Introduction
Prionlar merkezi sinir sistemini etkileyen şiddetli nörodejeneratif hastalıklar bulunmaktadır. Prion hastalıkları PrP Res adlı bir enfeksiyon izomer normal hücresel prion proteininin, PrP C, hatalı katlanması sonucu. Bu hastalıklar, insanlarda 1-3 sığırlarda sünger formlu ineklerde ensefalopati, Scrapie koyun, Cervidlerin kronik halsizlik hastalığı- ve Creutzfeldt-Jakob hastalığı dahil olmak üzere türleri ve çeşitli etkiler. Prionlar sinaptik kaybı ile başlar ve vakuolizasyonu ilerleyen nörodejenerasyon, gliozis, nöron kaybı ve plak mevduat neden olur. En sonunda, 4 ayrı hayvan / ölümü ile sonuçlanır. Onlarca yıldır, araştırmacılar yavaş ya da prion hastalığın ilerlemesini durdurmak amacıyla bileşikler araştırdık. Bununla birlikte, araştırmacılar, başarılı bir tedavi veya etkili bir sistemik dağıtım aracı ya bulamadık.
Endojen PrP C ifadesi prion hastalıklarının 5 gelişimi için gereklidir Cı ifade, bir gecikme ya da hastalığın iyileştirilmesi neden olabilir. Çeşitli gruplar prion hastalığı PrP C ifadesi düzeylerinin rolünü araştırmak için fare beyin dokusu içine doğrudan shRNA ifade PrP C seviyelerinde düşme veya enjekte lentivectors ile transgenik fareler yarattı. Nöronal PrP C miktarını azaltarak bulundu Bu araştırmacılar prion hastalıklarının ilerleyici nevropatolojisi durdurulması sonuçlandı ve hayvanların 6-9 ömrü uzatılmış. Biz fare nöroblastom hücrelerinde 10 PrP Res temizlenmesi o PrP C siRNA tedavi sonuçlarını bildirmişlerdir. Bu çalışmalar, bu tür tedaviler, küçük müdahale edici RNA (siRNA) böler mRNA gibi PrP Cı ekspresyon seviyelerini azaltmak için yeterli Prion hastalıklarının ilerlemesini geciktirebilir düşündürmektedir. Bununla birlikte, Prion hastalıklarının incelenmiştir tedavilerin çoğunluğu pratik olmazdı şekilde teslim edildiBir klinik ortamda. Bu nedenle, bir siRNA tedavisi merkezi sinir sistemine, venöz içine verilen ve hedeflenen bir uygulama sistemiyle, ihtiyacı vardır.
Araştırmacılar, gen tedavi ürünleri için salıverme araçları olarak lipozomların kullanılmasını inceledik. Katyonik ve anyonik lipitler hem lipozomlar oluşturularak kullanılmaktadır. katyonik lipid ve DNA / RNA arasındaki yük farkı verimi arttırmak üzere sağlar, çünkü katyonik lipidler daha yaygın anyonik lipidler daha kullanılmaktadır. Katyonik lipidlerin diğer bir avantajı, diğer lipidler 11-14 daha kolay hücre zarlarını olmasıdır. Bununla birlikte, katyonik lipidler anyonik lipidler 13,14 daha immünojeniktir. Bu nedenle, araştırmacılar lipozomlarda lipitleri anyonik katyonik kullanarak kaymaya başlamıştır. Gen terapisi ürünler etkin bir şekilde bir DNA / RNA molekülleri 15-19 yoğunlaşır pozitif yüklü peptid protamin sülfat kullanılarak anyonik lipozomlara paketlenebilir. anyonik Lipi yanaDS katyonik lipidler onlar sirkülasyon süreleri artmış olabilir ve daha hayvan modellerinde 13,14 tolere edilebilir daha az bağışıklık vardır. Lipozomlar, lipozomlara bağlı peptidleri hedef kullanarak belirli dokulara hedeflenir. Nikotinik asetilkolin reseptörlerine bağlanan RVG-9R nöropeptid, CNS 17-20 kadar siRNA ve lipozomlar hedeflemek için kullanılmıştır.
