우스 신경 모세포종 세포 (10)의 PRP 해상도의 틈새에서 그 PRP C의 siRNA 처리 결과를보고했다. 이러한 연구는 치료의 사용은 작은 간섭 RNA (siRNA의) mRNA의 절단 같이 PRP C 발현 수준을 감소시키기에 충분히 프리온 질병의 진행을 지연시킬 수 있다는 것을 시사한다. 그러나 프리온 질환에 대한 조사 대부분의 치료는 실용적이지 않을 것입니다 방법으로 전달되었다임상있다. 따라서, siRNA의 치료는 CNS에 정맥 내 전달을 대상으로 전신 전달 시스템을 필요로한다.
연구자들은 유전자 치료제에 대한 전달 비히클로서 리포좀의 사용을 연구 하였다. 양이온 및 음이온 모두 지질 리포좀의 형성에 사용된다. 양이온 성 지질 및 DNA / RNA 사이의 전하의 차이를 효율적으로 포장 할 수 있기 때문에 양이온 성 지질 널리 음이온 지질 이상 사용된다. 양이온 성 지질의 또 다른 장점은 그들이 다른 지질 11-14보다 용이하게 세포막을 통과한다는 것이다. 그러나, 양이온 성 지질은 음이온 지질 (13, 14)보다 면역 원성 있습니다. 따라서 연구팀은 리포좀의 지질 음이온에 양이온을 사용하여 이동하기 시작했다. 유전자 치료 제품을 효율적으로 DNA / RNA 분자 15-19 집광 양전하 펩타이드 프로타민 설페이트를 사용하는 음이온 성 리포좀 내로 패키징 할 수있다. 음이온 LIPI 이후DS는 양이온 성 지질가 순환 시간을 증가 할 수 있으며, 더 많은 동물 모델 (13, 14)에서 허용 될 수보다 면역 원성 있습니다. 리포좀은 리포좀에 부착 된 펩티드를 대상으로 사용하여 특정 조직을 대상으로한다. 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체에 결합하는 RVG-9R의 신경 펩타이드는 중추 신경계 17-20로의 siRNA와 리포좀을 대상으로 사용되어왔다.
이 보고서는 프로토콜은 세 가지의 siRNA 전달 비히클을 제조하고, 패키징하고 신경 세포 (도 1)에 siRNA를 전달하기 위해 설명. siRNA를 리포좀 - 펩티드 복합체 (LSPCs)의 siRNA를 리포좀으로 구성되는 펩티드 타겟팅 RVG-9R 정전 기적 리포솜의 외 표면에 부착. 펩티드 RVG-9R 공유 결합 지질 PEG 그룹에 결합하여 siRNA를 리포좀 내에 캡슐화 프로타민 구성되어 치료의 siRNA (PALETS)를 캡슐화 리포솜을 해결. 아래의 방법을 사용하고 LSPCs PALET를 생성S는 PRP C의 siRNA는 치료 또는 실질적으로 프리온 질병 병리학의 발병을 지연시키는 엄청난 약속을 보유하고 신경 세포의 90 %, 최대 PRP C의 발현을 감소시킨다.
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Protocol
모든 마우스는 사육과 콜로라도 주립 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 평가 및 실험 동물 관리 국제의 인증 협회의 인증을 받았으며 실험 동물 자원, 유지되었다.
LSPCs 1. 준비
- 1 DOTAP (1,2-dioleoyl -3- 트리메틸 프로판) : LSPCs을위한 콜레스테롤의 비율이 1을 사용합니다. 1 클로로포름 : 플라스크에 메탄올 용액을 4 nmol을 리포좀 제제의 경우, DOTAP 2 나노 몰과 (1) 10 ㎖에 콜레스테롤이 나노 몰을 혼합한다.
- 흄 후드에서 N 2 가스를 이용하여 메탄올 용액 : 클로로포름 9 ㎖에 증발. 가스없이 밤새 흄 후드에서 용매의 마지막 1 mL로 증발시켰다. 플라스크의 바닥에 얇은 지질막을 관찰한다.
- 55 ° C에 10 % 자당 용액의 열 10ml를.
