Summary
Biz yüksek verimli sıralama kullanan proteinlerin kapsamlı tek site doyma mutagenezi kütüphanelerinin fonksiyonel değerlendirme için bir protokol mevcut. Daha da önemlisi, bu yaklaşım kütüphane inşaatı ve sıralama multipleks dik primer çiftleri kullanır. ampisilin klinik olarak anlamlı bir doz için seçilen TEM-1 β-laktamaz kullanılarak Örnek sonuçlar verilmiştir.
Introduction
Mutagenez uzun biyolojik sistemler ve bunların evrim özelliklerini incelemek için, ve gelişmiş ya da yeni fonksiyonlara sahip mutant proteinler veya organizmalar üretmek için laboratuvarda istihdam edilmiştir. Erken yaklaşımlar organizmalardaki rastgele mutasyonların üreten yöntemler dayanıyordu birlikte, yeniden birleştirici DNA teknolojisi gelişi site-spesifik bir şekilde DNA seçme değişiklikler, örneğin., Mevkiye yönelik mutagenez, 1,2 tanıtmak etmesini sağlamıştır. Mevcut teknik, tipik olarak, bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) mutajenik oligonükleotidler kullanılarak birlikte, belirli bir gen 3,4 mutasyonların az sayıda (örn.,, Nokta mutasyonlar) oluşturmak ve değerlendirmek için nispeten kolay olan. Bu çok daha zor ancak ne zaman gol yaklaşımları, örneğin, oluşturma ve değerlendirme tüm olası tek site (veya daha yüksek mertebeden) mutasyonları.
çok iken m çok sayıda değerlendirmek için çalışırken erken çalışmalarda öğrenilmiştirgenlerdeki utations, kullanılan teknikler 5-7 suşları bağımsız saçma baskılayıcı kullanarak her mutasyonun değerlendirmesini gerektiren, örneğin sık sık zahmetli olduğunu, ya da bağlı Sanger sıralama 8 düşük sıralama derinliği onların nicel yeteneği sınırlı kalmıştır. Bu çalışmalarda kullanılan teknikler, büyük ölçüde yüksek verimli DNA dizilemesi 9-12 kullanılarak yöntemlerle yerini edilmiştir. Kütüphane önce elde edilen ve bu kavramsal olarak basit yaklaşımlar fonksiyonu için bir ekran veya seçime kütüphane tabi, mutasyonlar çok sayıda içeren bir kütüphane oluşturma gerektirmez birlikte, ve sonra derin sıralama (yani.,> 10 6 dizilim mertebesinde okur) seçimden sonra. Bu şekilde, mutasyonlar, çok sayıda fenotipik veya spor etkileri, her mutantın popülasyon frekans değişikliği olarak temsil aynı anda daha nicel olarak değerlendirilebilir.
Biz daha önce bir ahmak tanıttı(., yani bütün bir protein doyma mutagenezi kütüphaneleri) proteinleri mümkün olan tüm tek amino asit mutasyonlarının kütüphaneleri değerlendirmek geçerli uzun dizileme daha büyük bir uzunluğa sahip genlere, le yaklaşımı uzunluğu 11,13 şöyledir: İlk olarak, her amino asit pozisyonu, randomize bir tarafından mutajenik PCR sitesine yönlendirilmiş. Bu işlem sırasında, bir gen dizisi platform tarafından yerleştirilmiş bir toplam uzunluğu bitişik pozisyon oluşan gruplara ayrılmıştır. Her bir grup için mutajenik PCR ürünleri daha sonra bir araya getirilmiş ve her bir grup, bağımsız olarak seçilmesi ve yüksek verimli dizilemesine tabi tutulmuştur. Dizisi ve sıralama okuma uzunluğu mutasyonların konumu arasında bir yazışma sürdürerek, bu yaklaşım maksimize sıralama derinlik avantajı vardır:. Bir sadece gruplar (örneğin, standart bir av tüfeği ile içine bölme olmadan kısa pencerelerde bu tür kütüphaneler sırası olabilir süre dizilim yaklaşımı) en vahşi tip ve dolayısıyla m şekilde elde edilen okumaboşa dizileme throughput ajority (80 en az% 100 amino asit (300 bp) pencereleri dizisi 500 amino asit proteini bütün bir protein doyma mutagenezi kütüphane, örneğin, doğal suş dizisi olacaktır kaydeder).
Burada, bir protokol (Şekil 1 'de ana hatlarıyla) yukarıdaki yaklaşım kullanılarak, tüm protein doyma mutagenezi kütüphaneleri fonksiyonel değerlendirmesi için yüksek verimli sekanslama kullanan şekliyle sunulmuştur. Daha da önemlisi, biz tarama veya seçime aynı anda maruz onları bir kütüphaneye çoklanÕr sağlar her sekans grubu, barkod kütüphane klonlama işleminde dik primerlerin kullanımı tanıtmak ve daha sonra derin dizileme için de-çoklanmış. dizi grupları bağımsız seçime tabi olmadığından, bu iş yükünü azaltır ve her mutasyon seçimi aynı düzeyde deneyimleri sağlar. TEM-1 β-laktamaz, yüksek düzeyde bir direnç kazandıran bir enzimβ-laktam antibiyotikler (örneğin., ampisilin) bakteri, bir model sistem 14-16 olarak kullanılır. Bir protokol E. TEM-1 bir bütün protein doyma mutagenezi kütüphanenin değerlendirilmesi için açıklanan ampisilin klinik dozu (50 ug / ml) 17,18 için yaklaşık bir serum düzeyinde seçimi altında E. coli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: protokol taslağı için Şekil 1'e bakınız. Protokolde birkaç adım ve ayıraçları ( "DİKKAT" ile gösterilen) güvenlik önlemleri gerektirir. Kullanmadan önce malzeme güvenlik bilgi formlarını danışınız. Diğer belirtilmedikçe tüm protokol safhaları, oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
1. Kültür Ortamı ve Tabaklar hazırlayın
- Hazırlama 1 L arı su, 100 mi süper optimal Broth (SOB, Tablo 1) otoklav ile sterilize 1 L Luria-Bertani etsuyu (LB; Tablo 2) ve 1 L LB-agar (Tablo 3). ayrı ayrı hazırlayın ve üç kültür döküm kalıplarını her biri 1 L kilodan sterilize
Not: protokol "su" anlamına gelir boyunca için otoklav sterilize saf su; SOB, LB ve LB-agar otoklav sterilize çözümlere bakın. - % 70 etanol, 10 ml 0.12 g tetrasiklin hidroklorür eritilerek Tet 12 mg / ml stok hazırlayın. 0.2 mikron filtre ve mağaza kullanarak sterilize4 ° C'de ışıktan korunmuş.
