Summary
We presenteren een protocol voor de functionele beoordeling van de uitgebreide single-site verzadigingsmutagenese bibliotheken van eiwitten met behulp van high-throughput sequencing. Belangrijk is dat deze aanpak maakt gebruik van orthogonale primer paren bibliotheek bouw en sequencing multiplexen. Representatieve resultaten met behulp van TEM-1 β-lactamase gekozen klinisch relevante dosering van ampicilline wordt verschaft.
Introduction
Mutagenese al lang toegepast in het laboratorium om de eigenschappen van biologische systemen en hun evolutie en mutante eiwitten of organismen produceren met verbeterde of nieuwe functies. Terwijl vroege benaderingen gebruikt methoden die willekeurige mutaties in organismen produceren, de komst van recombinant DNA-technologie konden de onderzoekers selecteren veranderingen aan DNA in een plaatsspecifieke wijze, bijv. Plaatsgerichte mutagenese 1,2 voeren. Met de huidige technieken, meestal met behulp van mutagene oligonucleotiden in een polymerase kettingreactie (PCR), is het relatief gemakkelijk om kleine aantallen mutaties (bijv., Puntmutaties) in een bepaald gen 3,4 creëren en te beoordelen. Het is echter veel moeilijker, wanneer het doel nadert, bijvoorbeeld de creatie en evaluatie van alle mogelijke single-site (of hogere orde) mutaties.
Er is al veel geleerd van vroege studies proberen om grote aantallen m beoordelenutations in genen, de toegepaste methoden waren vaak moeizaam, bijvoorbeeld waarbij de beoordeling van elke mutatie afzonderlijk gebruikt nonsense suppressor stammen 5-7, of werden de kwantitatieve vermogen beperkt vanwege de geringe diepte van Sanger sequentiebepaling sequentiebepaling 8. De technieken die in deze studies zijn grotendeels verdrongen door werkwijzen die gebruik maken high-throughput sequencing technologie 9-12. Deze conceptueel eenvoudige benaderingen behelzen het creëren van een bibliotheek omvattende een groot aantal mutaties, het onderwerpen van de bibliotheek om een scherm of selectie voor de functie, en diep-sequencing (bijv. In de orde van> 10 6 sequencing gelezen) de bibliotheek verkregen voor en na selectie. Zo de fenotypische of geschiktheid effecten van een groot aantal mutaties, weergegeven als de verandering in de frequentie bevolking van elke mutant, gelijktijdig en kwantitatief worden beoordeeld.
We hebben eerder introduceerde een simp(. dwz gehele eiwit verzadigingsmutagenese bibliotheken) le benadering voor het keuren bibliotheken van alle mogelijke enkele aminozuur mutaties in proteïnen, van toepassing op genen met een lengte langer dan de sequentiebepaling leest lengte 11,13: Ten eerste, elke aminozuurpositie gerandomiseerd door plaatsgerichte mutagene PCR. Tijdens dit proces wordt het gen verdeeld in groepen bestaande uit aaneengesloten posities met een totale lengte opgevangen door het platform sequencing. De mutagene PCR-producten voor elke groep worden vervolgens gecombineerd en elke groep onafhankelijk onderworpen aan selectie en high-throughput sequencing. Door een overeenkomst tussen de locatie mutaties in de sequentie en de sequentie gelezen lengte, deze benadering het voordeel van het maximaliseren sequencing diepte: terwijl men eenvoudig kan sequencen dergelijke bibliotheken in korte vensters zonder opsplitsing in groepen (bijvoorbeeld door een standaard geweer. sequencing aanpak), de meeste leest verkregen zouden wild-type en dus de m bedragenajority sequencing throughput verloren (bijvoorbeeld voor een gehele eiwit verzadigingsmutagenese bibliotheek van een 500 aminozuur proteïne gesequenced 100 aminozuren (300 bp) glas ten minste 80% van leest de wild-type sequentie).