- / 천천히 분, 즉 1 ml에 얇은 지질 필름 상에 가열 된 10 % 자당 용액을 붓고 GE 동안ntly 플라스크를 소용돌이. 지질 분자는 겔 액상으로 유지하도록 55 ° C에서 지질과 10 %의 자당과 플라스크를 유지한다. 다중 층 소포 (MLV) 형성에 재수 결과.
- 지질은 리포좀 크기를 조정하기 전에 적어도 한 시간 동안 55 ° C에서 재수 할 수 있습니다.
- 1.0 μm의 필터 제조업체의 지침에 따라 압출기를 조립 또는 크기 1.0 μm의 주사기 필터를 사용합니다.
- 11 번 압출기에 주사기 중 하나에 가열 된 리포좀 현탁액 1 ML을 추가하고, 두 주사기 사이의 정지를 전달합니다. 서스펜션은 (11)를 통과 한 후 시작 주사기보다 반대 주사기에 있는지 확인하십시오.
- 리포좀 크기는 다시 0.45 μm의 다음으로, 0.2 ㎛의 필터는 큰 단일 층 소포 (LUVs)를 생성한다. 쉽게 크기 조정 가열 리포좀 현탁액을 유지합니다.
- (4를 20 μM의 200 μL와 4 nmol을 리포좀 현탁액 (200 μM)의 20 μl를 품다nmol을 총)을 실온에서 10 분 동안 siRNA의 스톡 용액.
- 500 μM 실온에서 10 분 동안의 siRNA / 리포좀 용액 (40 nmol을 총) 주식 RVG-9R 솔루션의 80 μl를 품어. LSPCs는 가능한 빨리 사용되어야하지만, 제조 후 수 시간이 사용될 수있다. 준비 후 몇 시간 동안 4 ° C에서 보관 LSPCs.
PALETS 2. 준비
- 40 : DSPE (1,2- 디스 테아-SN 글리세로 3 phosphoethanolamine) 중 5 몰비 : 콜레스테롤 : DSPE-PEG 또는 DOTAP : 콜레스테롤 : DSPE-PEG PALETS위한 55을 사용합니다. 1 클로로포름 : 플라스크에 메탄올 용액을 4 nmol을 리포좀의 제조를 위해, DSPE 또는 DOTAP 중 2.2 나노 몰, 콜레스테롤의 1.6 나노 몰 및 2 10 ㎖에 DSPE-PEG 0.2 나노 몰을 혼합한다.
- 단계 1.1 이상 1.2에 설명 된대로 정확히 리포좀 현탁액을 준비합니다. 1X PBS 10 ㎖에 DSPE 리포좀을 재수 1 ㎖ / 분을 추가하여 75 ℃까지 가열 하였다. 지질가에서 75 ° C에서 재수 할 수 있도록 허용크기 전에 적어도 1 시간.
- 크기는 리포좀 현탁액을 정확히 같은 단계 1.6-1.8에서 설명.
- 피펫 DOTAP와 DSPE 리포좀 후 단일 사용 씩에 4 nmol을 (200 μM) 리포좀 현탁액의 각 20 μL은 크기되었습니다 및 벤치 탑 동결 건조기 (그림 2)를 사용하여 30 분 동안 동결 건조했다.
- 20 μM DSPE PALETS 리포좀으로 캡슐화하는 siRNA를 실온에서 10 분 동안 프로타민 설페이트 26.6 μM 용액 1.4 μL (4 nmol을 총) siRNA의 스톡 용액 200 μl를 부화.
- siRNA와의 4 nmol을 원액 200 μL로 PALETS DOTAP 리포좀을 재수 또는 siRNA의 / 프로타민 용액 201.4 μL와 DSPE PALETS 리포좀을 재수. RT에서 10 분 동안 리포좀 / siRNA의 용액을 인큐베이션.
- 두 DOTAP 및 DSPE PALETS위한 리포좀 / siRNA의 용액에 60 mM의 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC) 용액 10 μL를 추가한다.
- 모두 DOTAP와 DSPE PALETS의 리포좀 / siRNA의 용액에 150 mM의 N 히드 록 (설포-NHS) 용액 10 μl를 추가합니다.
- RT에서 2 시간 동안 siRNA의 / 리포좀 현탁액과 EDC 및 NHS 술포 부화.