- daha sonra, 50 ° C'de ve serin LB-agar Tet stokunun 1 ml (12 ug / ml Tet nihai konsantrasyon) ilave edilir. ışıktan korunarak oda sıcaklığında petri kaplarında ve serin içine dökün. 4 ° C'de saklayın ışıktan korunması.
Tüm-geninin Doyma Mutajenizi Kütüphane 2. Yapı
Not: Astarlar; tamamlanan PCR, restriksiyon dijestleri ve ligasyonlar; ve saflaştırılmış DNA örnekleri -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
- Mutajenez primerleri tasarlamak
- Tüm olası amino asitleri her bir amino asit pozisyonunu mutagenize için tamamlayıcı mutagenez primeri bir çift tasarım (sens / ileri ve antisens / geri) aşağıdaki kurallara her amino asit pozisyonu için:
- amino aside karşılık gelen kodon (N dört nükleotit sahalarının bir karışımıdır; ve S sitozin karışımı (C) ve guanin (G) 'dir), prim ve merkezi NNS mutagenize edilmesi değiştiriner, her iki tarafında yaklaşık 15 nükleotid ile çevrili.
- 5 've 3' erime sıcaklığı (Tm) C ya da G ve sona erdi yaklaşık 70 ° C 3 olduğundan emin olun. bu yönergelere göre NNS mutagenez primerler tasarlamak için hesaplamalı komut NNS_PrimerDesign.m (Ek kod dosyası bakınız) kullanın.
- ticari bir kaynaktan al primerler. Kullanım kolaylığı için, bunları 96 gözlü plaka formatında sentezlenen ve sens mutagenez primeri ve başka bir anti-duyarlı primerler ihtiva eden plakalar seti ile, 50 uM su içinde önceden seyreltilmiş.
- su, bir pipet lavabo doldurun ve üç 96-yuvalı plakalar üzerinde 263 gözlere 95 ul aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın. su ihtiva eden plakalar aynı kökenli oyuklarına sens mutajenez primerleri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar 5 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanılarak Astarlar 2.5 uM 20-kat seyreltilir.
- Tekrar etprotokol adımı 2.1.3 antisens mutagenez primerler sulandırmak için.
- Tüm olası amino asitleri her bir amino asit pozisyonunu mutagenize için tamamlayıcı mutagenez primeri bir çift tasarım (sens / ileri ve antisens / geri) aşağıdaki kurallara her amino asit pozisyonu için:
- İki aşamalı PCR yer yönelimli mutagenezle her amino asit pozisyonu için NNS alt kütüphane sentezi
- ilk turda mutajenik PCRlar gerçekleştirin. Her mutajenez astar, şablon ve primerler AatII_F veya AvrII_R olarak pBR322_AvrII plazmid kullanılarak 25 ul PCR reaksiyonu hazırlamak (astar AvrII_R ile eşleştirilmiş anlamda mutagenez astar ve astar AatII_F ile eşleştirilmiş antisens mutagenez astar, 526 PCR'lerine toplam). AatII_F ve AvrII_R dizileri için Malzeme Tablosu bakın.
- 15 ml konik tüp Tablo 4 reaktifler ekleyerek PCR "master miks" hazırlayın. Bir pipet havzasına aktarın. Üç 96 gözlü PCR plakaları üzerinde 263 gözlere 15 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın. aynı kökenli oyuklara seyreltildi sens mutajenez primerleri ihtiva eden 96 oyuklu plakalar 10 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanarak In PCR plakaları.
- 96 oyuklu bir plaka conta ile her PCR plakası kapatılır. 2 dakika boyunca 200 x g'de santrifüjleyin.
- PCR PCR plakaları aktarın ve aşağıdaki programı çalıştırın: 30 saniye boyunca 98 ° C; 20 döngü: 10 saniye boyunca 98 ° C, 20 sn için 55 ° C, 1 dakika için 72 ° C; 2 dakika 72 ° C; 4 ° C'de tutun.
- seyreltilmiş antisens mutajenez primerleri içeren 96 kuyucuğu için 2.2.1.3 - tekrarlayın protokol 2.2.1.1 adımları.
- ikinci tur mutajenik PCRlar gerçekleştirin. her amino asit pozisyonu için, 25 ul PCR reaksiyonu primerler kullanılarak AatII_F ve AvrII_R ve karışık hazırlamak ve bir şablon (263 PCR'lerine toplamı) olarak ilk tur mutajenik PCR ürünleri seyreltilmiş.
- su, bir pipet lavabo doldurun ve üç 96-yuvalı plakalar üzerinde 263 kuyu 198 ul aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın.
- Birleştirin ve sulandırmak çok kanallı pipet kullanarak her bir amino asit pozisyonu için mutajenik PCR ürünleri 100 katilk transfer su ihtiva eden plakalar aynı kökenli oyuklarına sens mutagenez primerler elde edilen PCR ürünleri ihtiva eden 96 gözlü PCR plakaları 1 ul. Daha sonra anti-duyu primerleri mutagenez kaynaklanan PCR ürünleri için transferi tekrarlayın.
- 15 ml konik tüp, Tablo 5'ten reaktifler ekleyerek PCR "ana karışımı" hazırlayın. Bir pipet havzasına aktarın. Üç 96 gözlü PCR plakaları üzerinde 263 gözlere 24 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın. Karışık ihtiva eden 96 oyuklu plakalar 1 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanarak ve PCR plakaları aynı kökenli çukurlara ilk tur mutajenik PCR ürünleri seyreltilmiştir.
- 96 oyuklu bir plaka conta ile her PCR plakası kapatılır. Santrifüj yaklaşık 200 x g, 2 dakika için. Transfer plakaları thermocyclerda protokol aşamasında 2.2.1.3 aynı programı çalıştırmak için.
- jel elektroforezi ile ikinci tur mutajenik PCR'ler sonuçlarını analiz.tüm ürünler doğru boyutta olduğundan emin olun ve ürünleri kontamine yoktur.
- Bir pipet havzasına 2x jel yükleme boyası 2 ml ilave edilir ve daha sonra, üç 96-kuyu tabak üzerinde 263 oyuklara 6 ul aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın. boya içeren 96 oyuklu plakalar aynı kökenli oyuklarına ikincil mutajenik PCR ürünlerini ihtiva eden 96 gözlü PCR plakaları 6 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın.
