Introduction
朊病毒是影响中枢神经系统严重的神经退行性疾病。朊病毒病从正常细胞朊病毒蛋白，朊蛋白C的错误折叠通过所谓的PrP res的传染性异构体造成的。这些疾病影响的各种物种包括牛的牛海绵状脑病，羊瘙痒病绵羊，在cervids慢性消耗性疾病，和Creutzfeldt-Jakob病中的人类1-3。朊病毒引起神经退行性变与突触丧失开始，发展到空泡化，胶质细胞增生，神经元丢失和斑块沉积。最终，导致动物/个体4的死亡。几十年来，研究人员已经调查了旨在减缓或阻止朊病毒疾病的进展的化合物。然而，研究人员还没有发现任何一个成功的治疗或有效的全身递送载体。
内源性的PrP C表达式所需的朊病 毒疾病5的开发C的表达可能导致延迟或疾病的改善。几个研究小组创建了转基因小鼠直接表达shRNA的进鼠脑组织调查朊蛋白C的表达水平的朊病 毒疾病中的作用朊蛋白的C水平降低或注射lentivectors。发现减少的神经元的PrP C量这些研究导致停止朊病毒病的渐进的神经病理学和延长了动物6-9的寿命。我们已经报道了在小鼠神经母细胞瘤10朊蛋白的Res间隙的朊蛋白C小干扰治疗效果。这些研究表明，使用的疗法以降低朊病毒C表达式水平，如小干扰RNA（siRNA），其裂解的mRNA，可以充分地延迟朊病毒病的进展。然而，研究了朊病毒病大多数治疗的方式，是不实际交付在临床环境中。因此，siRNA的治疗需要全身递送系统，该系统通过静脉内递送并靶向中枢神经系统。
研究者已经研究了使用脂质体作为递送媒介物的基因治疗产品。阳离子和阴离子脂质都在脂质体的形成中使用。阳离子脂质比阴离子脂质更广泛地使用，因为阳离子脂质和DNA / RNA之间的电荷差允许有效的包装。阳离子脂质的另一个优点是，它们更容易穿过细胞膜比其它脂质11-14。然而，阳离子脂质是比阴离子脂质13,14更具免疫原性。因此，研究人员已经开始使用阳离子和阴离子脂质体脂肪移位。基因治疗产品可以有效地包装成使用带正电荷的肽鱼精蛋白硫酸盐，其中凝结的DNA / RNA分子15-19阴离子脂质体。由于阴离子梨皮DS比阳离子脂质它们可能增加循环时间，并且可以在动物模型13,14被更耐受的免疫原性更低。脂质体定位到使用定位附加到脂质体肽的特异性的组织。使RVG-9R神经肽，其结合烟碱乙酰胆碱受体，已被用于靶向siRNA和脂质体至CNS 17-20。
这个报告概述的协议以产生三个siRNA递送车辆，打包和递送的siRNA神经元细胞（ 图1）。脂质体的siRNA肽复合物（LSPCs）由用siRNA脂质体和RVG-9R靶向肽静电连接于脂质体的外表面。肽处理脂质体包封的治疗性的siRNA（PALETS）由siRNA和鱼精蛋白在脂质体中包封的，具有RVG-9R共价结合到脂质的PEG基团。使用以下方法来生成LSPCs和PALETS，朊蛋白C小干扰降低朊蛋白C的表达高达神经细胞90％，其中蕴含着巨大的承诺治愈或基本延缓朊病毒疾病病理的发作。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有小鼠饲养，并保持在实验室动物资源，由协会进行评估和实验动物管理国际资格认证按照科罗拉多州立大学批准的机构动物护理和使用委员会认可的协议。
1. LSPCs的制备
- 使用1：1 DOTAP（1,2-二油酰基-3-三甲基铵 - 丙烷）：胆固醇比率LSPCs。对于4纳摩尔脂质体制剂，混合的DOTAP的2纳摩尔和2纳摩尔胆固醇入10毫升1：1的氯仿：在烧瓶中的甲醇溶液。
- 蒸发9毫升的氯仿：采用N 2气在通风橱中的甲醇溶液。蒸发最后1毫升溶剂在通风橱中过夜无气。观察在烧瓶的底部的薄的脂质膜。
- 一个10％的蔗糖溶液至55℃的热10毫升
- 倒入加热10％蔗糖溶液到薄脂质膜缓慢， 即 1毫升/分钟，而戈ntly漩烧瓶中。保持10％的蔗糖和烧瓶在55℃的脂质，使得脂质分子保留在凝胶 - 液体相。补液结果多层囊泡（MLV）形成。
- 允许脂质上浆脂质体之前在55℃下再水合为至少1小时。
- 组装按制造商的说明挤压机用1.0微米的过滤器，或使用1.0微米的注射器过滤器的大小。