- 500 μM 실온에서 10 분 동안 솔루션을 가교의 siRNA / 리포좀과 (40 nmol을 총) 주식 RVG-9R 솔루션의 80 μl를 품어.
참고 : EDC / 설포-NHS가 PEG 지질에 공유 결합에 RVG-9R 수 있습니다. 준비 후 몇 시간 내에 PALETS를 사용합니다. 준비 후 몇 시간 동안 4 ° C에서 보관 PALETS. - PALETS의 siRNA를 캡슐화 효율을 확인하려면 :
- 이전과 프로타민 260 nm에서 설정된 분광 광도계 리포좀의 첨가 후에 siRNA의 농도를 측정한다.
- 50 kDa의 원심 필터를 사용하여 리포좀 / 캡슐화 된 siRNA의 서스펜션에서 캡슐화 된 siRNA를 필터링합니다. 20 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기.
- 농도 측정봉입 여액 siRNA를 260 nm에서 분광 광도계를 사용하여 잔류 물로 캡슐화 된 siRNA의 농도.
3. LSPCs 또는 PALETS와 마우스를 주입
- 혈관을 팽창하기 위해 가열 램프에 5 ~ 10 분 동안 쥐를 노출.
- 2-3 %의 이소 플루오 란 / 산소와 마우스를 마취하여 주입 전에 주입시 5-10 분 흐른다. 동물이 더 이상 보행과 호흡이 발가락 핀치를 수행하여 감속 때 마취를 확인하지 않습니다. 꼬리 정맥에 액세스하기 위해 후면 또는 측면에 마우스를 놓습니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
- / 지우기 70 % EtOH로 꼬리 뿌려 26 G 인슐린 주사기를 이용하여 마우스의 꼬리 정맥에 LSPCs 또는 PALETS 300 μL를 주입. 꼬리 정맥에 주입 말단 시작하고 정맥이 붕괴 또는 파열 경우 근위 이동합니다.
- 이 흉골 드러 누움을 유지 때까지 깨끗한 새장에 마우스를 놓습니다. 모 두지 마십시오완전히 회복 될 때까지 다른 케이지 동료와 함께 사용합니다. 마우스는 5 ~ 15 분에 복구해야합니다. 이들은 가열 패드 또는 회복이 오래 걸리는 경우 체온을 유지하기위한 가열 램프 아래에 배치 될 수있다. 마우스는 과열에 대한 보호하기 위해 면밀히 모니터링해야한다.
- 마취 기운이 떨어지기 보장하기 위해 주사 후 동물 몇 시간을 모니터하고 치료에는 부작용이 없습니다. LSPCs 또는 PALETS은 최소 24 시간 동안 순환 할 수 있습니다.
유동 세포 계측법을 통해 단백질 발현 4. 분석
- 15 분 동안 20 % CO 2 유량 쥐를 안락사.
- 가위를 사용하여 마우스의 피부와 두개골을 멀리 절단하여 뇌의 반 반구를 해부하다. 껍질 멀리 반 거리에 집게 나 가위의 끝 부분을 사용하여 두개골에서 뇌의 반구.
- FACS 완충액 2.5 mL로하여 40 ㎛의 메쉬 셀 스트레이너를 통해 각 마우스에서 뇌 눌러 반 구체 (1X; 주사기의 플런저 페트리 접시에 PBS, 1 % 소 태아 혈청, 10 mM의 EDTA).
- FACS 버퍼의 추가 2.5 ml의 셀 스트레이너와 페트리 접시를 씻어. 얼음에 15 ml의 원뿔 관에서 단일 세포 현탁액을 넣습니다.
- 피펫 350 x g에서 5 분 동안 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 5 ㎖ 단일 세포 현탁액 100 ㎕. FACS 완충액 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 세포 펠렛을 버린다. 5 분 동안 350 XG 스핀. FACS 버퍼의 또 다른 1 ㎖로 반복합니다. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
- (1) 100 ㎕의 세포를 품어 : FACS 버퍼에 0.5 ㎎ / ㎖ 쥐 항 - 마우스의 Fc 블록 (100) 희석을 얼음에 30 ~ 60 분. 펠렛 단계 4.5로 세포를 씻어. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
- 30 ~ 60 분 동안 얼음에 FACS 버퍼에 7 % 마우스 혈청에서 마우스 PRP C에 대해 20 μg의 / ㎖ 형광 항체 100 ㎕의 세포를 품어. 펠렛 단계 4.5로 세포를 씻어. 세포 현탁액을 유지얼음 에다가요.
