Summary
Vi præsenterer en protokol for den funktionelle vurdering af omfattende single-site mætning mutagenese biblioteker af proteiner udnytte high-throughput sekventering. Vigtigere er det, denne fremgangsmåde bruger ortogonale primerpar at multiplekse bibliotekskonstruktion og sekventering. Repræsentative resultater ved hjælp af TEM-1 β-lactamase valgt på en klinisk relevant dosering af ampicillin leveres.
Introduction
Mutagenese har længe været anvendt i laboratoriet for at undersøge egenskaberne af biologiske systemer og deres udvikling, og at producere mutantproteiner eller organismer med forbedrede eller nye egenskaber. Mens tidlige tilgange påberåbt metoder som producerer tilfældige mutationer i organismer, fremkomsten af rekombinant DNA-teknologi aktiveret forskere til at introducere udvalgte ændringer DNA i et site-specifik måde, dvs.., Site-directed mutagenese 1,2. Med de nuværende teknikker, typisk under anvendelse af mutagene oligonukleotider i en polymerasekædereaktion (PCR), er det relativt facile at skabe og vurdere lille antal mutationer (f.eks., Punktmutationer) i et givet gen 3,4. Det er langt sværere men når målet nærmer sig, for eksempel, oprettelse og vurdering af alle mulige single-site (eller højere orden) mutationer.
Mens meget er blevet lært af tidlige studier forsøger at vurdere et stort antal mutations i gener, de anvendte teknikker var ofte besværlig, f.eks kræver vurdering af hver mutation uafhængigt hjælp nonsens suppressorstammer 5-7, eller var begrænset i deres kvantitative evne skyldes den lave sekventering dybde Sanger sekventering 8. De anvendte teknikker i disse forsøg er stort set blevet fortrængt af fremgangsmåder under anvendelse af high-throughput sekventering teknologi 9-12. Disse begrebsmæssigt enkle metoder indebære oprettelse af et bibliotek omfattende et stort antal mutationer, underkaste biblioteket til en skærm eller selektion for funktion, og derefter dyb-sekventering (dvs.., I størrelsesordenen> 10 6 sekventering læser) biblioteket opnået før og efter selektion. På denne måde, de fænotypiske eller fitness virkninger af et stort antal mutationer, repræsenteret som ændringen i populationen frekvensen af hver mutant, kan vurderes samtidig, og mere kvantitativt.
Vi har tidligere indført en simp(. dvs, hel-protein mætningsmutagenese biblioteker) le fremgangsmåde for vurdering af biblioteker af alle mulige enkelt aminosyre mutationer i proteiner, der gælder for gener med en længde længere end sekventering læser længde 11,13: Først hver aminosyre position er randomiseret ved steddirigeret mutagene PCR. Under denne proces er det gen opdelt i grupper bestående af sammenhængende positioner med en samlet længde imødekommes af sekventering platform. De mutagene PCR-produkter for hver gruppe kombineres derefter, og hver gruppe uafhængigt underkastet selektion og high-throughput sekventering. Ved at fastholde en korrespondance mellem placeringen af mutationer i sekvensen og sekventering læse længde, denne tilgang har den fordel, at maksimere sekventering dybde: mens man bare kunne sekventere sådanne biblioteker i korte vinduer uden opdeling i grupper (fx ved en standard haglgevær. sekventering tilgang), mest læser opnået ville være vildtype- og dermed majority af sekventering gennemløb brændt (fx til en hel-protein mætningsmutagenese bibliotek af en 500 aminosyre protein sekventeret i 100 aminosyre (300 bp) vinduer, på mindst 80% af læser vil være den vildtypesekvensen).
Her er en protokol, præsenteres som udnytter high-throughput sekventering for funktionel vurdering af hel-protein mætning mutagenese biblioteker, ved hjælp af ovenstående metode (skitseret i figur 1). Vigtigt er det, vi indfører brugen af ortogonale primere i biblioteket kloning processen til stregkode hver sekvens gruppe, der tillader dem at blive multiplekses i ét bibliotek, udsættes samtidigt til screening eller udvælgelse, og derefter de-multiplex til dyb sekventering. Da sekvens-grupper ikke underkastet selektion uafhængigt Dette reducerer antallet og sikrer, at hver mutation oplever samme markering. TEM-1 β-lactamase, et enzym, som bibringer højt niveau resistens over forβ-lactam-antibiotika (f.eks., ampicillin) i bakterier anvendes som modelsystem 14-16. En protokol er beskrevet til vurdering af en hel-protein mætningsmutagenese bibliotek af TEM-1 i E. coli under selektion med en omtrentlig serumniveau for en klinisk dosis ampicillin (50 ug / ml) 17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Se figur 1 for udkast til protokol. Flere trin og reagenser i protokollen kræver sikkerhedsforanstaltninger (angivet med "ADVARSEL"). Consult sikkerhedsdatablade før brug. Alle protokoller trin udføres ved stuetemperatur, medmindre andet er angivet.
1. Forbered Kultur Medier og Plader
- Og steriliseres ved autoklavering 1 L renset vand, 100 ml Super Optimal Broth (SOB, tabel 1), 1 L Luria-Bertani-bouillon (LB; tabel 2) og 1 L LB-agar (tabel 3). Forbered separat og sterilisere tre dyrkningskolber hver indeholder 1 L LB.
Bemærk: I hele protokollen "vand" refererer til autoklavere-steriliseret renset vand; SOB, LB og LB-agar henvise til autoklaven-steriliserede opløsninger. - Der fremstilles en 12 mg / ml stamopløsning af Tet ved opløsning af 0,12 g tetracyclinhydrochlorid i 10 ml 70% ethanol. Sterilisere anvendelse af et 0,2 um filter og opbevarved 4 ° C beskyttet mod lys.
- Cool LB-agar til 50 ° C og derefter tilsættes 1 ml Tet lager (slutkoncentration på 12 ug / ml Tet). Hæld i petriskåle og køligt ved RT beskyttet mod lys. Opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys.