- 将1ml加热脂质体悬浮液添加到挤压机中的注射器的一个，并通过两个注射器之间的悬浮液11倍。确保该悬浮液是在低于11道次后的起始注射器相反注射器。
- 大小脂质体再通过0.45微米那么0.2微米的过滤器来产生大单层囊泡（的LUV）。保持更容易上浆加热脂质体悬浮液。
- 孵育20微升4纳摩尔脂质体悬浮液（200μM）的用200μl20μM的（4纳摩尔总数）在室温下10分钟的库存siRNA溶液。
- 孵育80微升500μM的（40纳摩尔总）的股票与在RT 10分钟的siRNA /脂质体溶液RVG-9R溶液。 LSPCs应尽快用作可能的，但可以在制备后可用于高达几个小时。在4°C储存LSPCs准备几经小时。
2. PALETS的制备
- 使用55：40：要么DSPE（1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺）的5摩尔比：胆固醇：DSPE-PEG或DOTAP：胆固醇：DSPE-PEG为PALETS。对于4纳摩尔脂质体制剂，混合2.2纳摩尔或者DSPE或DOTAP的，胆固醇1.6纳摩尔，和0.2纳摩尔DSPE-PEG成10毫升2:1氯仿：在烧瓶中的甲醇溶液。
- 如在步骤1.1和1.2以上描述的确切制备脂质体悬浮液。再水合DSPE脂质体在10ml 1×PBS中加热到75℃，加入1毫升/分钟。允许脂质在75℃在补充水分上浆前至少1个小时。
- 大小的脂质体悬浮液完全按照步骤1.6-1.8中所述。
- 吸管20微升每4纳摩尔（200μM）脂质体悬浮液的进DOTAP和DSPE脂质体后单次使用的等分试样一直尺寸，和冻干为使用台式冷冻干燥器（ 图2）30分钟。
- 孵育200微升20μM的（4纳摩尔总）库存siRNA溶液与1.4微升在RT硫酸鱼精蛋白的26.6微米溶液10分钟，用于siRNA要被封装入DSPE PALETS脂质体的。
- 再水化DOTAP PALETS脂质体用200μl的siRNA 4纳摩尔原液或用201.4微升的siRNA /鱼精蛋白溶液的再水化DSPE PALETS脂质体。孵育脂质体/ siRNA溶液在室温下10分钟。
- 添加10微升60毫摩尔的1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶液到两个DOTAP和DSPE PALETS脂质体/ siRNA溶液。
- 加入10微升150毫摩尔N-羟基（硫代NHS）溶液到两个DOTAP和DSPE PALETS脂质体/ siRNA溶液。
- 孵育EDC和磺基-NHS与该siRNA /脂质体悬浮液在RT 2小时。
- 孵育80微升500微米（40毫微摩尔总数）股同的siRNA /脂质体交联在室温下10分钟的解决方案RVG-9R的解决方案。
注：EDC /磺基NHS允许RVG-9R以共价结合的PEG脂质。准备经过几次小时内使用PALETS。在4°C储存PALETS准备几经小时。 - 要确定PALETS的siRNA的包封率：
- 之前和在加入鱼精蛋白和使用分光光度计设定在260nm的脂质体后测量的siRNA的浓度。
- 使用50 kDa的离心过滤器的脂质体/封装的siRNA悬架过滤未封装的siRNA。离心在1000 xg离心20分钟。
- 测量的浓度在滤液未包封的siRNA和包封的siRNA在滞留物用分光光度计在260 nm处的浓度。
3.注射用LSPCs或PALETS小鼠
- 暴露5-10分钟小鼠热灯扩张血管。
- 麻醉鼠标采用了2-3％的异氟烷/氧流量注射前，和注射过程中5-10分钟。确认时，麻醉动物不再走动和呼吸都做一个脚趾捏放缓。放置在其背面或侧面的鼠标来访问尾静脉。使用鼠标的眼睛兽医药膏，以防止干燥时的麻醉下。
- 擦拭/用70％乙醇喷尾，并用＆G胰岛素注射器注入300微升LSPCs或PALETS的到鼠标的尾静脉。开始向远侧注入尾静脉，如果静脉塌陷或破裂近侧移动。
- 将鼠标在干净的笼子里，直到它保持胸骨斜卧。不要把莫与其他队友笼使用，直到它已完全恢复。小鼠应在5至15分钟，回收。它们可以被放置在一个加热垫或加热灯保持体温如果恢复时间较长下。小鼠应密切监测，以防止过热。