- 펠릿 1 분간 적혈구 용해 완충액 1 ㎖ (1X PBS 155 mM의 NH 4 CL, 12 mM의 NaHCO3을 0.1 mM의 EDTA)으로 세포를 재 - 보류. 단계 4.5에서와 같이 펠릿은 FACS 완충액 1 ml의 세포를 재현 탁. 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 (10) 플로우 사이토 미터를 사용하여 C PRP 발현을 분석한다. 게이트는 총 세포 집단에서 세포를 살고 있습니다. 게이트 PRP C + 라이브 세포 집단에서 세포 MFI (평균 형광 강도)를 결정합니다.
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Representative Results
음이온 PALETS 내의 siRNA의 캡슐화의 효율성을 증가시키기 위해, siRNA의 프로타민을 혼합 하였다. 1 (그림 3A) : 1 2 : siRNA를위한 최선의 프로타민의 농도를 결정하기 위해, siRNA를 1에서, 프로타민의 서로 다른 농도로 혼합 하였다. 프로타민을 사용하지 않고 음이온 성 리포좀에 60~65% siRNA의 캡슐화 효율이 있었다. 프로타민과 샘플 : 1 ~ 1.5 : 1에서 siRNA의 몰비 1 (133-266 nm의)는 80~90%의 siRNA를 캡슐화를했다. 1.5 위의 어금니 비율 : 1의 siRNA / 프로타민 단지의 침전 결과. 이 침전 단지는 음이온 성 리포좀으로 캡슐화되지 않았다. siRNA의 프로타민에 첨가 후에 의한 희석에 대한 siRNA의 농도에 약간의 저하가 존재 하였다; 그러나, 프로타민 농도의 첨가 (도 3b) 한 후 안정적이었다. 50 kDa의 필터, siRNA의 90-95 %를 리포좀을 여과 후siRNA의 5-10 %의 여액 '자유'동안, 리포솜 잔류 연관되었다. 없음의 siRNA는 프로타민 또는 리포좀 만 샘플 (그림 3C)에서 검출되지 않았다.
생체 내에서 LSPCs의 효과를 확인하려면, 야생형 마우스는 24 시간 동안 LSPCs 처리 하였다. LSPCs 처리 한 야생형 마우스의 PRP C 발현 수준은 1X PBS로 처리 된 마우스와 PRP 녹아웃 (PRP KO) 마우스 (도 4)과 비교 하였다. LSPCs 처리 한 마우스의 뇌에서 PRP C의 세포 계측 분석 흐름 PRP C 수준이 감소 하였다 (도 4A 및 4B). 한 실험에서, 모든 마우스는 PRP KO 마우스 (도 4A)에서 관찰되었다 PRP C 수준에 가까운 PRP C 농도 80 ~ 90 % 감소했다. 두 개 이상의 독립적 인 실험 LSPCs 처리 한 마우스는 PRP C의 40-80% 감소 <나타났다/ SUP> 수준 (그림 4B). 총 LSPCs 중 (N = 14) 쥐를 치료, 단 하나의 마우스가 LSPCs에 대한 응답이 없었다 있었다.