2. Konstruktion af Whole-genet Saturation Mutagenese Bibliotek
Bemærk: Primere; udfyldte PCR'er, restriktionsspaltninger og ligeringer; og oprensede DNA-prøver kan opbevares ved -20 ° C.
- Design mutagenese primere
- At mutagenisere hver aminosyre position til alle mulige aminosyrer, designe et par af komplementære mutagenese primere (sense / frem og antisense / tilbage) for hver aminosyre position med følgende retningslinjer:
- Udskifte kodonet svarende til aminosyren, der skal mutageniseres ved NNS (hvor N er en blanding af alle fire nukleotidbaser og S er en blanding af cytosin (C) og guanin (G)) og center i primEr, flankeret af ca. 15 nucleotider på hver side.
- Sikre, at 5'- og 3'-enderne slutter i C eller G, og at smeltetemperaturen (T m) er ca. 70 ° C 3. Brug den beregningsmæssige script NNS_PrimerDesign.m (Se Supplerende kodeks File) til at designe NNS mutagenese primere efter disse retningslinier.
- Bestil primere fra en kommerciel kilde. For at lette brugen, har dem syntetiseret i 96-brønds pladeformat og forinden er fortyndet med vand til 50 uM, med et sæt plader indeholdende sense mutagenese-primere og en anden antisense primere.
- Fyld en pipette bassin med vand og anvende en multikanal pipette til at overføre 95 pi til 263 brønde over tre 96-brønds plader. Fortynd primerne 20-fold til 2,5 pM ved anvendelse af en multikanal pipette til at overføre 5 pi fra 96-brønds plader indeholdende sense mutagenese-primere til de beslægtede brønde på plader, der indeholdt vand.
- Gentageprotokol trin 2.1.3 at fortynde antisense mutagenese primere.
- At mutagenisere hver aminosyre position til alle mulige aminosyrer, designe et par af komplementære mutagenese primere (sense / frem og antisense / tilbage) for hver aminosyre position med følgende retningslinjer:
- Syntese af NNS sub-biblioteker for hver aminosyre position med to-trins PCR site-directed mutagenese
- Udfør første runde mutagene PCR'er. For hver mutagenese primer, udarbejde en 25 pi PCR-reaktion ved hjælp pBR322_AvrII plasmid som skabelon og primere AatII_F eller AvrII_R (sense mutagenese primere parret med primer AvrII_R, og antisense mutagenese primere parret med primer AatII_F; alt 526 PCR'er). Se tabel for Materialer til AatII_F og AvrII_R sekvenser.
- Forbered en PCR "master mix", individualisere reagenserne fra tabel 4 til et 15 ml konisk rør. Overførsel til en pipette bassin. Brug en multikanal pipette til at overføre 15 pi til 263 brønde over tre 96-brønds PCR-plader. Brug en multikanal pipette til at overføre 10 pi fra 96-brønds plader indeholdende de fortyndede sense mutagenese-primere til de beslægtede brønde in PCR plader.
- Omfatte hver PCR-plade med en 96-brønds plade forsegling. Centrifuger ved 200 xg i 2 min.
- Overfør PCR-plader til thermocycler og køre følgende program: 98 ° C i 30 sek; 20 cykler: 98 ° C i 10 sek, 55 ° C i 20 sek, 72 ° C i 1 min; 72 ° C i 2 min; hold ved 4 ° C.
- Gentag protokoltrin 2.2.1.1 - 2.2.1.3 for de plader med 96 brønde indeholdende de fortyndede antisense mutagenese-primere.
- Udfør anden runde mutagene PCR'er. For hver aminosyreposition fremstilles en 25 pi PCR-reaktion under anvendelse af primerne AatII_F og AvrII_R, og den blandede og fortyndede første runde mutagene PCR-produkter som en skabelon (i alt 263 PCR'er).
- Fyld en pipette bassin med vand og anvende en multikanal pipette til at overføre 198 pi til 263 brønde over tre 96-brønds plader.
- Kombiner og fortyndes 100 gange de mutagene PCR-produkter for hver aminosyre position ved hjælp af en multikanalpipette tilførste overførsel 1 pi fra 96-brønds PCR-plader indeholdende PCR-produkterne, der følger af sense mutagenese-primere til de beslægtede brønde på plader, der indeholdt vand. Derefter gentage overførslen for PCR-produkterne som følge af de antisense mutagenese primere.
- Forbered en PCR "master mix", individualisere reagenserne fra tabel 5 til et 15 ml konisk rør. Overførsel til en pipette bassin. Brug en multikanal pipette til at overføre 24 pi til 263 brønde over tre 96-brønds PCR-plader. Brug en multikanal pipette til at overføre 1 pi fra 96-brønds plader indeholdende det blandes og fortyndes første runde mutagene PCR-produkter til de beslægtede brønde i PCR-plader.
- Omfatte hver PCR-plade med en 96-brønds plade forsegling. Centrifugeres ved ca. 200 x g i 2 min. Overfør plader til thermocycleren og køre det samme program som i protokol trin 2.2.1.3.
- Analysere resultaterne af de anden runde mutagene PCR'er ved gelelektroforese.Sørg for, at alle produkter er af den korrekte størrelse og fraværende af forurenende produkter.
- Tilsæt 2 ml 2x gel lastning farvestof til en pipette bækkenet og derefter bruge en multikanal pipette til at overføre 6 pi til 263 brønde over tre 96-brønds plader. Brug en multikanal pipette til at overføre 6 pi fra 96-brønds PCR-plader indeholdende de anden runde mutagene PCR-produkter til de beslægtede brønde på 96-brønds plader indeholdende farvestof.
- Der fremstilles en 1,5% agarosegel med 0,2 ug / ml ethidiumbromid (ADVARSEL).