- 0.2 ug / ml etidyum bromür (DİKKAT) ile% 1.5 agaroz jeli hazırlayın.
- Her satırın ilk ve son şerit yük DNA merdiveni. Sonra protokol adımı 2.2.3.1 örneklerinin 10 ul yüklemek için bir çok kanallı pipet kullanın.
- UV transilluminator 40 dakika ve görüntü için 100 V jel çalıştırın.
- Tüm numuneler analiz kadar 2.2.3.4 - tekrarlayın protokol 2.2.3.2 adımları.
- Doğru bir dsDNA kantitatif reaktif kullanılarak her bir NNS alt kütüphane PCR ürününün konsantrasyonu ölçmek.
- transferBir pipet havzası yaklaşık 15 ml EB tampon. Üç 96 oyuklu siyah duvarlı, şeffaf tabanlı deney levhaları üzerinde 263 gözlere 49 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın.
- 96 oyuklu deney plakaları aynı kökenli oyuklarına her bir ikinci adımlı PCR ürünü (Protokol Adım 2.2.2) 1 ul aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın.
- 300 ul EB tamponu içinde 2 ng / ul lamda-faj DNA'sını seyrelterek bir DNA konsantrasyonu, bir standart eğri hazırlamak ve daha sonra (11 konsantrasyonlarının toplam) 1002-kat seyreltiler. Resim örneğini içeren önceki adımda elde edilen 96 oyuklu deney plakaları birine göre bir üst üste ilk on sütununa başına 50 ul; on ikinci kolonda EB tamponu 50 ul (boş tepkin maddesi) ilave edin.
- Reaktif 75 ul ekleyerek dsDNA kantitatif reaktif hazırlayın ardından EB tampon 15 ml ekleyin, 15 ml konik tüp (Malzeme Tablo). Tersine tüp karıştırın ve daha sonra bir pipet havzasına transfer. Işıktan reaktifi koruyun.
- deney plakalarının her çukuruna hazırlanan dsDNA kantitasyonu reaktifi 50 ul transfer etmek için bir çok kanallı pipet kullanın. yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. ışıktan korunmuş bir 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Mikrolevha okuyucu ve standart floresan dalga boyunda (0.1 sn eksitasyon 485 nm, emisyon 520 nm) kullanılarak her numunenin floresan ölçülür.
- Bütün numuneler Reaktif boş floresans değeri çıkarın. Lambda faj örnekleri fluoresans ölçümleri ile ilgili standart bir eğri oluşturur. ilgili floresans ölçümleri ve standart eğri kullanılarak her numune konsantrasyonu hesaplanır.
- ilk turda mutajenik PCRlar gerçekleştirin. Her mutajenez astar, şablon ve primerler AatII_F veya AvrII_R olarak pBR322_AvrII plazmid kullanılarak 25 ul PCR reaksiyonu hazırlamak (astar AvrII_R ile eşleştirilmiş anlamda mutagenez astar ve astar AatII_F ile eşleştirilmiş antisens mutagenez astar, 526 PCR'lerine toplam). AatII_F ve AvrII_R dizileri için Malzeme Tablosu bakın.
- Seçim vektörleri içine NNS alt kütüphanelerinin Klonlama
- Beş NNS alt kütüphane gruba her NNS alt kütüphane PCR ürünü 100 ng karıştırın. üreticinin talimatlarına ardından, bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri temizlemek ve daha sonra bir ds kullanarak konsantrasyonu ölçmekDNA kantitatif reajanı.
Not: Her bir grup (NNS alt kütüphane grupları 1 TEM-1 dizisi boyunca aralıklı yaklaşık 53 bitişik amino asit pozisyonları oluşur - 78, 79 - - 5 pozisyonları oluşmaktadır 26 132, 133-183, 184-236, ve 237-290 sırasıyla, numaralama) Ambler diğ 19'a göre yöntem.. - Her NNS alt kütüphane grup için klonlama vektörleri oluşturun.
- Şablonu (pBR322_OP1 ile eşleştirilmiş AatII_OP1_R, vs.) AatII_OP5_R ve plazmidler pBR322_OP1-5 - primerler AvrII_F ve AatII_OP1_R kullanılarak Tablo 6'ya göre beş 100 ul PCR'ler hazırlayın.
- PCR ve aşağıdaki programı çalıştırmak için transfer: 30 saniye boyunca 98 ° C; 25 devir: 10 saniye boyunca 98 ° C, 20 sn için 55 ° C, 1.5 dakika 72 ° C; 2 dakika 72 ° C; 4 ° C'de tutun. AatII_R ve AvrII_F dizileri için malzemeler T mümkün bakın.
- 0.2 ug / ml etidyum bromür (DİKKAT) bir% 1 agaroz jeli hazırlayın.
- Her PCR örnek 6x jel yükleme boyası 20 ul ekle. DNA merdiveni ile jel ilk sokağın yükleyin; örnekler arasında iyi en azından bir atlama, her numunenin tüm hacmi yükleyin.
- 50 dakika boyunca 100 V jel çalıştırın.
- Uzun dalga boylu UV ışığı (DİKKAT) kullanarak jel gözünüzde canlandırın. ~ 3500 bp'lik PCR ürünü ihtiva eden Tüketim dilim; mikrofüj tüpleri ayrı aktarın. Jel dilimleri, -20 ° C'de saklanabilir.
- üreticinin talimatlarına ardından, bir jel ekstraksiyon kiti ve dsDNA kantitatif reaktif kullanılarak tedbir konsantrasyonu kullanılarak örnekleri arındırmak.
- Kısıtlama kurmak hem NNS alt kütüphane gruplar (protokol adım 2.3.1) ve klonlama vektörleri (protokol adım 2.3.2), 7 edebilmek T göre AatII ve Avrll enzimleri ile sindirir. 1 saat 37 ° C'de inkübe edin. üreticinin talimatlarına ardından, bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri temizlemek ve daha sonra bir dsDNA quantità kullanarak konsantrasyonu ölçmektion reajanı.
- Ligasyon reaksiyonları soydaş kısıtlama sindirilmiş klonlama vektörü (pBR322_OP1 ile NNS alt kütüphane grup 1, vs.) her kısıtlama sindirilmiş NNS alt kütüphane grup için Tablo 8'de aşağıdaki ayarlayın. 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. üreticinin talimatlarına göre bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak reaksiyonlar temizleyin; su 20 ul DNA yıkayın.