그림 1 :. PALETS / LSPCs를 생성하고 마우스의 CNS에 정맥의 siRNA를 제공 할 수있는 프로토콜의 개요 리포좀은 얇은 지질 필름 수화 방법을 통해 생성되었다. PRP에서 C의 siRNA는 정전 기적 상호 작용을 통해 또는 캡슐화하거나 리포좀에 부착 하였다. PALETS 또는 LSPCs는 CNS 대상으로 펩타이드 RVG-9R의 첨가에 의해 완성되었다. 조립 후, PALETS은 / LSPCs 쥐의 꼬리 정맥에 주입하고, 24 시간 치료 후 PRP C 발현 세포 계측법. 흐름을 통해 평가 하였다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 : 얇은 지질 필름 수화 방법의 프로토콜은 PALETS 배달 비히클 DSPE 리포솜을 생성하는 지질 용해시키고, 클로로포름으로 혼합했다 :. 건조한 지질 필름을 생성 증발시켜 메탄올 용액. 건조 지질 필름은 다중 층 소포 (MLVs)을 만들 1X PBS에 재현 탁 하였다. MLVs는 균일 LUVs를 생성하기 위해 압출기를 사용하여 크기가되었다. LUVs는 다음 서스펜션에 사용, 또는 단일 사용 분량 씩 동결 건조 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :에 siRNA를 캡슐화 효율 DSPE PALETS 유 노래 프로타민 황산염. (A) siRNA를 약 60-65%는 프로타민의 첨가없이 캡슐화 하였다. 1, 1.5 : 1 프로타민 : siRNA의 비율 프로타민의 추가로 1 내지 90 %의 캡슐화 효율이 있었다. 캡슐화 된 siRNA의 5 ~ 10 %가 여과 액에서 발견 된 반면, (B) 모든 자유의 siRNA의 리포좀을 필터링 한 후, siRNA를 90 %는 리포좀 분획에서 발견되었다. (C) 프로타민과 리포좀은 솔루션은 캡슐화 된 siRNA를 무료입니다. siRNA를 약 60-65%은 프로타민을 사용하지 않고 DSPE 리포좀 내에 캡슐화시켰다. 186.2 ㎚의 농도로 프로타민을 사용하면, siRNA의 약 90 %가 DSPE 리포좀 내에 캡슐화시켰다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. ****는 <0.0001 P를 나타냅니다. *는 <0.01 P를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 뇌 세포 현탁액의 대표 유세포 분석 LSPCs와 치료 후 24 시간이 LSPCs는 야생형 마우스와 뇌의 꼬리 정맥에 주입하고 24 시간 후 수확 하였다. PBS는 처리 대조군으로 사용 하였다 및 PRP KO 마우스는 PRP C 농도에 대한 대조군으로 이용 하였다. LSPCs 처리 (A) 마우스는 야생형 PRP C 레벨을 표시하고 PBS 대조군에 비해 PRP C 농도의 유의 한 감소를 보였다. 쥐를 치료 LSPCs은 PRP KO 마우스에 가까운 PRP C 수준을 보였다. 동일한 24 시간 처리 프로토콜을 사용하는 3 개의 독립적 인 실험 (B)의 누적 데이터 PBS의 야생형에 PRP C의 상대적인 양을 보여 LSPCs 생쥐를 처리 하였다. 세 가지 실험의 맞은 편에, 마우스는 LSPCs의 웃음 치료PBS의 야생형 컨트롤에 비해 PRP C 수준이 크게 감소 결혼. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. ***는 <0.0003 P를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 보고서는 효율적으로 CNS에의 siRNA를 전송이 표적 전달 시스템을 만들 수있는 프로토콜을 설명합니다. 중추 신경계에의 siRNA를 전달하는 이전 방법은 뇌, 대상의 siRNA의 정맥 주사, 또는 비 대상 리포좀의 siRNA 복합체의 정맥 주사에 직접 siRNA를 /의 shRNA 벡터를 주입 포함되어 있습니다. 중추 신경계로의 siRNA / shRNA를 벡터의 주입은 목적 단백질의 발현 수준의 감소를 야기 않는다. 그러나, siRNA를 /의 shRNA는 CNS를 통해 자유롭게 확산되지 않습니다. 또한, 이러한 주사는 인접한 신경 조직 6-9 손상. 타겟팅 된 siRNA의 정맥 내 주사는 표적 단백질의 감소를 초래한다. 그러나, siRNA의 대부분은 혈액 단백질 (20)에 의해 분해된다. 마지막으로, 단핵 식세포 시스템 (21) 간 열화 내에 포획 된 siRNA의 불특정의 siRNA를 리포좀 복합체 결과 정맥 내 주사. siRNA의 전달상기 차량 LSPCs 및 PALETS는 CNS에 직접적으로 siRNA를 전달함으로써 이전의 방법보다 안전하고보다 효과적이고 효율적인 전달 시스템을 제공한다. LSPCs 및 PALETS 또한 CNS 다른 소분자 약물을 운반 할 수있다.