- Load DNA-stige i første og sidste baner af hver række. Brug derefter en multikanalpipette at indlæse 10 pi af prøver fra protokol trin 2.2.3.1.
- Kør gelen ved 100 V i 40 min og billede på et UV-transilluminator.
- Gentag protokol trin 2.2.3.2 - 2.2.3.4, indtil alle prøver analyseres.
- Nøjagtigt at måle koncentrationen af hver NNS underbibliotek PCR-produkt under anvendelse af et dsDNA kvantificering reagens.
- Overførselca. 15 ml EB-buffer til en pipette bassin. Brug en multikanal pipette til at overføre 49 pi til 263 brønde over tre 96-brønds sort-walled, klare bund assayplader.
- Brug en multikanal pipette til at overføre 1 ml af hver anden-trins PCR-produkt (protokol trin 2.2.2) til de beslægtede brøndene i 96-brønds assayplader.
- Der fremstilles en DNA-koncentration standardkurve ved at fortynde lambda-fag-DNA til 2 ng / pl i 300 pi EB buffer og derefter foretage ti dobbelte fortyndinger (til i alt 11 koncentrationer). Overfør 50 pi til første elleve kolonner i en række af en af de 96 brønde assayplader fra det foregående trin som ikke indeholder prøven; til den tolvte kolonne tilsættes 50 ul EB buffer (reagens blank).
- Forbered dsDNA kvantificering reagens ved at tilføje 75 pi reagens (se tabel Materialer) til en 15 ml konisk rør, tilsæt derefter 15 ml EB buffer. Bland ved at vende røret og derefter overføre til en pipette bassin. Beskytte reagens fra lys.
- Brug en multikanal pipette til at overføre 50 pi forberedt dsDNA kvantificering reagens til hver brønd i assay-plader. Bland ved pipettering op og ned. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter beskyttet mod lys.
- Måle fluorescens af hver prøve ved anvendelse af en mikropladelæser og standard fluorescein- bølgelængder (excitation 485 nm, emission 520 nm; 0,1 sek).
- Fratræk fluorescens værdi reagensblindprøven fra alle prøverne. Danne en standardkurve fra fluorescensmålingerne af lambda fag-prøver. Beregn koncentrationen af hver prøve ved hjælp af deres respektive fluorescensmålinger og standardkurven.
- Udfør første runde mutagene PCR'er. For hver mutagenese primer, udarbejde en 25 pi PCR-reaktion ved hjælp pBR322_AvrII plasmid som skabelon og primere AatII_F eller AvrII_R (sense mutagenese primere parret med primer AvrII_R, og antisense mutagenese primere parret med primer AatII_F; alt 526 PCR'er). Se tabel for Materialer til AatII_F og AvrII_R sekvenser.
- Kloning af NNS sub-biblioteker i udvælgelse vektorer
- Bland 100 ng af hver NNS underbibliotek PCR-produkt i fem NNS underbibliotek grupper. Efter fabrikantens anvisninger, rydde op prøver ved hjælp af en DNA-rensning kit og derefter måle koncentrationen ved hjælp af en dsDNA mængdebestemmelse reagens.
Bemærk: Hver gruppe består af ca. 53 sammenhængende aminosyrer positioner anbragt med mellemrum langs TEM-1-sekvensen (NNS underbibliotek grupper 1 - 5 består af positionerne 26 - 78, 79 - 132, 133 - 183 184 - 236 og 237 - 290 af henholdsvis; nummerering ifølge Ambler et al 19).. - Opret kloning vektorer for hver NNS underbibliotek gruppe.
- Forbered fem 100 pi PCR'er ifølge tabel 6, under anvendelse af primere AvrII_F og AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, og plasmider pBR322_OP1-5 som skabelon (AatII_OP1_R parret med pBR322_OP1, etc.).
- Overførsel til termocyklusapparat og køre følgende program: 98 ° C i 30 sek; 25 cykler: 98 ° C i 10 sek, 55 ° C i 20 sek, 72 ° C i 1,5 min; 72 ° C i 2 min; hold ved 4 ° C. Se T stand Materialer til sekvenser af AatII_R og AvrII_F.
- Der fremstilles en 1% agarosegel med 0,2 ug / ml ethidiumbromid (ADVARSEL).
- Tilsæt 20 pi 6x gel loading dye til hver PCR prøve. Læg første bane af gelen med DNA-stige; indlæse hele mængden af hver prøve, springer mindst en brønd mellem prøverne.
- Køre gel ved 100 V i 50 minutter.
- Visualiser under anvendelse af en lang bølgelængde UV-lampe (ADVARSEL). Forbrugsafgifter skiver indeholdende PCR-produktet på ~ 3.500 bp; overføre at adskille mikrocentrifugerør. Gelskiver kan opbevares ved -20 ° C.
- Efter fabrikantens anvisninger, rense prøver ved hjælp af en gel udvinding kit og foranstaltning koncentration på en dsDNA kvantificering reagens.
- For begge de NNS underbibliotek grupper (protokol trin 2.3.1) og kloningsvektorer (protokol trin 2.3.2) nedsatte restriktionsfordøjelser med AatII og Avrll- enzymer i henhold til T abel 7. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time. Efter fabrikantens anvisninger, rydde op prøver ved hjælp af en DNA-rensning kit og derefter måle koncentrationen ved hjælp af et dsDNA quantitàtion reagens.
- Nedsat ligeringsreaktioner følgende tabel 8 for hver restriktion-spaltet NNS underbibliotek gruppe med beslægtet restriktion-fordøjet kloningsvektor (NNS underbibliotek gruppe 1 med pBR322_OP1, etc.). Inkuber ved stuetemperatur i 1 time. Rydde op reaktioner under anvendelse af et DNA oprensningskit ifølge producentens instruktioner; eluering DNA med 20 pi vand.
- Omdan helhed af de rensede ligeringsreaktioner i biblioteket-effektive E. coli-celler ved elektroporering.