- Kütüphane verimli E. içine saflaştırılmış ligasyon reaksiyonları bütününü Transform elektroporasyon ile E. coli hücreleri.
- Çözülme elektro-E. coli hücreleri ve daha sonra yer hücreleri ve buz üzerinde saflaştırılmış ligasyonu reaksiyonları.
- Aktarım 10 ul, her saflaştırılmış ligasyon reaksiyonu hücrelerin çözülmüş ve daha sonra elektroporasyon küvetine aktarılır. 1.8 kV electroporate.
- 1 ml SOB resuspending hücreleri kurtarın. 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe edin.
- 990 ul LB her kurtarma kültürü 10 ul yeniden süspanse; LB-agar plakaları c 100 ul yayıldıiçeren gruptur 12 ug / ml Tet. inkübe edin O / 37 ° C de N (~ 16 saat).
- Her bir geri kültür için 50 mi LB ve 50 ul Tet stoku 250 ml bir kültür şişesi hazırlayın. Kurtarma kültür kalan yaklaşık 1 ml'lik bir şişeye aktarın. kuvvetlice çalkalanarak (yaklaşık 200 rpm) ile 37 ° C 'de O / N (~ 16 saat) inkübe edin.
- Her plaka üzerinde koloni sayısını saymak. başarılı transformantların sayısını hesaplayın
, nerede 
kolonilerin sayısı, 
bir geri kültür hacmi (1.000 ul) ve 
Kurtarma kültürün hacmi (1 ul) kaplı olduğunu.
Not: Başarılı transformantların sayısı olmalıdır kural olarak, tüm mutasyonlar tam kapsama sağlamak için ≥1beklenen mutasyonların sayısının üzerinde 00 kat. Her NNS alt kütüphane ~ 53 pozisyon vardır, bu yüzden mutasyonlar beklenen sayısı 53 pozisyonları 32 × kodonlar / pozisyon ≈ 1.7 × 10 3'tür; Bir kütüphane büyüklüğü ≥100 kat (≥1.7 x 10 5) vermek üzere, her bir plaka üzerine ≥170 kolonileri olmalıdır. - üreticinin talimatlarına göre, bir plazmid arındırma kiti kullanılarak kültürden plazmid DNA izole etmek ve daha sonra bir dsDNA kantitasyonu ayıracı kullanılarak ölçüldüğü. birlikte her bir plazmid, 100 ng karıştırın. Bu son Bütün protein doyma mutagenezi kitaplığı oluşturur.
- Beş NNS alt kütüphane gruba her NNS alt kütüphane PCR ürünü 100 ng karıştırın. üreticinin talimatlarına ardından, bir DNA saflaştırma kiti kullanılarak örnekleri temizlemek ve daha sonra bir ds kullanarak konsantrasyonu ölçmekDNA kantitatif reajanı.
, nerede 
kolonilerin sayısı, 
bir geri kültür hacmi (1.000 ul) ve 
Kurtarma kültürün hacmi (1 ul) kaplı olduğunu. Antibiyotik Direnci için TEM-1 Tüm-protein Doygunluk Mutagenez Kütüphanesi 3. Seçim
- Ön seçim kültürünün hazırlanması.
- Suda 0.5 ng / ul protokol adımı 2.3.7 den plazmid sulandırmak ve bir mikrosantrifüj tüp 20 ul aktarın. yeniden, dönüşümü gerçekleştirmeköğrenilmesidir, kaplama ve daha önce 999 ul LB transfer dışında, protokol aşamasında 2.3.5 yılında SOB kurtarma kültürü 1 ul açıklandığı gibi O / N büyüme
- koloni sayısını sayın. Tüm mutasyonların tam kapsama sağlamak için ≥10 6 başarılı transformantları (10 6 ≈ 32 kodonlar / pozisyon × 100 × 263 pozisyonlar) belirten ≥100 koloni olmalıdır.
- 50 mi O / N kültür konsantrasyonu ölçümü.
- Bir spektrofotometre küvete 1 mL LB ekleyerek LB boş hazırlayın. bir spektrofotometre ile OD600 ölçün.
- 900 ul LB 100 ul yeniden süspanse O / N kültür 10 kat seyreltilir OD600 ölçün. Boş bir OD600 okumasını çıkart ve O / N kültür OD600 vermek üzere 10 ile çarpın.
- 37 ° C'de ~ 30 dakika boyunca protokolün adım 1.1 üç kültür şişeleri önceden ısıtın. OD600 = 0.1 için O / N kültürünü sulandırmak ve bir şişede (son OD600 = 0.001) 1 ml ekleyin. Tonun "ön seçim kültürü" dir.
- çalkalama (200 rpm) ile 37 ° C 'de "ön seçim kültür" inkübe edin. Periyodik OD600 = 0.1 (~ 2.5 saat) kadar (kültür 10 kat seyreltilmesi gerekli değildir) protokolü Adım 3.1.3 gibi OD600 ölçülerek büyüme izlemek.
- iki adet 50 ml konik tüp ön seçim kültür 100 ml aktarın. 4 ° C'de 6 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant en çıkarmak ve tek 15 konik tüp içine birleştirmek. santrifüj tekrarlayın ve tüm süpernatant kaldırmak. -20 ° C'de saklayın.
- Ampisilin direnci için seçme.
- ön seçim kültürü kuluçka iken, 10 ml su içinde 0.5 g sodyum ampisilin çözülmesiyle su içinde Amp 50 mg / ml stok hazırlama. 4 ° C 'de 0.2 um filtresi ve deposunu kullanan sterilize edin.
- Diğer iki şişelere mL, 12 ug / bir son konsantrasyona ve ön seçim kültürü gibi tha bir hacme kadar Tet ekle Nihai OD600 = 0.001 t. Bir şişeye, 50 ug / ml'lik nihai bir konsantrasyon için, 1 ml Amp - bu "seçme kültürü".
- çalkalama (200 rpm) ile 37 ° C 'de kültür inkübe edin. OD600 = 0.1 (~ 2.5 saat) kadar hiçbir ampisilin önceki adımda ilave edildiği için kültür büyümesini izlemek. Şu anda, aynı zamanda seçim kültürünün OD600 ölçmek.
- 0.1 içine seçim kültürünün OD600 bölün ve 100 ml ile çarpın. 4 ° C'de 6 dakika boyunca 4000 x g'de 50 ml konik tüp ve santrifüj Bu hacim (~ 400 mi) aktarın. süpernatant en çıkarmak ve tek 15 konik tüp içine birleştirmek. santrifüj tekrarlayın ve tüm süpernatant kaldırmak.