- 监测动物几个小时注射后，以确保麻醉消退，并有治疗没有不良影响。允许LSPCs或PALETS循环至少24小时。
4.通过流式细胞仪蛋白表达的分析
- 安乐死用20％CO 2的流量为15分钟的小鼠。
- 通过切开使用剪刀的小鼠的皮肤和颅骨解剖出脑的一半的半球。剥开一半大脑半球使用钳子或剪刀年底头骨之遥。
- 从每只小鼠脑的通过使用2.5 FACS缓冲液中的溶液40微米网状细胞过滤（按半个半球1倍的PBS，1％胎牛血清，10mM EDTA的）在培养皿中，用注射器的柱塞。
- 冲洗细胞过滤和培养皿一个额外的2.5毫升流式细胞仪缓冲。把单细胞悬浮液在冰上15毫升锥形管中。
- 吸管100微升5 ml单细胞悬液至1.5 ml微量离心管中并离心，在350×g下5分钟。丢弃在1ml FACS缓冲液的上清，重悬细胞沉淀。旋在350×g离心5分钟。与再过1毫升流式细胞仪缓冲的重复。置于冰上的细胞悬液。
- 孵育细胞在100μl的1：100稀释在FACS缓冲液0.5毫克/毫升的大鼠抗小鼠Fc块在冰上30-60分钟。沉淀和洗涤细胞如在步骤4.5。置于冰上的细胞悬液。
- 孵育于100μl20μg/ ml的荧光抗小鼠朊病毒下在FACS缓冲液在冰上抗体在7％小鼠血清的细胞30-60分钟。沉淀和洗涤细胞如在步骤4.5。保持细胞悬浮液在冰上。
- 沉淀和再悬浮细胞于1ml RBC裂解缓冲液（1×PBS中，155毫摩尔氯化铵 ，12毫碳酸氢钠 ，0.1毫摩尔EDTA）处理1分钟。粒料如在步骤4.5和重悬细胞于1ml FACS缓冲液中。置于冰上的细胞悬液。
- 使用流式细胞仪如前面所述10 PrP的分析C的表达。门从住总细胞群的细胞。门的PrP C +活细胞群的细胞，以确定MFI（平均荧光强度）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
以增加的siRNA包封的阴离子PALETS内的效率，所述siRNA与鱼精蛋白混合。以确定用于所述siRNA最好鱼精蛋白浓度，所述siRNA用不同浓度的鱼精蛋白混合，从1：1到2：1（ 图3A）。有阴离子脂质体60-65％的siRNA包封率，而无需使用鱼精蛋白。样品鱼精蛋白：siRNA的摩尔比从1：1到1.5：1（133-266纳米）有80〜90％的siRNA包封。摩尔比大于1.5：1导致的siRNA /鱼精蛋白复合物的沉淀。这些沉淀物不能被封装成阴离子脂质体。在加入鱼精蛋白与siRNA后有在所述siRNA的浓度略有下降，由于稀释;然而，该浓度在加入鱼精蛋白（ 图3B）后保持稳定。用50 kDa的过滤器，所述siRNA的90-95％过滤的脂质体后用脂质体滞留相关联，而siRNA的5-10％在滤液中“自由”。鱼精蛋白或脂质体仅样品（ 图3C）在没有检测到的siRNA。
为了确定在体内LSPCs的效果，野生型小鼠用LSPCs处理24小时。与LSPCs治疗野生型小鼠的朊病 毒C的表达水平进行比较，以用1×PBS处理的小鼠和朊病毒敲除（朊病毒KO）小鼠（ 图4）。流动的PrP 的C术分析与LSPCs处理的小鼠的大脑表现出的PrP C水平的降低（ 图4A和4B）。在一项实验中，所有小鼠减少了80-90％的PrP C水平，接近了朊蛋白基因敲除小鼠（ 图4A）中观察到的PrP C水平。与LSPCs在两个独立的实验治疗的小鼠表现出朊蛋白的C降低40-80％</ SUP>水平（ 图4B）。在总共LSPCs的治疗的小鼠（n = 14），只有一个鼠标不得不将LSPCs没有反应。
图1：议定书生成PALETS / LSPCs和静脉内递送的siRNA的小鼠的CNS的概述经由薄脂质膜水合方法生成的脂质体。然后将PRP C小干扰要么通过静电相互作用或通过包封附着到脂质体中。所述PALETS或LSPCs通过加入在CNS靶向肽RVG-9R的完成。组装后，PALETS / LSPCs注射入小鼠尾静脉，治疗后24小时的PrP C的表达是通过流流式细胞仪进行评估。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：脂质薄膜水合方法的协议来产生DSPE脂质体为PALETS运载工具脂质溶解并在氯仿混合：甲醇溶液，将其蒸发，以产生干燥的脂质膜。