Bu rapor bir protokol üç siRNA teslimat araçlar üretmek için, ve paketlemek ve nöronal hücrelerin (Şekil 1) siRNA teslim özetliyor. Lipozom siRNA peptit kompleksleri (LSPCs) siRNA ile lipozomlar oluşan ve peptidini hedefleme RVG-9R elektrostatik lipozomun dış yüzeyine bağlı. Peptit RVG-9r kovalent lipit PEG gruplarına bağlı olan, siRNA ve lipozom içinde kapsüllü protamin oluşan terapötik siRNA (PALETS) kapsüllü lipozom hitap etti. Aşağıdaki yöntemleri kullanarak LSPCs ve palet oluşturmak içinS PrP C siRNA tedavi veya büyük ölçüde prion hastalığı patoloji başlamasını geciktirmek için muazzam umut vaat nöronal hücrelerin% 90 e kadar PrP C ifadesini azaltır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fareler yetiştirilen ve Colorado State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokoller uyarınca Değerlendirmesi ve Lab Hayvan Bakım International, Akreditasyon Derneği tarafından akredite Lab Hayvan Kaynakları, muhafaza edilmiştir.
LSPCs hazırlanması 1.
- 1 DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonyum propan): LSPCs kolesterol oranı 1 kullanın. 1 kloroform: bir şişe içinde metanol çözeltisine 4 nmol lipozom hazırlanması için, DOTAP 2 nmol ve 1 10 ml kolesterol 2 nmol karıştırın.
- Bir çeker ocak içinde N2 gazı ile metanol çözeltisi: kloroform 9 ml buharlaştınn. Gaz olmadan gecede davlumbaz çözücü son 1 ml buharlaşır. Şişenin altındaki ince bir lipid film dikkate alınmalıdır.
- 55 ° C'ye kadar bir% 10 sukroz çözeltisi ısı 10 mi.
- /, Yavaş yavaş dk yani 1 ml ince lipid film üzerine ısıtılmış% 10 sukroz solüsyonu dökün ge ikenntly şişeyi dönen. lipit molekülleri jel sıvı fazda kalması için 55 ° C'de lipidler ile% 10 sukroz ve balon koruyun. çok katmanlı vezikül (MLV) oluşumu ile ve tekrar su ile sonuçlanır.
- lipidler lipozomlar boyutlandırma önce en az bir saat süreyle 55 ° C 'de rehidrate izin verin.
- 1.0 um filtre ile, üretici talimatlarına göre bir ekstruder araya veya boyutlandırma 1.0 um şırınga filtreleri kullanmak.
- 11 defa sıkıcıda şırınga birine ısıtıldı lipozom süspansiyonu 1 ml ilave edilir, ve iki şırınga arasında süspansiyon geçmektedir. Süspansiyon 11 geçer sonra başlayan şırınga daha ters şırınga olduğundan emin olun.
- Ebat lipozomlar daha 0.45 um ile, sonra 0.2 um filtreler büyük tek katmanlı veziküller (LUVler) üretir. kolay boyutlandırma için ısıtılmış lipozom süspansiyonu tutun.
- (4 20 uM 200 ul 4 nmol lipozom süspansiyonu (200 uM) 20 ul inkübenmol toplam) oda sıcaklığında 10 dakika için stok siRNA çözeltisi.
- 500 uM, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile siRNA / lipozom çözeltisi (40 nmol toplam) hazır RVG-9R çözeltisi 80 ul inkübe edin. LSPCs mümkün olduğu kadar kısa bir süre kullanılabilir olması gerekir, ancak hazırlandıktan sonra birkaç saat kadar kullanılabilir. hazırlandıktan sonra birkaç saat 4 ° C'de saklayın LSPCs.