- üreticinin talimatlarına göre, ön seçim (Protokol Adım 3.1.6) ve seçim (Protokol Adım 3.2.4) kültürü hücre pelletleri plazmid DNA izole etmek ve daha sonra bir dsDNA kantitasyonu ayıracı kullanılarak ölçüldüğü.
- Yüksek sekanslama için numunelerin hazırlanması
- ortogonal primerleri ile NNS alt kütüphane grupları de-multiplex 25 ul PCRlar hazırlayın
- Tablo 9 'a göre bir PCR master karışımı hazırlamak; On PCR tüplerine 23 ul transfer.
- 10 - 6 tüpleri 5 ve seçme kültüründen - 1 tüpleri PCR için ön seçim kültüründen 0.5 ng / ml saflaştırılmış plazmid DNA 1 ul ekleyin.
- ilgili ters ortogonal primerler OP1_R ile OP5_F - - birlikte, 50 50 uM ileri ortogonal primerler OP1_F ul karıştırın OP5_R. Aynı sırayla, PCR tüplerine transferi 1 ul 1 - 5 ve 6 - OP5_F ve OP1_R - - OP5_R OP1_F dizileri için Materyallerin 10. Bknz Tablo.
- PCR PCR tüpleri aktarın. Aşağıdaki programı çalıştır: 30 saniye boyunca 98 ° C; 20 devir: 10 sn, 55 ° 98 ° C; 20 sn için Cı, 1.5 dakika 72 ° C; 2 dakika 72 ° C; 4 ° C'de tutun.
- NNS alt kütüphane gruplarının her biri izole etmek 25 ul PCRlar hazırlayın
- -100 kat sulandırmak PCR tüpleri ayırmak için her 1 ul aktarılması ve su 99 ul ekleyerek protokol adım 4.1.1.4 on PCRlar. Mix, daha sonra 99 ul dışarı pipet ve atın.
- ilgili ters primerler Group1_R ile Group5_F - - birlikte 50 uM ileri primerler Group1_F 50 ul karıştırın Group5_R. Aynı sırayla transfer 1 ul tüpleri PCR 1 - 5 ve 6 - Group5_F ve Group1_R - - Group5_R Group1_F dizileri için Materyallerin 10. Bknz Tablo.
- Tablo 9'a göre bir PCR master karışımı hazırlayın Her bir PCR tüpü 23 ul transfer. PCR PCR tüpleri aktarın; protokol aşamasında 2.2.1.3 aynı programı çalıştırın.
- indeksleme dizileri eklemek için son 25 ul PCRlar yürütmek
- diUd PCR tüpleri ayırmak için her 1 ul aktarılması ve su 99 ul ekleyerek protokol adım 4.1.2.3 on PCRlar 100 kat. Mix, daha sonra 99 ul dışarı pipet ve atın.
- Tablo 9'a göre bir PCR master karışımı hazırlayın Her bir PCR tüpü 23 ul transfer.
- 505_F sırasıyla - NNS alt kütüphane gruplardan 1-5, kaynaklanan şablonuyla borular için 501_F tüp ileri primerler başına 0.5 ul aktarın. seçim öncesi ve seçim kültürlerinden kaynaklanan şablonuyla borular için, tüp başına 0.5 ul sırasıyla primerleri 701_R ve 702_R ters aktarın. 501_F dizileri için malzemeler İçindekiler'i izle - 505_F ve 701_R ve 702_R.
- PCR PCR tüpleri aktarın ve adım 2.2.1.3 programı çalıştırın.
- Mix ve örnekleri arındırmak
- Ölçü konsantrasyonları, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir dsDNA kantitasyonu reaktif kullanılarak hazırlanabilir. Her PCR ürünü int 100 ng Mixoa tek mikrosantrifüj tüp.
- 0.2 ug / ml etidyum bromür (DİKKAT) bir% 2 agaroz jel hazırlayın.
- Karışık PCR ürünleri örnek 6x jel yükleme boyası ekleyin. DNA merdiveni ile jel ilk sokağın yükleyin; numunenin tüm hacmi yükleyin.
- 50 dakika boyunca 100 V jel çalıştırın. Uzun dalga boylu UV ışığı (DİKKAT) kullanarak jel gözünüzde canlandırın. ~ 360 bp PCR ürünü içeren tüketim dilim; tüp mikrofuge'de transfer. Jel dilimi 20 ° C'de saklanabilir.
- üreticilerin talimatlarını izleyerek, bir jel ekstraksiyon kiti kullanılarak örnek arındırmak ve dsDNA kantitatif ayıracı kullanılarak konsantrasyonu ölçmek. Bu yüksek sekanslama için son örnek.
- Yüksek verim sıralama platformu üzerinde Dizisi (Bu protokolde kullanılan platform için Malzemelerin Tablo).
- nM olarak örnek konsantrasyonunu hesaplamak
olan ng / ul numune konsantrasyonu ve 
Örnek DNA (~ 360 bp) sekansı uzunluğudur. EB tamponunda 4 nM örnek sulandırmak. - örnek denatüre ve melezleme tamponunda 9 pM sulandırmak için üreticinin talimatlarına uyun.
- Yük reaktif kartuşu içine numune 600 ul. üreticinin talimatlarına ve ekrandaki istemleri aşağıdaki dizisi.
- nM olarak örnek konsantrasyonunu hesaplamak
- ortogonal primerleri ile NNS alt kütüphane grupları de-multiplex 25 ul PCRlar hazırlayın
- Dizileme veri analizi
- Flash (Short hızlı Uzunluğu Ayarı okur) 20 indirin sıralama elde fastq.gz dosya ile birlikte klasöre koyun.
- Kullanım Flaş eşleştirilmiş sonuna tekabül fastq.gz dosyaları endeksleri her çifti için okur (ileri ve geri ön seçim ve seçim kültürleri için her NNS alt kütüphane grubu için okuma) katılmak için.
- okur her çift katıldıktan sonra, ön seçim veya seçim kültürlerden sonuçları için ayrı klasörler halinde out.extendedFrags.fastq çıktı dosyası yerleştirin. Için o tekabül eden (yani., 1.fastq, 2.fastq, vb) NNS alt kütüphane grubuna göre out.extendedFrags.fastq çıktı dosyasını yeniden adlandırın.