PALETS 또는 LSPCs 조립 후 몇 시간 이내에 사용하여야한다. 그렇지 않으면 성능 저하의 siRNA / 비 기능적이되는 우려가있다. 인터럽트를 중지 할 수있는 다른 중요한 단계 / 유세포 분석을위한 세포 현탁액을 제조하고 실행한다. 현탁액 분석 살아 있어야 생균을 함유하기 때문에 세포 현탁액을 제조 당일 유세포 분석기를 수행하는 것이 중요하다.
거기 LSPCs PALETS 또는 작은 분자 약물이 LSPCs 또는 PALETS에로드 내용에, 시험 관내 또는 생체 내에서 사용되는 여부에 따라 변경 될 수있는 프로토콜 내의 몇 단계는, 노동에atory 기본 설정. 우선, LSPCs PALETS 및 지질의 몰비는 다른 애플리케이션에 대해 최적화 될 수있다. 60 % 중량 / 중량 이상으로 사용될 때, 포스파티딜 에탄올 아민 (DSPE의 PE)은 수분을 제대로. 이러한 높은 농도로 사용되는 경우, DSPE 분자가 서로 응집 및 지질의 불용성 물질을 형성 할 것이다. 지질이 질량의 siRNA를 캡슐화 할 수 없습니다. N 2 가스를 사용할 수없는 경우, 지질 혼합물을 증발하여 건조 될 수있다. 증발시켜 3 일 정도 소요 의한 메탄올과 클로로포름의 사용 흄 후드에서 수행되어야한다. 이 프로토콜에서, 얇은 지질막 1X PBS로 재현 탁 있지만 다른 수화 버퍼로 재현 탁 될 수있다. 다른 버퍼는 물, 10 % 수 크로스 또는 다른 수성 완충액을 포함한다. 재수 버퍼의 선택은 리포솜의 용도에 의존하며 화제 22,23 리포솜 내에 캡슐화된다. 수화 버퍼 겔 LIQ 이상으로 유지되어야지질 또는 리포좀 UID 결정 전이 온도 (TC 또는 TM)는 재수 적절하지 않을 것이다. 전술 한 프로토콜에 현탁 리포좀 균일 한 압출기를 이용하여 크기가되었다. 그러나, 리포좀은 시린지 필터 나 초음파를 이용하여 크기가 정해질 수있다. 압출기에 사용되는 동일한 필터의 기공 크기는 주사기 필터로 사용될 수있다. 또한, 상기 리포좀 현탁액의 siRNA 용액으로 수화 한 후 크기를 조정할 수있다. 수화 공정 (미발표) 한 후 압출기에 의해 크기 그러나, 우리의 siRNA를 리포좀의 손실을 관찰 하였다.
PRP C의 생물학적 역할은 아직 알려져 있지 5이기 때문에, PRP C 농도를 감소시킴으로써 생성 된 어떤 악영향이있을 수있다. 프리온 단백질 결핍 마우스 개발하기 때문에, 행동, 나이는 보통 24, 이러한 해로운 효과가 눈에 띄게 분명 사소한 여부 것 중 하나 가능성이 높습니다. 또한, PRP의 siRNA의 최저 <SUP> C 발현은 완전히 lentivector의 RNAi (23)과는 달리, 단백질 발현을 폐지하고 바이러스 성 종양의 어떤 가능성을 완전히 되돌릴 수 없습니다.
전달 시스템과 제한 사항으로 인해 양이온 성 지질에 음이온 생물 세포막에 PALETS 및 LSPCs의 면역 원성의 흡수를 감소 등이 있습니다. LSPCs의 면역 원성이 관찰되면 PALETS 대안으로 사용될 수있다. 음이온 생물의 세포막에 음이온 PALETS의 감소 흡수는 양이온 PALETS를 사용하거나 양이온과 음이온 지질의 혼합물로 음이온 PALETS을 재구성함으로써 극복 할 수있다.