PALETS 2. hazırlanması
- 40: DSPE'nin (1,2-distearoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin) ya da 5 mol oranı: kolesterol: DSPE-PEG veya DOTAP: kolesterol: DSPE-PEG PALETS için 55 kullanımı. 1 kloroform: bir şişe içinde metanol çözeltisine 4 nmol lipozom preparatı için DSPE ya DOTAP da 2.2 nmol, kolesterol 1.6 nmol, ve 2, 10 ml DSPE-PEG 0.2 nmol karıştırın.
- Aşama 1.1 ve yukarıdaki 1.2 de tarif edildiği gibi tam olarak lipozom süspansiyonu hazırlanır. 1 x PBS, 10 ml DSPE lipozomlar rehidrate 1 ml / dakika ekleme 75 ° C'ye kadar ısıtıldı. lipidler de 75 ° C'de rehydrate izin verboyutlandırma önce en az 1 saat.
- Boyut lipozom süspansiyonu tam olarak adım 1.6-1.8 açıklandığı.
- Pipet DOTAP DSPE lipozomlar sonra tek kullanımlık kısma 4 nmol (200 uM) lipozom süspansiyonları her birinin 20 ul boyutlu yapılmış ve bir tezgah üstü, dondurarak kurutma (Şekil 2) ile, 30 dakika boyunca liyofilize var.
- 20 uM DSPE PALETS lipozomlara kapsüllenecek olan siRNA, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile protamin sülfat 26.6 uM çözeltisi 1.4 ul (4 nmol toplam) hazır siRNA çözeltisi 200 ul inkübe edin.
- siRNA 4 nmol stok çözeltisinden 200 ul DOTAP PALETS lipozomlar rehidrate veya siRNA / protamin çözeltisi 201.4 ul DSPE PALETS lipozomlar rehidrate. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca lipozom / siRNA çözeltisi inkübe edin.
- Her iki DOTAP DSPE PALETS için lipozom / siRNA çözeltiye 60 mM 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC) çözeltisinin 10 ul ekle.
- Her iki DOTAP DSPE PALETS için lipozom / siRNA çözeltisine 150 mM N-hidroksi-(sülfo-NHS) çözeltisi 10 ul ekle.
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca siRNA / lipozom süspansiyonu ile EDC ve sülfo-NHS inkübe edin.
- 500 uM, oda sıcaklığında 10 dakika süre ile çözelti çapraz bağlama siRNA / lipozom (40 nmol toplam) hazır RVG-9R çözeltisi 80 ul inkübe edin.
NOT: EDC / sulfo-NHS PEG lipidler kovalent bağa RVG-9R sağlar. hazırlanması sonra birkaç saat içinde PALETS kullanın. hazırlandıktan sonra birkaç saat 4 ° C'de saklayın PALETS. - PALETS siRNA kapsülleme etkinliğini belirlemek için:
- önce ve protamin ve 260 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak lipozomlar ilave edildikten sonra siRNA'nın konsantrasyonu ölçümü.
- 50 kDa santrifüj filtre kullanarak lipozom / kapsüllü siRNA süspansiyon kapsülsüz siRNA Filtre. 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjleyin.
- konsantrasyonunu ölçmekkapsüllenmemiş filtre siRNA ve 260 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak retentat kapsüllenmiş siRNA'nın konsantrasyonu.
3. LSPCs ya PALETS olan farelere enjekte
- damarsal genişletmek için bir ısı lambası 5-10 dakika fareler Açığa.
- 2-3% isofluorane / oksijen ile fare anestezisi enjeksiyondan önce ve enjeksiyon sırasında 5-10 dakika akış. Hayvan artık ayakta ve solunuma bir ayak tutam yaparak yavaşladı zaman anesthetization onaylayın. kuyruk ven erişmek için kendi arkasında veya yanında fare yerleştirin. anestezi altında iken kurumasını önlemek için farenin gözleri veteriner merhem kullanın.