- hesaplamalı komut NNS_DataAnalyzer.m çalıştırın her NNS alt kütüphane grup için, yabani tip için, tek tek her bir amino asit mutasyon sayıları ve sayıları hesaplamak için her klasörden (Ek kod dosyası bakınız).
- Fitness etkisi hesaplamak
Her mutasyon seçimde elde edilen sayım oranı baz on logaritma (as
) Ön seçim karşı ( 
vahşi tipe göre) durumu: 
.
olan ng / ul numune konsantrasyonu ve 
Örnek DNA (~ 360 bp) sekansı uzunluğudur. EB tamponunda 4 nM örnek sulandırmak. 
Her mutasyon 
) Ön seçim karşı ( 
vahşi tipe göre) durumu: 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ortogonal hazırlama siteleri içeren beş modifiye pBR322 plazmid plazmid haritası (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) Şekil 2A'da gösterilmiştir. Ortogonal primerler PCR beş pBR322_OP1-5 plazmid ile birlikte, ayrı ayrı dik primerlerin her çifti kullanılarak gerçekleştirilebilir veya tüm plazmidler eksi ortogonal primer çifti uyan plazmid olan edildi özel olup olmadığını test etmek için. Uygun plazmid dahil, doğru ürün sadece elde edildi ve herhangi bir boyutta ürün yokluğunda (Şekil 2B) elde edilmiştir.
Temsili deney, bu metin (Şekil 1) 'de tarif edilen protokol izlenerek gerçekleştirildi. Işlemlerinden sonra (protokol bölüm 4.2), 6.2 x 10 6 ön seçim durumda okur ve 6.3 x 10 6 50 ug / ml ampisilin seçimi conditi okurelde edilmiştir. Elde edilen her bir sayısı ön seçim durumundan asit mutasyonu karakteristik log-normal dağılımı (Şekil 3A) 13 Ekran amino. Mutasyon% 98.9 için ön seçim kültür dizilenmesi ile en az bir sayıma (465 100'den az sayımları) ürün elde edilmiştir% 91.2 için ve 100'den büyük sayısını (58 Resim sayımları). Şekil 3B göre spor etkisini tasvir etmektedir (), TEM-1 her pozisyonda her mutasyon için; Şekil 3C'de gösterilmiştir dağılımı. 50 ug / ml ampisilin de seçimi altında, mutasyonların (Şekil 3B'de, beyaz piksel ve Şekil 3C'de büyük pike tekabül eden ≈ 0) nötr ya da neredeyse nötr Spor etkiye sahiptir. Bu konsantrasyonda mutasyon küçük bir kısmı (Şekil 3B ve Şekil 3C sol kuyruk mavi piksel karşılık gelen, << 0) fitness önemli etkileri vardır; ihr ectedly, bu son derece korunmuş, etkin alan artıklarından (S70, K73, S130, D131, N132, K234 ve G236) 13,14 içindeki mutasyonlar dahildir. Tahmin edilebileceği gibi TEM-1 ampisilin hidroliz de yüksek verimli olduğundan aksine, birkaç mutasyonlar önemli ölçüde ((Şekil 3B kırmızı piksel karşılık gelen >> 0) TEM-1 olduğu üzerinde uygunluğu artırmak 
≈ 10 7 M -1 s -1) 14.
Şekil 1. Ampisilin Seçimi altında TEM-1 β-laktamaz için Tüm protein Doygunluk Mutagenez Protokolü Anahat. Protokolde açıklandığı gibi Eylemler kalın gösterilmiştir. Numaralı protokol adımlar ana metne referans için sol gösterilmektedir.k "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Ortogonal Astar Sitesi Plazmid Vektörler Doğrulama. Ortogonal hazırlama sitesi (- pBR322_OP5 pBR322_OP1) içeren beş modifiye pBR322 plazmid (A) plazmid haritası. dik astar siteleri konumu ve yönü gösterilir. Birkaç kısıtlama siteleri yerler etiketli; (Tüm TEM-1 genini ve promotör içerir) TEM-1 tam protein doyma mutagenezi kütüphane AatII ve Avrll kısıtlama siteleri arasında-klonlanmıştır. Kısaltmalar: tet tetrasiklin direnç geni, replikasyon orijinini ori (B) dik primerler (Op1-OP5) her bir çifti veya her plazmid eksi ilgili plazmid ile beş pBR322_OP1-5 plazmidler (+) ihtiva eden bir PCR ile test edildi (. ˗). Gösterilen bir etidyum bromid olduğuboyanmış agaroz jeli, her PCR reaksiyonunda yüklü, boyut elektroforeziyle ayrıldı (ağ / hac% 1). beklenen ürün boyutu 1,628 bp; İlk şerit bir DNA merdiveni olduğunu, ilgili standartların boyutları belirtilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
TEM-1 β-laktamaz Tüm protein Doygunluk Deneyi Şekil 3. Sonuçları. (A), histogram ön seçim durumundan kütüphanenin yüksek verimli sekanslama elde edilen her amino asit mutasyonu sayısı dağılımını gösteren. Kolaylık olması açısından, sıfır sayısı (53 mutasyonlar) sahip mutasyonlar birinin sayısı sahip olarak gösterilmiştir. Tüm tek amino asit mutasyonlarının (B) Spor etkileri TEM-1 olarak seçimi altında / ml ampisilin 50 ug. Gösterilen verilermavi temsil zararlı etkisi ile kolorimetrik tasvir edilen görece spor etkisi () içeren matris, yabani tip bir olumlu etkisi ve beyaz hiçbir spor etkisi göreli kırmızı. Hiçbir sayıları ön seçim kültüründen elde edildiği için mutasyonlar siyah renklidir. Satırlar birincil sekans boyunca pozisyonları tasvir ve sütunlar yirmi amino asitlerden biri mutasyon gösterir veya kodonu stop (tek harfli kod ile gösterilir, * kodonu durağı); TEM-1 ikincil yapısı sağ belirtilen aktif sitede sol ve birkaç yüksek derecede korunmuş motiflerin belirtilir. (C), histogram göre spor etkileri dağılımını gösteren. Ön seçim kültürü sıralanması elde edilen> 100 sayıları ile bu mutasyonlar için sonuçlar gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| reaktif | Kütle veya Hacim | Yorum Yap |
| tipton | 2 g | |
| Maya ekstraktı | 0.5 gr | |
| Sodyum klorit | 0.06 g | |
| Potasyum klorür | 0.02 g | |
| Magnezyum sülfat | 0.24 g | |
| Arıtılmış su | 100 mi |
Tablo 1. Süper Optimal Broth (SOB). 100 ml SOB (Protokol adım 1.1) hazırlanmasında kullanılan Reaktif isimler ve miktarları.