- Thaw elektrokompetente E. coli celler og derefter placere celler og oprensede ligeringsreaktioner på is.
- Overfør 10 pi optøet celler til hvert oprenset ligeringsreaktion og derefter overføre til elektroporation cuvette. Elektroporere ved 1,8 kV.
- Gendan celler ved resuspendering i 1 ml SOB. Der inkuberes i 1 time ved 37 ° C.
- Resuspender 10 pi af hver opsving kultur i 990 pi LB; spredes 100 pi på LB-agarplader containing 12 ug / ml Tet. Pladerne inkuberes O / N (~ 16 timer) ved 37 ° C.
- For hver opsving kultur, udarbejde en 250 ml kultur kolbe med 50 ml LB og 50 pi Tet lager. Overførsel til kolbe de resterende ~ 1 ml opsving kultur. Inkuber O / N (~ 16 timer) ved 37 ° C under kraftig omrystning (~ 200 rpm).
- Tæl antallet af kolonier på hver plade. Beregn antallet af succesfulde transformanter som
, hvor 
er antallet af kolonier, 
er gendannelsesdiskenheden kultur (1000 pi) og 
er volumen af opsvinget kultur forgyldt (1 pi).
Bemærk: For at sikre fuldstændig dækning af alle mutationer, som en tommelfingerregel antallet af vellykkede transformanter skal være ≥100 gange i forhold til antallet af forventede mutationer. Hver NNS underbibliotek har ~ 53 positioner, så det forventede antal mutationer er 53 positioner × 32 kodoner / position ≈ 1,7 × 10 3; til opnåelse af et bibliotek størrelse ≥100 gange (≥1.7 × 10 5) bør der være ≥170 kolonier på hver plade. - Ifølge producentens instruktioner, isolere plasmid-DNA fra kulturer under anvendelse af et plasmid-oprensningskit og derefter måle koncentrationer under anvendelse af et dsDNA kvantificering reagens. Bland 100 ng af hvert plasmid. Dette skaber den endelige hel-protein mætningsmutagenese bibliotek.
- Bland 100 ng af hver NNS underbibliotek PCR-produkt i fem NNS underbibliotek grupper. Efter fabrikantens anvisninger, rydde op prøver ved hjælp af en DNA-rensning kit og derefter måle koncentrationen ved hjælp af en dsDNA mængdebestemmelse reagens.
, hvor 
er antallet af kolonier, 
er gendannelsesdiskenheden kultur (1000 pi) og 
er volumen af opsvinget kultur forgyldt (1 pi). 3. Udvælgelse af TEM-1 Whole-protein mætningsmutagenese Bibliotek for antibiotikaresistens
- Forberedelse af den første udvælgelse kultur.
- Fortynd plasmid fra protokollen trin 2.3.7 til 0,5 ng / pl i vand og overføres 20 pi til et mikrocentrifugerør. Udfør transformation, reselvopdagende, plating og O / N vækst som tidligere beskrevet i protokol trin 2.3.5, undtagen overføres 1 pi af SOB recovery kultur til 999 pi LB.
- Tæl antallet af kolonier. For at sikre fuldstændig dækning af alle mutationer bør der være ≥100 kolonier, hvilket indikerer ≥10 6 succesfulde transformanter (100 × 263 positioner × 32 codon / position ≈ 10 6).
- Måle koncentrationen af 50 ml O / N-kulturen.
- Forbered en LB blank ved at tilsætte 1 ml LB til et spektrofotometer kuvette. Mål OD600 på et spektrofotometer.
- Fortynd O / N-kulturen 10 gange ved resuspendering 100 pi i 900 pi LB. Mål OD600. Fratræk OD600 aflæsning af emnet og gange med 10 til opnåelse af OD600 af O / N-kulturen.
- Pre-varme de tre dyrkningskolber fra protokol trin 1.1 for ~ 30 min ved 37 ° C. Fortynd O / N-kulturen til OD600 = 0,1, og der tilsættes 1 ml til en kolbe (endelig OD600 = 0,001). Thans er "pre-udvælgelse kultur".
- Inkubér "første udvælgelse kultur" ved 37 ° C under kraftig omrystning (200 rpm). Periodisk overvåge væksten ved måling OD600 som i protokol trin 3.1.3 (det er ikke nødvendigt at fortynde kulturen 10 gange), indtil OD600 = 0,1 (~ 2,5 timer).
- Overfør 100 ml af den første udvælgelse kultur til to 50 ml koniske rør. Centrifuger ved 4.000 xg i 6 min ved 4 ° C. Fjern det meste af supernatanten og kombinere til en enkelt 15 konisk rør. Gentag centrifugering og fjerne al supernatant. Opbevar ved -20 ° C.
- Udvælgelse for ampicillinresistens.
- Mens den første udvælgelse kultur inkubere, udarbejde en 50 mg / ml stamopløsning af Amp i vand ved at opløse 0,5 g natrium ampicillin i 10 ml vand. Sterilisere anvendelse af et 0,2 um filter og opbevares ved 4 ° C.
- Til de to andre kolber, tilføje Tet til en slutkoncentration på 12 ug / ml, og et volumen af den første udvælgelse kultur sådan tha t den endelige OD600 = 0,001. Til den ene kolbe, der tilsættes 1 ml Amp, for en endelig koncentration på 50 pg / ml - dette er "udvælgelse kultur".
- Inkuber kulturerne ved 37 ° C under kraftig omrystning (200 rpm). Overvåg vækst af kulturen, som der ikke ampicillin blev tilsat i det foregående trin, indtil OD600 = 0,1 (~ 2,5 timer). På dette tidspunkt også måle OD600 af udvælgelsen kultur.
- Opdel OD600 af udvælgelsen kultur i 0,1 og gange med 100 ml. Overføre denne volumen (~ 400 ml) til 50 ml koniske rør og centrifugeres ved 4000 xg i 6 min ved 4 ° C. Fjern det meste af supernatanten og kombinere til en enkelt 15 konisk rør. Gentag centrifugering og fjerne al supernatant.