- / Wipe% 70 EtOH ile kuyruk sprey ve 26 G insülin şırınga kullanarak fare kuyruk damarından üzerine LSPCs veya PALETS 300 ul enjekte edilir. kuyruk damar içine enjekte distal başlayın ve damar çökmesi ya da kırılmalar eğer proksimale hareket ettirin.
- sternal yatma tutar kadar temiz bir kafes içinde fare yerleştirin. mo koymayınTamamen iyileşene kadar diğer kafes arkadaşları ile kullanın. Fareler 5 ila 15 dakika içinde geri gerekir. Bunlar, bir ısıtma yastığı veya kurtarma uzun sürerse vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi için bir ısı lambası altına yerleştirilebilir. Fareler aşırı ısınma karşı korumak için yakından izlenmelidir.
- Anestezi kapalı giyer sağlamak için enjeksiyondan sonra hayvan birkaç saat Monitör ve tedavi hiçbir kötü etkileri vardır. LSPCs veya PALETS en az 24 saat dönmesine izin verin.
Akım Sitometrisi aracılığıyla Protein Ekspresyonu 4. Analizi
- 15 dakika boyunca% 20 CO2 akış oranı ile farelerin öldürülür.
- makas kullanarak fare deri ve kafatası uzak keserek beynin yarım yarımkürede parçalara ayır. Peel uzakta yarım uzak maşa ya da makasla ucunu kullanarak kafatasından beyin yarıküre.
- FACS tampon 2.5 mi ile 40 mikron gözenekli bir hücre süzgecinden her fareden beyin basın yarım küre (1x, Bir şırınga pistonu ile bir Petri kabı PBS,% 1 fetal bovin serumu, 10 mM EDTA).
- FACS tampon ek 2,5 ml hücre süzgecinden ve Petri çanağı yıkayın. Buz üzerinde 15 ml konik bir tüp içinde tek bir hücre süspansiyonu koyun.
- Pipet 350 x g'de 5 dakika boyunca 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve santrifüj içine 5 ml'lik tek bir hücre süspansiyonu 100 ul. FACS tampon 1 ml süpernatan ve tekrar süspansiyon hücre pelletini atın. 5 dakika boyunca 350 xg'de Spin. FACS tampon başka bir 1 ml ile tekrarlayın. buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.
- 1 100 ul hücreleri inkübe: FACS tampon maddesi içinde 0.5 mg / ml sıçan anti-fare Fc Bloku 100 seyreltme, buz üzerinde 30-60 dakika karıştırıldı. Pelet ve adım 4.5 olarak hücreleri yıkayın. buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.
- 30-60 dakika boyunca buz üzerinde FACS tamponu içinde% 7 fare serumu fare PrP C'ye karşı bir 20 ug / ml fluoresan antikor, 100 ul hücre inkübe edin. Pelet ve adım 4.5 olarak hücreleri yıkayın. hücre süspansiyonu tutunbuzda.
- Pelet ve 1 dakika boyunca RBC liziz tamponu için 1 ml (1 x PBS, 155 mM NH4CI, 12 mM NaHCO 3, 0.1 mM EDTA) içinde hücrelerin yeniden askıya. Aşama 4.5 Topak ve FACS tamponu 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri. buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.