干燥的脂质膜再悬浮于1×PBS中以创建多层囊泡（MLV的）。 MLV的随后均匀地使用挤出机来产生的LUV尺寸。该可以的LUV中的悬浮液中使用，或在单次使用分装冻干。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 的siRNA包封效率乙醇胺PALETSū唱硫酸鱼精蛋白（A）约60-65％siRNA的包封不加入鱼精蛋白。通过加入鱼精蛋白，有1之间的90％的包封效率：1和1.5：1的鱼精蛋白：siRNA的比率。 （B）中滤除任何自由siRNA的脂质体后，90％的siRNA的中脂质体级分中发现的，而未包封的siRNA 5-10％在滤液中发现。 （C），鱼精蛋白和脂质体唯一的解决方案是免费的封装的siRNA。约60-65％的siRNA被DSPE脂质体包裹内没有使用鱼精蛋白。用在186.2 1nM的浓度使用鱼精蛋白，siRNA的大约90％的乙醇胺脂质体内包封。误差棒表示SEM。 ****表示P <0.0001。 *表示P <0.01。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4： 脑细胞悬浮液代表流式细胞仪分析处理后24小时与LSPCs LSPCs注入野生型小鼠和大脑的尾静脉收获24小时后。 PBS被用作治疗控制和朊病毒KO小鼠用作朊病毒C水平的控制。 （A）和LSPCs处理的小鼠表现出的PrP C水平的显著下降相比PBS对照，其示出野生型的PrP C水平。处理的小鼠的LSPCs显示接近于朊病毒KO小鼠的PrP C水平。从使用相同的24小时的治疗方案三个独立实验（B）的累积的数据显示的PrP C的相对量在PBS野生型和LSPCs处理的小鼠。跨越三个实验，小鼠LSPCs笑处理相比PBS野生型控制在结婚的PrP C水平显著下降。误差棒表示SEM。 ***表示P <0.0003。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这份报告描述了一个协议，创建高效的siRNA输送至CNS 2靶向递送系统。递送的siRNA至CNS的以前的方法包括直接注射的siRNA / shRNA的载体入脑，靶向siRNA的静脉注射，或非靶向脂质体的siRNA复合物的静脉注射。的siRNA / shRNA的载体进入中枢神经系统的注射却引起靶蛋白表达水平下降。然而，所述siRNA / shRNA的不能自由通过中枢神经系统扩散。另外，这些注射导致对邻近的神经组织6-9的损伤。靶向siRNA的有静脉注射还导致减少靶蛋白。然而，大多数的siRNA是由血清蛋白20降解。最后，在siRNA的肝脏和降解通过单核吞噬细胞系统21内的包封非靶向脂质体siRNA复合结果静脉注射。该siRNA传递上述车辆，LSPCs和PALETS，通过直接提供的siRNA到中枢神经系统提供更安全，更有效，更高效的传递系统比以前的方法。该LSPCs和PALETS也能将其它小分子药物的中枢神经系统。
PALETS或LSPCs应当在几个小时内组装后使用。否则有可能的siRNA的成为非功能/降级的风险。不能停止其他关键的一步/中断是细胞悬液，流式细胞仪的准备和运行。在该细胞悬浮液制备当天流式细胞进行流量是很重要的，因为该悬浮液包含需要是存活分析活细胞。
存在可以根据是否在LSPCs或PALETS将在体外或体内使用，什么小分子药物装入LSPCs或PALETS改变在协议中的几个步骤，和有关劳动atory偏好。第一，LSPCs和PALETS的脂质的摩尔比可用于其它应用进行优化。然而，在60％重量/重量或更高时使用磷脂酰乙醇胺（DSPE在PE）不佳水合物。当在这些较高的浓度下使用，DSPE分子将相互聚集并形成脂质的不溶性物质。脂质的该质量是不能够封装的siRNA。如果N 2气不可用，所述脂质混合物可以用蒸发来干燥。蒸发需要约3天，并应在通风橱由于使用甲醇和氯仿来进行。在这个协议中，薄的脂质膜再悬浮用1×PBS，但它也可以与其它水合缓冲剂重悬。其它缓冲剂包括水，10％蔗糖，或任何其他水性缓冲液。再水化缓冲液的选择是依赖于预期用途的脂质体和代理被封装在脂质体22,23内。水合缓冲区应保持胶LIQ以上在脂质或脂质体的流体晶体转变温度（Tc或Tm）为将不能正确再水化。在所描述的协议中，悬浮的脂质体用挤出机均匀尺寸。然而，脂质体还可以使用注射器过滤器或超声处理的尺寸。用于挤出机相同的过滤器的孔径可以用作注射器过滤器。另外，脂质体悬浮液可以与siRNA溶液水合后的大小。然而，当由挤出机中的水合步骤（未公布的数据）后的大小，我们观察到从脂质体的siRNA的损失。