| reaktif | Kütle veya Volume | Yorum Yap |
| tipton | 10 g | |
| Maya ekstraktı | 5 g | |
| Sodyum klorit | 10 g | |
| Arıtılmış su | 1 L'lik |
Tablo 2. Luria-Bertani Broth (LB). Reaktif isimleri ve miktarları 1 L LB (protokol adım 1.1) hazırlama olarak kullanılır.
| reaktif | Kütle veya Hacim | Yorum Yap |
| tipton | 10 g | |
| Maya ekstraktı | 5 g | |
| Sodyum klorit | 10 g | |
| ağar | 15 g | |
| Arıtılmış su | 1 L'lik |
LB-agar (protokol adım 1.1) hazırlanmasında kullanılan Tablo 3. LB-agar. Reaktif isimleri ve miktarları.
| reaktif | hacim | Yorum Yap |
| 5x PCR tamponu | 1450 ul | |
| PCR katkı maddesi | 1450 ul | |
| 2 mM dNTP | 725 ul | 2 mM her bir nükleotid |
| 50 uM AatII_F ya AvrII_R primeri | 145 ul | |
| 1 ng / | il pBR322_AvrII plasmidi | 145 ul | |
| 2 birim / ul DNA polimerazı | 72.5 ul | |
| Su | 363 ul |
Tablo 4. İlk tur mutajenik PCR Master Mix. İlk turda mutajenik PCR (protokol adım 2.2.1) master karışım hazırlamak için Reaktif isimleri ve miktarları. Toplam miktar 290 25 uL reaksiyonları için yeterlidir.
| reaktif | hacim | Yorum Yap |
| 5x PCR tamponu | 1450 ul | |
| PCR katkı maddesi | 1450 ul | |
| 2 mM dNTP | 725 ul | 2 mM her bir nükleotid |
| 50 uM AatII_F primeri | 145 ul | |
| 50 uM AvrII_R primeri | 145 ul | |
| 2 birim / ul DNA polimerazı | 72.5 ul | |
| Su | 2.973 ul |
Tablo 5. İkinci tur mutajenik PCR Master Mix. İkinci turda mutajenik PCR (protokol adım 2.2.2) master karışım hazırlamak için Reaktif isimleri ve miktarları. Toplam miktar 290 25 ul reaksiyonlar için yeterlidir.
| reaktif | hacim | Yorum Yap |
| 5x PCR tamponu | 20 ul | |
| PCR katkı maddesi | 20 ul | |
| 2 mM dNTP | 10 ul | 2 mM her bir nükleotid |
| 50 uM AvrII_F primeri | 2 ul | |
| 50 uM AatII_OP1_R - AatII_OP5_R primeri | 2 ul | İlgili plazmid ile eşleştirilmiş reaksiyon başına bir primer, |
| 1 ng / | il pBR322_OP1-5 plasmidi | 2 ul | reaksiyon başına bir plazmid |
| 2 birim / ul DNA polimerazı | 1 ul | |
| Su | 43 ul |
Tablo 6. Klonlama Vektör PCR. Reaktif adları ve klonlama vektörleri (protokol adım 2.3.2) yapmak için PCR hazırlanması için miktarlar.
| reaktif | hacim | Yorum Yap |
| 10x sınırlayıcı enzim tamponu | 5 ul | |
| 4 adet / ul Avr II | 2.5 ul | |
| 20 adet / ul AatII | 0.5 ul | |
| kısıtlama sindirmek DNA | 500 ng için ses | |
| Su | 50 ul toplam hacmine |
Tablo 7. Kısıtlama sindirir. Reaktif isimleri ve miktarları klonlama vektörleri ve NNS alt kütüphane gruplar (protokol adım 2.3.3) kısıtlama digests için.
| reaktif | hacim | Yorum Yap |
| 10x T4 DNA ligaz tamponu | 5 ul | |
| saflaştırılmış kısıtlama-sindirilmiş NNS alt kütüphane grup DNA | 48 ng için ses | |
| saflaştırılmış bir kısıtlama sindirilmiş klonlama vektörü DNA | 52 ng için ses | |
| 400 birim / ul T4 DNA ligazı | 1 ul | |
| Su | 20 ul toplam hacmine |
3 vektörü: 1 kısıtlama sindirilmiş NNS alt kütüphane gruplarla klonlama vektörleri ligasyonu için Tablo 8. Ligasyonlar Reaktif isimleri ve miktarları. Molar oranı (protokol adım 2.3.4) yerleştirin.
| reaktif | hacim | Yorum Yap |
| 5x PCR tamponu | 55 ul | |
| PCR katkı maddesi | 55 ul | |
| 2 mM dNTP | 27.5 ul | 2 mM her bir nükleotid |
| 2 birim / ul DNA polimerazı | 2.75 ul | |
| Su | 113 ul |
Tablo 9. PCR Reaktifler Yüksek verimlilik sıralaması için Örnekleri Hazırlama. NNS alt kütüphane gruplar izole dik primerler (4.1.1) ile de-çoğullama için kullanılan PCR master karışımları hazırlamak için Reaktif isimleri ve miktarları, (protokol adım 4.1.2) ve indeksleme dizileri (protokol adım 4.1.3) ekleyerek. Toplam miktar 11 25 ul reaksiyonlar için yeterlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada bir protokol, yüksek verimli DNA dizilemesi kullanılarak, tüm protein doyma mutagenezi kütüphaneleri fonksiyonel değerlendirme yapmak için tarif edilmektedir. yöntemin önemli bir özelliği, klonlama işlemi sırasında dik primerler kullanılmasıdır. Kısaca, her bir amino asit pozisyonu, mutajenik PCR ile randomize edilir ve birleştirilen dizi uzunluğu, yüksek verimli sekanslama ile yerleştirilmiştir pozisyonları gruba karıştırılır. Bu gruplar, ortogonal hazırlama yerleri, karıştırılır ve seçime tabi çiftleri içeren plazmid vektörleri, o zaman dik primerler kullanılarak de-çoklanır ve daha sonra derin bir dizilenmiştir. mutasyonlar uzunluğu sınırı sıralama içinde okunan sınırlı olduğundan, bu yaklaşım yararlı sayısı uzun sıralama daha boyutu genler için mutasyonları içeren uzunluğu okuma okuma maksimize eder. Buna ek olarak, bu teknik, tüm mutatio aynı anda ya da "tek yığın" seçilmesine izin veririş yükünü yanı sıra mutasyonlar seçimi farklı düzeylerde tecrübe olasılığını azaltarak nal kütüphane. Pratikte, protokol büyük ölçüde endişe organizasyonunda kritik adımlar: klonlama işlemi (protokol adım 2.3) sırasında bir gruba mutajenik PCR ürünlerinin doğru karıştırma ve doğru dik hazırlama sitesi vektörü içine onların sonraki klonlama sağlamalıdır; sekanslama için numune hazırlanması (protokol adım 4.1) içinde doğru dik primerler gibi primerler NNS alt kütüphane gruplarının her biri izole etmek ve indeksleme dizilerini eklemek için kullanılmalıdır.