- Daha önce 10 açıklandığı gibi bir akış sitometresinin kullanarak PrP C ifadesini analiz edin. Kapı toplam hücre popülasyonunun hücreleri yaşıyor. Kapı PrP C + canlı hücre popülasyonundan gelen hücreler MFI (ortalama floresan yoğunluğu) belirlemek gerekmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
anyonik PALETS içinde siRNA encapsulation verimliliğini artırmak için, siRNA protamin ile karıştırıldı. 1 (Şekil 3A): 1 ila 2: siRNA En iyi protamin konsantrasyonunu belirlemek için, siRNA 1, protamin farklı konsantrasyonları ile karıştırılmıştır. protamin kullanılmadan anyonik lipozomlar içinde bir% 60-65 siRNA Kapsülleme verimliliği oluştu. Protaminin Örnekleri: 1'den 1.5: 1 ila siRNA molar oranları 1 (133-266 nM)% 80-90 siRNA kapsülleme vardı. 1.5 Yukarıdaki mol oranları 1 siRNA / protamin komplekslerinin çökeltilmesi ile sonuçlanmıştır. Bu çökelmiş kompleksler anyonik lipozomlar içine kapsüllenmiş değildi. siRNA Protaminin ilave edildikten sonra bağlı seyreltme siRNA konsantrasyonda hafif bir düşüş vardı; Bununla birlikte, konsantrasyon protamin eklenmesinden (Şekil 3B) sonra sabit kalmıştır. 50 kDa filtresi, siRNA% 90-95 lipozomlar süzüldükten sonrasiRNA% 5-10 süzüntüde 'serbest' iken, lipozom filtreden geçmeyen kısım ile ilişkilendirilmiştir. Hiçbir siRNA protamin veya lipozom sadece numune (Şekil 3C) saptandı.
in vivo LSPCs etkisini belirlemek için, vahşi tipli fare, 24 saat için LSPCs ile muamele edilmiştir. LSPCs ile muamele vahşi tip farelerin PrP Cı ekspresyon seviyeleri 1X PBS ile tedavi edilmiş farelerde ve PrP nakavt (KO PrP) farelerde (Şekil 4) ile karşılaştırılmıştır. LSPCs ile tedavi edilen farelerin beyinlerinde PrP C akış sitometrik analizi PrP C seviyelerinde bir düşüş göstermiştir (Şekil 4A ve 4B). Bir deney içinde, tüm fareler, PrP KO farelerde (Şekil 4A) gözlendi PrP Cı seviyesine yakın PrP C seviyelerinin% 80-90 azalma vardı. Iki bağımsız deneyde LSPCs ile tedavi edilen farelerde PrP ° C'lik bir% 40-80 azalma <gösterdi/ sup> düzeyleri (Şekil 4B). Toplam LSPCs dışında (n = 14) ile tedavi edilen farelerin, sadece bir fare LSPCs hiçbir yanıt vardı oldu.
Şekil 1:. PALETS / LSPCs oluşturun ve Fareler MSS ile İntravenöz siRNA sunun Protokol Genel Bakış Lipozomlar ince lipid filmi hidrasyon yöntemi ile oluşturulmuştur. PrP Cı siRNA daha sonra bir elektrostatik etkileşim yoluyla ya da kapsülleme yoluyla lipozomlara tutturuldu. PALETS ya LSPCs CNS hedef peptid RVG-9R ilavesiyle tamamlanmıştır. Montajdan sonra, PALETS / LSPCs farelerin kuyruk venleri içine enjekte edilmiştir ve 24 saat tedavi sonrası PrP C ifadesi sitometri. Akış yoluyla değerlendirildi , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: İnce lipid film Hidrasyon yöntemi Protokol PALETS verici vasıta için DSPE Lipozomlar oluşturmak için lipitler çözündürüldü ve kloroform içinde karıştırılmıştır. Kuru lipid filmi oluşturmak için buharlaştınldı metanol çözeltisi. Kuru lipid filmi çok katmanlı veziküller (MLV) oluşturmak için 1 x PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiştir. MLVlerin daha sonra muntazam luvs oluşturmak için bir ekstrüzyon presini kullanarak boyutlandırılmıştır. Luvs sonra süspansiyon kullanılan, ya da tek kullanımlık alikotları liyofilize edilebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: içine siRNA Kapsülleme Verimliliği DSPE PALETS u Şarkı Protamin sülfat (A). siRNA yaklaşık% 60-65 protamin eklenmeyen kapsül haline getirilmiştir. 