- Ifølge producentens anvisninger, isolere plasmid DNA fra den foreløbige udvælgelse (protokol trin 3.1.6) og udvælgelse (protokol trin 3.2.4) kultur cellepellets og derefter måle koncentrationen ved hjælp af et dsDNA kvantificering reagens.
- Klargøring af prøver til high-throughput sekventering
- Forbered 25 gl PCR'er at de-multiplekse NNS sub-bibliotek grupper med retvinklede primere
- Forbered en PCR mester mix efter tabel 9; overføre 23 pi til ti PCR-rør.
- Tilsæt 1 pi 0,5 ng / pl oprensede plasmid-DNA fra den første udvælgelse kultur til PCR-rør 1 - 5, og fra udvælgelsen kultur til rør i 6 - 10.
- Bland 50 ul 50 pM frem ortogonale primere OP1_F - OP5_F med den respektive omvendte ortogonale primere OP1_R - OP5_R. I samme rækkefølge, overførsel 1 pi til PCR-rør 1 - 5 og 6 - 10. Se Tabel over Materialer til sekvenser af OP1_F - OP5_F og OP1_R - OP5_R.
- Overførsel PCR-rør til thermocycler. Følgende program køres: 98 ° C i 30 sek; 20 cykler: 98 ° C i 10 sek, 55 °; C i 20 sek, 72 ° C i 1,5 min; 72 ° C i 2 min; hold ved 4 ° C.
- Forbered 25 pi PCR'er at isolere hver af de NNS underbibliotek grupper
- Fortynd 100 gange de ti PCR'er fra protokol trin 4.1.1.4 ved at overføre 1 pi hver at adskille PCR-rør og tilsætning 99 pi vand. Mix, så pipette ud 99 pi og kassér.
- Bland 50 ul 50 pM forward primere Group1_F - Group5_F med den respektive omvendte primere Group1_R - Group5_R. I samme rækkefølge, at overføre 1 pi PCR-rør 1 - 5 og 6 - 10. Se Tabel over Materialer til sekvenser af Group1_F - Group5_F og Group1_R - Group5_R.
- Forbered en PCR mester mix efter tabel 9, overføre 23 pi til hvert PCR-rør. Overførsel PCR-rør til thermocycler; køre det samme program som i protokol trin 2.2.1.3.
- Udfør de sidste 25 gl PCR'er at tilføje indeksering sekvenser
- Dilut 100 gange de ti PCR'er fra protokol trin 4.1.2.3 ved at overføre 1 pi hver at adskille PCR-rør og tilsætning 99 pi vand. Mix, så pipette ud 99 pi og kassér.
- Forbered en PCR mester mix efter tabel 9, overføre 23 pi til hvert PCR-rør.
- For rør med skabelon stammer fra NNS sub-bibliotek grupper 1-5, overføre 0,5 pi pr rør forward primere 501_F - 505_F hhv. For rør med skabelon som følge af den foreløbige udvælgelse og udvælgelse kulturer, overføre 0,5 pi pr rør reverse primere 701_R og 702_R hhv. Se tabel for Materialer til sekvenser af 501_F - 505_F, og 701_R og 702_R.
- Overførsel PCR-rør til thermocycler og køre programmet fra trin 2.2.1.3.
- Bland og rense prøver
- Mål koncentrationer under anvendelse af et dsDNA kvantificering reagens ifølge producentens anvisninger. Bland 100 ng af hver PCR-produkt intoa enkelt mikrocentrifugeglas.
- En 2% agarosegel med 0,2 ug / ml ethidiumbromid (ADVARSEL).
- Tilføj 6x gel lastning farvestof til den blandede PCR-produkter prøve. Læg første bane af gelen med DNA-stige; indlæse hele mængden af prøven.
- Køre gel ved 100 V i 50 minutter. Visualiser under anvendelse af en lang bølgelængde UV-lampe (ADVARSEL). Excise skive indeholdende PCR-produktet på ~ 360 bp; overførsel til mikrofugerør. Gel skive kan opbevares ved -20 ° C.
- Efter fabrikantens anvisninger, rense prøve ved hjælp af en gelekstraheringskit og måle koncentrationen ved hjælp af en dsDNA kvantificering reagens. Dette er den sidste prøve for high-throughput sekventering.
- Sekvens på en high-throughput sekventering platform (se tabel for Materialer til platform, der anvendes i denne protokol).
- Beregn koncentrationen prøve i nM som
er koncentrationen af prøven i ng / pl og 
er sekvensen prøveemnets længde DNA (~ 360 bp). Fortynd prøve til 4 nM i EB buffer. - Følg producentens anvisninger for at denaturere prøven og fortyndes til 21:00 i hybridiseringsbuffer.
- Load 600 pi prøve i reagenskassetten. Sequence efter producentens anvisninger og anvisningerne på skærmen.
- Beregn koncentrationen prøve i nM som
- Forbered 25 gl PCR'er at de-multiplekse NNS sub-bibliotek grupper med retvinklede primere
- Analyse af sekventering data
- Download Flash (Fast længde Justering af Short læser) 20, anbringes i mappen sammen med fastq.gz filer opnået fra sekventering.
- Brug Flash til at deltage i fastq.gz filer, der svarer til den parrede ende læser for hvert par af indeks (frem og bak læser for hver NNS underbibliotek gruppe for den foreløbige udvælgelse og udvælgelse kulturer).
- Efter optagelsen hvert par af læser, placere out.extendedFrags.fastq uddatafilen i separate mapper til resultaterne fra den første udvælgelse eller udvælgelsesprocesser kulturer. Omdøb out.extendedFrags.fastq uddatafilen henhold til NNS sub-bibliotek gruppe det svarer (dvs.., 1.fastq, 2.fastq, etc.).