因为朊病毒C的生物学作用尚不了解5，有可能，有可能是通过减少的PrP C水平产生一些不利影响。但是，因为朊病毒蛋白缺陷的小鼠发展，表现和年龄通常24，它很可能是这些有害作用要么是轻微或没有明显显现。此外，朊蛋白的siRNA敲除<SUP> C的表达不会完全取消蛋白的表达，是一个没有病毒癌变的可能完全可逆，不像慢病毒RNA干扰23。
与输送系统的局限性包括阴离子PALETS成生物膜，并LSPCs的免疫原性的摄取减少由于阳离子脂质。如果观察到的LSPCs的免疫原性，PALETS可以使用作为替代。阴离子PALETS成阴离子生物膜的减少摄取可以通过使用阳离子PALETS，或通过重新组织阴离子PALETS用阳离子和阴离子脂质的混合物来克服。
在这份报告中，中的PrPC减少差别很大鼠标鼠标。该变化可能是由于多种因素：siRNA的降解的小鼠之间的差异，静脉的小鼠小直径，或。使用近交系小鼠的应消除多小鼠之间的变异性，但变化总是可能的，即使用近交系小鼠。另外，相对于其它的动物模型小鼠具有非常小静脉。所以，注入大量注入小鼠的静脉可能会有问题。试图注入PALETS或LSPCs建议先练习注射。然而，即使使用的做法，有时它仍然需要几个注射以获得PALETS / LSPCs的所有卷到小鼠，和静脉可以在这些注射中的任一项崩溃。所以，一个鼠标可能会收到PALETS / LSPCs所有的音量，而另一个鼠标可能只收到PALETS / LSPCs量的75-90％。
变异的其他可能来源包括血清蛋白的循环时间和siRNA的降解。到达在一只小鼠大脑相比另一个，这可以解释的变化前的PALETS / LSPCS可能循环更长的时间。我们只允许LSPCs在上述实验实施安乐死的小鼠前循环24小时。如果循环时间引起的变化，然后增加circul通货膨胀的时间超过24小时应减少一些变化。尽管我们用PALETS / LSPCs打包的siRNA，总是有siRNA和/或运载工具降级的可能性。如前面提到的，阳离子脂质是略微免疫原性的。因此，如果在血液中免疫细胞攻击车辆，那么它会为车辆要递送至脑需要更长的时间或车辆可能变得劣化。从阳离子脂质切换到阴离子PALETS可能有助于使用阳离子脂质减少时慢循环时间或降解。
该RVG-9R肽运LSPCs和PALETS到包含烟碱型乙酰胆碱受体中枢神经系统内的任意单元格。这包括神经元细胞小胶质细胞和星形胶质细胞26。对于PALETS或LSPCs是一种有效的治疗朊病毒病它定位有助于朊病毒致病所有细胞是重要的。神经细胞包含最Ç朊27,28有助于朊病毒的蔓延。靶向神经元细胞和减少细胞的朊病 毒C的表达可能导致朊病毒致病的降低。然而，神经元细胞是不有助于朊病毒疾病的唯一细胞类型。星形胶质细胞有牵连的朊病 毒29,30的复制。因此，不仅是重要的目标神经元细胞，而且还针对星形胶质细胞，减少发病朊病毒。
此处所描述的递送系统是适合于各种优化策略，这将使它们适于广泛的疾病的应用。 LSPCs和PALETS是能够传输的任何小分子药物到中枢神经系统，而不仅仅是的siRNA，这给车辆以治疗不仅仅是神经变性疾病更的潜力。 PALETS和LSPCs可用于治疗影响的任何疾病大脑取决于装载到车辆的小分子药物。此外，更改靶向肽可能允许运载工具到小分子药物递送至CNS内的细胞的特定子集，而不是在具有乙酰胆碱受体的任何细胞。 PALETS和LSPCs代表用于小分子药物的新型，更有效的和灵活的递送系统以治疗影响CNS疾病。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M.
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