1 ve 1.5: 1: protamin: siRNA oranı protamin eklenmesiyle 1 ila% 90 Kapsülleme verimliliği oldu. Kapsüllenmemiş siRNA% 5-10 filtre bulundu ise (B) herhangi bir serbest siRNA gelen lipozomlar üzerinden süzüldükten sonra, siRNA% 90, lipozomal bir fraksiyon halinde bulunmuştur. (C) Protamin ve lipozom sadece çözüm kapsüllü SiRNA ücretsizdir. siRNA yaklaşık% 60-65 protamin kullanılmadan DSPE Lipozomlar içinde kapsül haline getirilmiştir. 186.2 nM bir konsantrasyonda protamin kullanımı ile, siRNA yaklaşık% 90, DSPE lipozomlar içinde kapsül haline getirilmiştir. Hata çubukları SEM'i göstermektedir. **** P <0.0001 gösterir. * P <0.01 gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Beyin hücre süspansiyonları Örnek akış sitometrik analizi LSPCs ile muamele edildikten sonra 24 saat LSPCs vahşi tipli fare ve beyinleri kuyruk venleri içine enjekte edilmiştir 24 saat sonra hasat edilmiştir. PBS tedavi kontrol olarak kullanılmıştır, ve PrP KO fare PrP Cı seviyeleri için bir kontrol olarak kullanıldı. LSPCs ile tedavi (A) Fare vahşi tip PrP C seviyelerini gösterir PBS kontrolüne kıyasla PrP C düzeylerinde önemli bir azalma göstermiştir. Fareler tedavi LSPCs bir PrP KO fare buna yakın PrP C düzeylerini gösterdi. Aynı 24 saat tedavi protokolü kullanılarak, üç bağımsız deneyin (B) toplu veri PBS vahşi tip PrP C nispi miktarını gösteren ve LSPCs fareler işlemden geçirildi. Üç deneyde fareler LSPCs Sho ile işlemden geçirildiPBS yabani tipteki kontroller ile karşılaştırıldığında, PrP C seviyelerinde önemli azalmalar evli. Hata çubukları SEM'i göstermektedir. *** <0.0003 P gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu rapor verimli MSS için siRNA taşımaları iki hedeflenmiş dağıtım sistemleri oluşturmak için bir protokol açıklar. CNS siRNA teslim önceki yöntemler beyin, hedeflenen siRNA intravenöz enjeksiyon veya hedefli olmayan lipozom siRNA kompleksi intravenöz enjeksiyon doğrudan siRNA / shRNA enjekte vektörler dahildir. CNS'ye siRNA / shRNA vektörlerinin enjeksiyon hedef protein sentezleme seviyelerinde bir düşüşe neden yoktur. Bununla birlikte, siRNA / shRNA CNS serbestçe nüfuz etmez. Bundan başka, bu enjeksiyonlar bitişik sinir dokusu 6-9 hasara neden olur. hedeflenen siRNA, damar içine enjeksiyon, hedef proteinin azaltılması ile sonuçlanır. Ancak, SiRNA çoğu serum proteinleri 20 tarafından parçalanır. Son olarak,, mononükleer fagosit sisteminin 21 ile karaciğer ve bozulma olan siRNA tutulmasıyla hedeflenmemiş lipozom siRNA Kompleksi venöz içine enjekte edilmesi. siRNA taşıyıcıYukarıda tarif edilen araçlar, LSPCs ve PALETS, merkezi sinir sistemine doğrudan siRNA sağlayarak daha önceki yöntemlere göre daha güvenli, daha etkili ve verimli bir dağıtım sistemi sağlar. LSPCs ve PALETS da merkezi sinir sistemine diğer küçük moleküllü ilaçlar taşıma yeteneğine sahiptirler.
PALETS ya LSPCs monte edildikten sonra bir kaç saat içinde kullanılmalıdır. Aksi takdirde, siRNA bozulmuş / işlevsel olmayan olma riski vardır. kesintiye durdurulamaz diğer kritik adım / flow sitometri için hücre süspansiyonu hazırlanması ve çalışıyor. Süspansiyon analizi için canlı olması gerekir, canlı hücreleri içerir, çünkü hücre süspansiyonu hazırlanır, aynı gün flow sitometri yapılması önemlidir.