- Kør den beregningsmæssige script NNS_DataAnalyzer.m (Se Supplerende kodeks fil) fra hver mappe til at beregne de tæller for hver enkelt aminosyre mutation, og tæller for vildtype, for hver NNS underbibliotek gruppe.
- Beregn fitness effekt
af hver mutation som basen ti logaritmen af forholdet mellem tællinger opnået i udvælgelsen (
) Versus den foreløbige udvælgelse ( 
) Tilstand, i forhold til vildtype-: 
.
er koncentrationen af prøven i ng / pl og 
er sekvensen prøveemnets længde DNA (~ 360 bp). Fortynd prøve til 4 nM i EB buffer. 
af hver mutation 
) Versus den foreløbige udvælgelse ( 
) Tilstand, i forhold til vildtype-: 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det plasmid kort for de fem modificerede pBR322 plasmider indeholdende ortogonale priming sites (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) er vist i figur 2A. For at teste om de ortogonale primere er specifikke, PCR'er blev udført under anvendelse af hvert par af ortogonale primere individuelt, sammen med alle fem pBR322_OP1-5 plasmider, eller med alle plasmider minus plasmidet matcher ortogonale primerpar. Den korrekte produkt blev kun opnået, når den matchende plasmidet blev inkluderet, og intet produkt af enhver størrelse er opnået på dens fravær (figur 2B).
Et repræsentativt eksperiment blev udført ved at følge protokollen beskrevet i denne tekst (figur 1). Efter behandling (protokol afsnit 4.2), 6,2 × 10 6 læser fra den foreløbige udvælgelse tilstand og 6,3 × 10 6 læser fra 50 ug / ml ampicillin valg conditipå opnåedes. De opnåede for hver tæller aminosyre mutation fra den første udvælgelse tilstand vise en karakteristisk log-normalfordeling (figur 3A) 13. Mindst en optælling fra sekventering af den første udvælgelse kultur for 98,9% af mutationer (58 havde ingen tæller), og over 100 tæller for 91,2% (465 havde mindre end 100 tællinger) blev opnået. Figur 3B viser den relative fitness effekt () for hver mutation i hver position af TEM-1; fordelingen af er vist i figur 3C. Under selektion ved 50 ug / ml ampicillin, de fleste mutationer har en neutral eller næsten neutral fitness effekt (≈ 0, svarende til hvide pixels i figur 3B og det store top i figur 3C). En lille del af mutationer ved denne koncentration har væsentlige virkninger på fitness (<< 0, svarende til blå pixels i figur 3B og venstre hale i figur 3C); exp ectedly, disse omfatter mutationer i de stærkt konserverede aktivt sted-rester (S70, K73, S130, D131, N132, K234 og G236) 13,14. I modsætning hertil få mutationer væsentligt større egnethed forhold til den for TEM-1 (>> 0, svarende til røde pixels i figur 3B), som man kunne forvente, da TEM-1 er meget effektiv ved ampicillin hydrolyse ( 
≈ 10 7 M-1s-1) 14.
Figur 1. Oversigt over Whole-protein Saturation mutagenese Protokol for TEM-1 β-lactamase under Ampicillin Valg. Aktioner som beskrevet i protokollen, er vist med fed skrift. Nummererede protokol trin er vist til venstre, for henvisning til hovedteksten.k "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Validering af ortogonal primingsitet plasmidvektorer. (A) Plasmid kort for de fem modificerede pBR322 plasmider indeholdende ortogonale priming sites (pBR322_OP1 - pBR322_OP5). Beliggenhed og retning af de ortogonale priming steder er angivet. Placeringer af flere restriktionssteder er mærket; TEM-1 hel-protein mætningsmutagenese bibliotek (som omfatter hele TEM-1-genet og promotor) klones i-mellem AatII og Avrll- restriktionssteder. Forkortelser: tet tetracyclinresistensgenet Ori replikationsorigin (B) Hvert par af ortogonale primere (OP1-OP5) blev testet i en PCR, der indeholder alle fem pBR322_OP1-5 plasmider (+), eller med alle plasmider minus den respektive plasmid (. ˗). Vist er en ethidiumbromid-farvet agarosegel (1% vægt / volumen) fyldt med hver PCR-reaktion, størrelse separeret ved elektroforese. Den forventede størrelse produkt er 1628 bp; den første bane er en DNA-stige, størrelser af relevante standarder er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Resultater af TEM-1 β-lactamase Whole-protein Mætning eksperiment. (A) Histogram viser fordelingen af tællinger for hver aminosyre mutation opnået fra high-throughput sekventering af biblioteket fra den første udvælgelse tilstand. For enkelhedens skyld er mutationer med nul tæller (53 mutationer) vist som havende en optælling af en. (B) Fitness virkninger af alle enkelt aminosyre mutationer i TEM-1 under udvælgelse på 50 ug / ml ampicillin. Vist er datamatrix indeholdende den relative fitness virkning () afbildet kolorimetrisk med blå repræsenterer skadelig virkning, rød en positiv effekt og hvid ingen fitness effekt i forhold til vildtype. Mutationer, for hvilke der blev opnået nogen tællinger fra den første udvælgelse kultur er farvet sort. Rækker skildrer positioner langs den primære sekvens og kolonner angiver mutation til en af tyve aminosyrer eller stopkodon (angivet ved étbogstavskode, * er stopkodon); den sekundære struktur af TEM-1 er angivet ved venstre og flere højt konserverede motiver i det aktive site er indikeret til højre. (C) Histogram, der viser fordelingen af relative fitness effekter. Vist er resultaterne for disse mutationer med> 100 tællinger opnået fra sekventering den første udvælgelse kultur. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Masse eller volumen | Kommentar |
| typton | 2 g | |
| gærekstrakt | 0,5 g | |
| Natriumchlorid | 0,06 g | |
| kaliumchlorid | 0,02 g | |
| magnesiumsulfat | 0,24 g | |
| renset vand | 100 ml |
Tabel 1. Super Optimal Broth (SOB). Reagens navne og mængder anvendes til fremstilling af 100 ml SOB (Protokol trin 1.1).