이 보고서에서 PrPC의 감소는 마우스에서 마우스에 크게 다릅니다. 이 변화는 다양한 요인에 기인 할 수있다 : siRNA와의 쥐 사이의 변형 생쥐에서 혈관의 직경이 작은, 또는 저하. 타고난 쥐의 사용은 마우스 간 변동의 대부분을 제거해야하지만, 변화도 항상 가능근친 마우스와. 또한, 마우스는 다른 동물 모델에 비해 매우 작은 혈관이있다. 따라서 마우스의 정맥 내로 대량 주입하는 것은 문제가 될 수있다. 우리는 PALETS 또는 LSPCs를 주입하기 전에 주사를 연습하는 것이 좋습니다. 그러나, 연습, 때때로 그것은 여전히 마우스로 PALETS / LSPCs의 모든 볼륨을 얻기 위해 주사 몇 소요되며, 정맥이 주사 중 어느 하나에 축소 할 수 있습니다. 다른 마우스 만 PALETS / LSPCs 볼륨의 75-90%을받을 수있는 반면 따라서, 하나의 마우스, PALETS / LSPCs의 모든 볼륨을받을 수 있습니다.
변화의 다른 가능한 소스는 혈청 단백질에 의해 순환 시간과의 siRNA의 저하를들 수있다. PALETS / LSPCS은 변화를 설명 할 수있는 또 다른 비교 한 마우스의 뇌에 도달하기 전에 더 이상 순환 수 있습니다. 우리는 LSPCs 위의 실험에서 쥐를 안락사 전에 24 시간 동안 순환하는 것을 허용했다. 순환 시간이 변화를 일으키는 경우, circul 증대24 시간 이상 ATION 시간은 약간의 변화를 줄여야합니다. 우리는 PALETS / LSPCs와 siRNA의 패키징에도의 siRNA 및 / 또는 전달 비히클의 열화의 가능성이 항상있다. 앞서 언급 한 바와 같이, 양이온 성 지질 다소 면역원이다. 혈액 내 면역 세포가 차량을 공격한다면, 다음 차량이 뇌에 전달하는 것이 더 오래 걸릴 것 또는 차량 성능이 저하 될 수 있습니다. PALETS을 음이온에 양이온 성 지질로 전환 양이온 성 지질을 사용하는 경우 느린 순환 시간 또는 저하를 줄일 수 있습니다.
RVG-9R 펩타이드는 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체를 포함하는 중추 신경계 내의 모든 셀에 LSPCs 및 PALETS를 전송합니다. 이 신경 세포 미세 아교 세포와 성상 세포 (26)가 모두 포함됩니다. PALETS 또는 LSPCs는 프리온 질환에 대한 효과적인 치료가 될하는 것은 프리온 병인에 기여하는 모든 세포를 대상으로하는 것이 중요하다. 신경 세포는 가장 PRP C를 포함 27,28 프리온의 확산에 기여하는 것을 돕는다. 세포 'PRP C 식을 신경 세포를 표적으로하고 감소시키는 것은 프리온 병인의 감소가 발생할 수 있습니다. 그러나 신경 세포는 프리온 질환에 기여하는 유일한 세포 유형하지 않습니다. 성상 세포는 프리온 (29, 30)의 복제에 연루되어있다. 따라서,뿐만 아니라 그것이 중요한 신경 세포를 대상으로뿐만 아니라 프리온 병인을 줄이기 위해 성상 세포를 대상으로하는 것입니다.
여기에 설명 된 전달 시스템은 질병 다양한 애플리케이션에 적합 할 것 다양한 최적화 전략 의무가있다. LSPCs 및 PALETS는 차량에게 단지 신경 퇴행성 질병 이상을 치료하는 가능성을 제공하는 CNS뿐만 아니라 siRNA의, 어떤 소분자 약물을 운반 할 수있다. PALETS 및 LSPCs는 영향을주는 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다차량에 장착 된 소형 분자 약물에 따라 뇌. 또한, 표적 펩타이드를 변경하면 배달 차량 대신 아세틸 콜린 수용체가있는 모든 세포의, 중추 신경계 내에서 세포의 특정 부분 집합에 작은 분자 약물을 전달하기 위해 허용 할 수 있습니다. PALETS 및 LSPCs는 CNS에 영향을주는 질환을 치료하는 소분자 약물 새로운,보다 효율적이고 유연한 전달 시스템을 나타낸다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
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