Orada LSPCs ya PALETS, küçük moleküllü ilaç LSPCs ya PALETS yüklenir ne in vitro veya in vivo olarak kullanılacak bağlı olarak değiştirilebilir protokol olan birkaç adım ve işçilikatory tercihi. İlk olarak, LSPCs ve PALETS lipid mol oranları, diğer uygulamalar için optimize edilebilir. % 60 ağırlık / ağırlık veya daha yüksek kullanıldığında Ancak, fosfatidiletanolamin (DSPE'nin PE) kötü nemlendirir. Bu daha yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, DSPE molekülleri birbirleriyle bir araya ve lipid çözünmeyen bir kütle oluşturacak. lipidlerin Bu kitle siRNA saklanması mümkün değildir. N2 gazı mevcut değilse, lipit karışımı buharlaştırma ile kurutulur. Buharlaştırma yaklaşık 3 gün sürer, ve bağlı metanol ve kloroform kullanımına bir çeker ocak içinde yapılmalıdır. Bu protokol, ince lipid filmi 1X PBS ile yeniden süspanse edildi, ancak, aynı zamanda, diğer hidrasyon tampon ile yeniden süspanse edilebilir. Diğer tamponlar su,% 10 sukroz, veya diğer herhangi bir sulu tampon olabilir. Rehidrasyon tamponu seçimi lipozomlar kullanım amacına bağlı olup, madde, lipozom 22,23 içinde kapsüllenmektedir. hidrasyon tampon jel liq yukarıda tutulmalıdırlipidlerin veya lipozomların kimliği kristal geçiş sıcaklığı (Tc veya Tm) düzgün rehydrate olmaz. anlatılan protokolde, süspansiyon lipozomlar homojen bir kalıp kullanılarak boyutlandırılmıştır. Bununla birlikte, lipozomlar da şırınga filtreleri ve sonikasyon kullanılarak boyutlandırılabilir. ekstrüzyon için kullanılan aynı filtre gözenek boyutları şırınga filtreleri olarak kullanılabilir. Ayrıca, lipozom süspansiyon siRNA çözeltisi ile hidrasyon sonra yeniden boyutlandırılabilir. Hidrasyon aşama (yayınlanmamış veriler) sonra, ekstrüder ile boyutta, ancak biz lipozomlardan siRNA bir kayıp gözlendi.
PrP C biyolojik rolü henüz 5 anlaşılamamıştır olduğundan, PrP Cı düzeylerini azaltarak tarafından üretilen bazı zararlı etkileri olabileceği mümkündür. Prion proteini eksikliği olan farelerde geliştirmek Ancak, davranmaya ve yaş normalde 24, bu zararlı etkilerin gözle görülemeyecek küçük ya da değil olurdu ya olasıdır. Ayrıca, PrP'nin siRNA demonte <sup> C ifadesi tamamen Lentivector RNAi 23 farklı protein ifadesini ortadan kaldırmak ve viral onkogenezde imkanı yoktur tamamen tersine çevrilebilir olmaz.
dağıtım sistemlerine ilişkin sınırlamalar nedeniyle katyonik lipidler anyonik biyolojik membranlar PALETS ve LSPCs immünojenite alımını azaltılmasıdır. LSPCs immünojenisitesi gözlenirse, PALETS alternatif olarak kullanılabilir. Anyonik biyolojik membranlar anyonik PALETS azalma alımı, katyonik PALETS kullanarak veya katyonik ve anyonik lipid karışımı ile anyonik PALETS yeniden formüle aşılabilir.