| Reagens | Masse eller Volume | Kommentar |
| typton | 10 g | |
| gærekstrakt | 5 g | |
| Natriumchlorid | 10 g | |
| renset vand | 1 L |
Tabel 2. Luria-Bertani Broth (LB). Reagent navne og mængder anvendes til fremstilling af en L LB (protokol trin 1.1).
| Reagens | Masse eller volumen | Kommentar |
| typton | 10 g | |
| gærekstrakt | 5 g | |
| Natriumchlorid | 10 g | |
| Agar | 15 g | |
| renset vand | 1 L |
Tabel 3. LB-agar. Reagent navne og mængder anvendt i fremstilling LB-agar (protokol trin 1.1).
| Reagens | Bind | Kommentar |
| 5x PCR-buffer | 1.450 pi | |
| PCR tilsætningsstof | 1.450 pi | |
| 2 mM dNTP'er | 725 pi | 2 mM af hver nucleotid |
| 50 uM AatII_F eller AvrII_R primer | 145 pi | |
| 1 ng / pl pBR322_AvrII plasmid | 145 pi | |
| 2 enheder / pl DNA-polymerase | 72,5 pi | |
| vand | 363 pi |
Tabel 4. Første runde mutagen PCR Master Mix. Reagent navne og mængder for at forberede master mix for den første runde mutagen PCR (protokol trin 2.2.1). Samlet mængde er tilstrækkelig til 290 25 pi reaktioner.
| Reagens | Bind | Kommentar |
| 5x PCR-buffer | 1.450 pi | |
| PCR tilsætningsstof | 1.450 pi | |
| 2 mM dNTP'er | 725 pi | 2 mM af hver nucleotid |
| 50 uM AatII_F primer | 145 pi | |
| 50 uM AvrII_R primer | 145 pi | |
| 2 enheder / pl DNA-polymerase | 72,5 pi | |
| vand | 2.973 pi |
Tabel 5. Anden runde mutagen PCR Master Mix. Reagent navne og mængder for at forberede master mix for anden-runde mutagen PCR (protokol trin 2.2.2). Samlet mængde er tilstrækkelig til 290 25 pi reaktioner.
| Reagens | Bind | Kommentar |
| 5x PCR-buffer | 20 pi | |
| PCR tilsætningsstof | 20 pi | |
| 2 mM dNTP'er | 10 pi | 2 mM af hver nucleotid |
| 50 uM AvrII_F primer | 2 pi | |
| 50 uM AatII_OP1_R - AatII_OP5_R primer | 2 pi | en primer per reaktion, parret med respektive plasmid |
| 1 ng / pl pBR322_OP1-5 plasmid | 2 pi | én plasmid per reaktion |
| 2 enheder / pl DNA-polymerase | 1 pi | |
| vand | 43 pi |
Tabel 6. Kloning Vector PCR. Reagensnavne og mængder til fremstilling af PCR for at gøre kloningsvektorerne (protokol trin 2.3.2).
| Reagens | Bind | Kommentar |
| 10x restriktionsenzym buffer | 5 pi | |
| 4 enheder / ul Avrll- | 2,5 pi | |
| 20 enheder / pl AatII | 0,5 pi | |
| DNA til restriktionsfordøjelse | volumen for 500 ng | |
| vand | til 50 pi totalvolumen |
Tabel 7. Begrænsning fordøjer. Reagent navne og mængder restriktionsspaltninger af kloningsvektorer og NNS sub-bibliotek grupper (protokol trin 2.3.3).
| Reagens | Bind | Kommentar |
| 10x T4 DNA ligasepuffer | 5 pi | |
| renset begrænsning-fordøjet NNS sub-bibliotek gruppe DNA | volumen i 48 ng | |
| oprenset restriktion-spaltet kloningsvektor DNA | volumen for 52 ng | |
| 400 enheder / pl T4 DNA ligase | 1 pi | |
| vand | til 20 pi totalvolumen |
Tabel 8. Ligeringer Reagens navne og mængder for ligeringer af kloningsvektorer med begrænsninger-fordøjet NNS sub-bibliotek grupper i en 1:. 3 vektor: Indsæt molforholdet (protokol trin 2.3.4).
| Reagens | Bind | Kommentar |
| 5x PCR-buffer | 55 pi | |
| PCR tilsætningsstof | 55 pi | |
| 2 mM dNTP'er | 27,5 pi | 2 mM af hver nucleotid |
| 2 enheder / pl DNA-polymerase | 2,75 pi | |
| vand | 113 pi |
Tabel 9. PCR reagenser til fremstilling af prøver til High-throughput sekventering. Reagens navne og mængder for fremstilling af PCR masterblandinger anvendes til de-multiplexing med ortogonale primere (4.1.1), isolere NNS sub-bibliotek grupper (protokol trin 4.1.2) og tilsætning indeksering sekvenser (protokol trin 4.1.3). Samlet mængde er tilstrækkelig til 11 25 pi reaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her en protokol er beskrevet til udførelse af funktionel vurdering af hel-protein mætningsmutagenese biblioteker, ved hjælp af høj-throughput sekventering teknologi. Et vigtigt aspekt ved fremgangsmåden er anvendelsen af ortogonale primere under kloning processen. Kort beskrevet er hver aminosyre position randomiseret ved mutagen PCR, og blandes sammen i grupper af positioner hvis samlede sekvenslængde rummes af high-throughput sekventering. Disse grupper er klonet i plasmidvektorer indeholdende par af ortogonale priming sites, blandet sammen og underkastet selektion, derefter de-multiplekses under anvendelse af de ortogonale primere og efterfølgende dyb sekventeret. Da mutationer findes inden sekventeringen læse grænse længde, denne fremgangsmåde maksimerer antallet af nyttige læser indeholdende mutationer for gener af størrelse længere end sekventering læser længde. Desuden tillader denne teknik til den samtidige eller "one-batch" udvælgelse af hele mutational bibliotek, reducerer belastningen samt muligheden for, at mutationer opleve forskellige niveauer af markering. Praktisk, de kritiske trin i protokollen stort set vedrører organisation: under kloningsprocessen (protokol trin 2.3) man skal sikre en korrekt blanding af mutagene PCR-produkter i grupper og deres efterfølgende kloning i den korrekte ortogonale primingsitet vektor; under forberedelsen af prøven for sekventering (protokol trin 4.1), til de korrekte ortogonale primere samt primere isolere hver af NNS sub-bibliotek grupper og tilføje indeksering sekvenser, skal anvendes.