protokolün üç ana adım - kütüphane inşaat, seçim ve sıralama - birkaç yönden modifiye edilebilir. çeşitli teknikler kullanılarak mutasyonlar olabilir kütüphane oluşturma biri sırasında, örneğin, hata eğilimli PCR ile ya da diğer bir nükleotid küçük bir kısmını doping sentezlenebilir oligonükleotidler kullanılarak gen oluşturarak21 s. Bir protein kesimleri (yani, NNS alt kütüphane gruplar), ya da alternatif genotip kökenden 22 yılında içinde çift ya da daha yüksek mertebeden mutasyonları içerecek şekilde kütüphane inşa olabilir. Önemlisi, kütüphane inşa adımına tüm değişiklikler, ancak sırayla ve sıralama mutasyonlar arasında yer yazışma uzunluğu korunur okuma kriterini karşılamak gerekir. Bu kriter, bu nedenle bir proteinin birden çok mutasyonun kapsamlı çalışmalardan yönelik protokolün uygulanmasını dışlar. Protokolün ikinci bölümünde yapılan değişiklikler alternatif seçim koşulları şunlardır: (. Örneğin, sıcaklık, besin düzeyleri) farklı β-laktam tipleri (veya kombinasyonları) ve konsantrasyonları, dış stres koşulları, ev sahibi türü (örn bakteri farklı türleri), ya da farklı örnekleme süresi (gün saat). Örneğin, önceki çalışmalarında hepimiz tek bir amino asit mutasyonlarının spor etkilerini araştırdıkTEM-1 ampisilin farklı konsantrasyonlarda altında, ve üçüncü kuşak sefalosporin sefotaksim 13 altında. protokolün üçüncü aşamasında getirmedi, şu anda (Malzeme Tabloya bakınız) Burada kullanılan sıralama platformunun seçimi sapma önermiyoruz. sıralama uzunlukları diğer platformlarda şu anda artık gerçekten vardır okurken, sayısı elde şu anda çok düşük okur; Genel olarak, bir mutasyonun etkisi belirlendi edilebilir doğruluk elde okuma sayısı (protokolün adım 4.2.5 denklemi bakınız) ile orantılıdır.
Büyük ölçüde basitleştirmek için, protokol Ancak, burada tarif edilen yöntem, bir yüksek verimli bir seleksiyon veya tarama tahlili yerine olan diğer sistemlere uzatılabilir, bir model sistem olarak TEM-1 β-laktamaz kullanır. Bu tür analizler inşa ancak sık sık Önemsiz olmayan: Birincisi, birlikte gen (mutasyon) ve protein bölümlendirme için bir strateji kurulmalıdır, Bir hücre içinde, (a Mikroakiskan platformu gibi) sıvı damlacık veya faj gösterimi, örneğin. İkincisi ve en önemlisi, protein fonksiyonu ve seçilebilir bir fenotip veya uygunluk arasındaki niceliksel bağlantı, tesis edilmelidir. metabolizması veya antibiyotik direnç katılan enzimler için, besin açılan çıkış veya antibiyotik ortamda büyümesini hücrelerinin üreme özelliği çoğu enzimatik aktivitesi direkt fonksiyonudur. Daha sentetik yaklaşım raportör gene, bağlanma afinitesi protein-protein bağlama, örneğin, diğer sistemlerde kullanılabilir (ör., Flüoresan protein) bakterilerde sentezleme veya maya 11,23 veya Mikroakiskan sistemi 24 bir florojenik bir enzim substrat kullanılarak . Son olarak, bu tip bir analiz bir bütün protein mutagenez kitaplığı büyüklüğü gidermek için ölçeklenebilir olmalıdır.
Özet olarak, bütün bir protein doyma mutagenezi kütüphaneleri fonksiyonel değerlendirmesi için yüksek verimli bir dizi-bazlı yaklaşım descr olanBurada IBED. yaklaşımın merkezinde gen boyunca segmentler içindeki mutagenez kütüphane inşaatı ve çoğullama ve de-çoğullama kütüphanesi için her segmentin etiketlemek için dik astar barkodların kullanılmasıdır. Bu protokol, hali hazırda, uygun bir yüksek verimli bir seçimi veya ekran geliştirilmiştir olan başka proteinler de uygulanabilir olduğunu tahmin ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typtone | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| Yeast extract | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| Petri plates | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol scale, standard desalting |
| pBR322_AvrII | available upon request | pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | available upon request | five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491L | includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer) |
| 15 ml conical tube | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR plate, 96 well | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 well plate seal | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96-well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| 96-well black-walled, clear bottom assay plates | Corning | 3651 | |
| Lambda phage DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA reagent | Invitrogen | P7581 | dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4 |
| Victor 3 V microplate reader | PerkinElmer | ||
| DNA purification kit | Zymo Research | D4003 | |
| Microcentrifuge tubes | Corning | 3621 | |
| Long-wavelength UV illuminator | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| Agarose gel DNA extraction buffer | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 electrocompetent E. coli | Avidity | EVB100 | |
| Electroporator (E. coli Pulser) | Bio-Rad | 1652102 | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| Plasmid purification kit | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 well PCR strip tubes | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32854 | dsDNA quantitation reagent |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Ampicillin sodium salt | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq desktop sequencer | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform |
| FLASh software | John Hopkins University - open source | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC |
||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG |
||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG |
||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC |
||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC |
||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC |
||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC |
||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG |
||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC |
||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC |
||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC |
||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC |
||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC |
||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG |
||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
References
- Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
- Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
- Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
- Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
- Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
- Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
- Fowler, D. M., et al.
- Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
- McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
- Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
- Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
- Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
- Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
- Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
- Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
- Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
- Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
- Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
- Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
- Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).