Bu raporda, PrPC azaltılması fare fare yaygın olarak değişir. Bu değişim, çeşitli faktörlere bağlı olabilir: siRNA'nın fareleri arasındaki farklılıklar, farelerde damarların küçük çaplı ya da bozulması. kendilenmiş farelerin kullanılması farelerin arasında değişkenlik çok ortadan kaldırmak gerekir, ama varyasyon bile her zaman mümküninbred fareler. Ayrıca, fareler, diğer hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında çok küçük damarlar var. Yani, farelerin damarlarına büyük bir ses enjekte sorunlu olabilir. Biz PALETS veya LSPCs enjekte denemeden önce enjeksiyonları pratik öneririz. Ancak, hatta uygulama ile, bazen de fare içine PALETS / LSPCs tüm hacmi elde etmek için enjeksiyonlar bir çift alır ve ven bu enjeksiyonların herhangi birinde çökebilir. Başka bir farenin sadece PALETS / LSPCs hacminin 75-90% alabilirsiniz oysa Yani, bir fare, PALETS / LSPCs tüm hacmini alabilirsiniz.
varyasyon Diğer olası kaynakları serum proteinlerinin tarafından dolaşım süresi ve siRNA bozulmasını içerir. PALETS / LSPCS varyasyonu açıklayabilir başka karşılaştırıldığında bir fare beyin, ulaşmadan önce uzun sirküle olabilir. Sadece LSPCs Yukarıdaki deneyde fareler ötenazi edilmeden önce, 24 saat için dolaşmaya bırakılmıştır. dolaşım süresi varyasyonu neden oluyorsa, o zaman Sirkülasyon artan24 saat ötesine tirme süresi bazı varyasyonu azaltmak gerekir. Biz PALETS / LSPCs ile siRNA paket olsa da, siRNA ve / veya teslimat araçlarının bozulması olasılığı her zaman vardır. Daha önce belirtildiği gibi, katyonik lipidler biraz immünojeniktir. kan içinde bağışıklık hücreleri araçlarına saldırıyor Yani eğer, o zaman araçlar beyne iletilmesi için daha uzun sürer veya araçlar bozulmuş haline gelebilir. PALETS anyonik katyonik lipidler geçiş katyonik lipidler kullanırken yavaş dolaşım süresi veya bozulmasını azaltmaya yardımcı olabilir.
RVG-9r peptid nikotinik asetilkolin reseptörlerini içeren CNS içinde herhangi bir hücreye LSPCs ve PALETS taşır. Bu nöronal hücrelerin mikroglial hücreleri ve astrositler 26 içerir. PALETS ya LSPCs prion hastalıkları için etkili bir tedavi olduğu için, prion patogenezine katkıda bulunan tüm hedef hücrelere önemlidir. Nöronal hücrelerin en PrP C içeren 27,28 boyunca prion yayılmasını katkıda yardımcı olur. Hücrelerin PrP C ifadesi nöronal hücreleri hedef ve azaltılması prion patogenezinde bir azalmaya neden olabilir. Ancak nöron hücreler prion hastalığına neden Sadece hücre tipi değildir. Astrositler prion 29,30 replikasyonu implike edilmiştir. Bu nedenle, sadece önemli nöronal hedef hücrelere değil, aynı zamanda prion patogenezi azaltmak için astrositleri hedef etmektir.
Burada tarif edilen uygulama sistemleri hastalığı geniş bir uygulama aralığı için uygun hale olacak çeşitli iyileştirme stratejileri için uygun. LSPCs ve PALETS araç az nörodejeneratif hastalıklardan daha fazla tedavi etmek için bir potansiyele göre merkezi sinir sistemi değil, sadece siRNA, herhangi bir küçük moleküllü ilaç taşıma yeteneğine sahiptirler. PALETS ve LSPCs etkileyen herhangi bir hastalığı tedavi etmek için kullanılabiliraraçlara yüklenen küçük moleküllü ilaç bağlı beyin. Ayrıca, hedef peptid değişen teslimat araçları yerine asetilkolin reseptörlerini olan herhangi bir hücrenin, merkezi sinir sistemi içindeki hücrelerin belirli bir alt kümesiyle küçük moleküllü ilaçların teslim izin verebilir. PALETS ve LSPCs merkezi sinir sistemini etkileyen hastalıkları tedavi etmek için, küçük moleküllü ilaçlar için yeni, daha verimli ve esnek dağıtım sistemi temsil etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M.
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