De tre vigtigste trin i protokollen - biblioteket konstruktion, udvælgelse, og sekventering - kan ændres på flere punkter. Under bibliotekskonstruktion man kunne indføre mutationer ved hjælp af forskellige teknikker, for eksempel ved fejltilbøjelig PCR, eller ved at konstruere genet ved anvendelse af oligonukleotider syntetiseret ved dotering i en lille brøkdel af alternative nukleotids 21. Man kunne konstruere biblioteket for at der dobbelt- eller højere ordens mutationer i segmenter af proteinet (dvs. NNS underbibliotek grupper), eller i alternative genotype baggrunde 22. Vigtigt er det, alle ændringer af biblioteket byggeri skridt dog bør opfylde kriteriet om, at korrespondancen mellem placeringen af mutationer i sekvensen og sekventering læse længden opretholdes. Dette kriterium udelukker derfor anvendelsen af protokollen mod omfattende undersøgelser af flere mutationer på tværs af en protein. Ændringer i anden del af protokollen omfatter alternative valg betingelser: (. Fx, temperatur, niveauer af næringsstoffer) forskellige β-lactam-typer (eller kombinationer) og koncentrationer, eksterne stresstilstande, host (f.eks, forskellige typer af bakterier), eller forskellige sampling gange (timer til dage). For eksempel i tidligere arbejde undersøgte vi egnethed virkninger af alle enkelt aminosyre mutationeri TEM-1 under forskellige koncentrationer af ampicillin, og under den tredje generation cefalosporin cefotaxim 13. Med hensyn til det tredje trin af protokollen, for tiden vi anbefaler ikke at afvige fra valget af sekventering platform, der anvendes her (se tabel of Materials). Mens sekventering læse længder er faktisk i øjeblikket længere i andre platforme, at antallet af læser opnåelige er i øjeblikket langt lavere; generelt nøjagtigheden hvortil kan bestemmes virkningen af en mutation er proportional med antallet af læser opnået (se ligning i protokol trin 4.2.5).
Hovedsageligt for enkelthedens skyld, at protokollen bruger TEM-1 β-lactamase som et modelsystem, men den her beskrevne metode kan udvides til andre systemer, for hvilke en high-throughput udvælgelse eller screening assay er på plads. Konstruktion sådanne analyser er dog ofte ikke-triviel: For det første skal der etableres en strategi for opdeling af gen (mutation) og protein sammenFor eksempel i en celle, flydende dråbe (som i en mikrofluidik platform), eller ved fag display. For det andet, og vigtigst af alt, en kvantitativ sammenhæng mellem protein funktion og en valgbar fænotype, eller fitness, skal etableres. For enzymer involveret i metabolisme eller antibiotikaresistens, cellers evne til at vokse i næringsstof drop-out eller antibiotiske medier er ofte en direkte funktion af enzymatisk aktivitet. En mere syntetisk fremgangsmåde kan bruges i andre systemer, for eksempel ved at knytte protein-protein bindingsaffinitet til reportergen (f.eks., Fluorescerende protein) ekspression i bakterier eller gær 11,23, eller under anvendelse af et fluorogent enzymsubstrat i en mikrofluidik-systemet 24 . Endelig skal et sådant assay være skalerbar, at behandle størrelsen af en hel-protein-mutagenese bibliotek.
I sammendrag, en high-throughput sekventering tilgang til den funktionelle vurdering af hel-protein mætning mutagenese biblioteker er descrIBED her. Centralt for tilgangen er konstruktionen af mutagenese biblioteket inden segmenter langs genet, og udnyttelsen af ortogonale primer stregkoder at mærke hvert segment for multiplexing og de-multiplexing biblioteket. Vi forventer, at denne protokol kan let anvendes på andre proteiner, for hvilke der er udviklet et passende højt gennemløb markering eller skærm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typtone | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| Yeast extract | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| Petri plates | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol scale, standard desalting |
| pBR322_AvrII | available upon request | pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | available upon request | five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491L | includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer) |
| 15 ml conical tube | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR plate, 96 well | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 well plate seal | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96-well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| 96-well black-walled, clear bottom assay plates | Corning | 3651 | |
| Lambda phage DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA reagent | Invitrogen | P7581 | dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4 |
| Victor 3 V microplate reader | PerkinElmer | ||
| DNA purification kit | Zymo Research | D4003 | |
| Microcentrifuge tubes | Corning | 3621 | |
| Long-wavelength UV illuminator | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| Agarose gel DNA extraction buffer | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 electrocompetent E. coli | Avidity | EVB100 | |
| Electroporator (E. coli Pulser) | Bio-Rad | 1652102 | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| Plasmid purification kit | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 well PCR strip tubes | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32854 | dsDNA quantitation reagent |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Ampicillin sodium salt | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq desktop sequencer | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform |
| FLASh software | John Hopkins University - open source | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC |
||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG |
||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG |
||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC |
||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC |
||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC |
||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC |
||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG |
||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC |
||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC |
||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC |
||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC |
||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC |
||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG |
||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
References
- Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
- Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
- Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
- Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
- Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
- Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
- Fowler, D. M., et al.
- Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
- McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
- Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
- Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
- Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
- Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
- Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
- Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
- Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
- Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
- Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
- Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
- Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).