Hier wordt een protocol voorgelegd die high-throughput sequentiebepaling gebruikt voor de functionele beoordeling van gehele eiwitten verzadigingsmutagenese bibliotheken met behulp van voornoemde benadering (geschetst in figuur 1). Belangrijker introduceren we het gebruik van orthogonale primers in de bibliotheek kloonproces elke reeksgroep, waardoor ze te multiplexen in een bibliotheek, gelijktijdig onderworpen aan screening of selectie barcode, en vervolgens de-gemultiplext voor diepe sequencing. Aangezien de sequentie groepen niet afzonderlijk worden onderworpen aan selectie, vermindert de werkdruk en zorgt ervoor dat elke mutatie ervaart hetzelfde selectie. TEM-1 β-lactamase, een enzym dat een hoge resistentie verleent tegenβ-lactam antibiotica (bv. ampicilline) in bacteriën wordt gebruikt als modelsysteem 14-16. Een protocol is beschreven voor de beoordeling van een geheel eiwit verzadigingsmutagenese bibliotheek van TEM-1 in E. coli onder selectiedruk bij een benaderde serumniveau een klinische dosis van ampicilline (50 ug / ml) 17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Zie figuur 1 voor het overzicht van het protocol. Verschillende stappen en reagentia in het protocol vereist veiligheidsmaatregelen (aangeduid met "LET OP"). Raadpleeg veiligheidsinformatiebladen voor gebruik. Alle protocol stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.
1. Bereid Cultuur Media en Plates
- Bereiden en steriliseer autoclaveren 1 L gezuiverd water, 100 ml Super Optimale Broth (SOB; Tabel 1), 1 L Luria-Bertani bouillon (LB; Tabel 2) en 1 L LB-agar (Tabel 3). Bereid afzonderlijk en steriliseer drie cultuur kolven die elk 1 L LB.
Let op: Het gehele protocol "water" verwijst naar autoclaaf gesteriliseerd gezuiverd water; SOB, LB en LB-agar verwijzen naar de autoclaaf gesteriliseerde oplossingen. - Bereid een 12 mg / ml voorraad Tet door het oplossen van 0,12 g tetracycline hydrochloride in 10 ml 70% ethanol. Steriliseren onder toepassing van een 0,2 urn filter en opslagbij 4 ° C beschermd tegen licht.
- Koel LB-agar met 50 ° C en voeg 1 ml Tet voorraad (eindconcentratie van 12 ug / ml Tet). Giet in petri platen en koele bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht.
2. De bouw van de Whole-gen verzadigingsmutagenese Bibliotheek
Opmerking: Primers; Afgerond PCR's, beperking verteert en ligaties; en gezuiverde DNA-monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
- Het ontwerpen van mutagenese primers
- Aan elke aminozuurpositie alle mogelijke aminozuren mutageniseren, ontwerp een paar complementaire mutagenese primers (sense / antisense voorwaartse en / achteruit) voor elke aminozuurpositie de volgende richtlijnen:
- Vervang het codon dat overeenkomt met de aminozuur te mutageniseren door NNS (waarbij N een mengsel van alle vier nucleotidebasen en S is een mengsel van cytosine (C) en guanine (G)) en het centrum in de primer, geflankeerd door ongeveer 15 nucleotiden aan elke kant.
- Controleer of de 5 'en 3' uiteinden eindigen in C of G en de smelttemperatuur (Tm) ongeveer 70 ° C 3. Gebruik de rekenkundige script NNS_PrimerDesign.m (Zie Aanvullende Code File) naar NNS mutagenese primers ontwerpen op basis van deze richtlijnen.
- Bestel primers van een commerciële bron. Voor het gebruiksgemak, hebben ze gesynthetiseerd in 96-well plaat formaat en vooraf verdund in water tot 50 uM, met één set platen met de sense primers en mutagenese andere de antisense primers.
- Vul een pipet bassin met water en gebruik een multichannel pipet 95 ul brengen naar 263 putjes drie 96-well platen. Verdun de primers 20-voudig tot 2,5 uM via een multichannel pipet 5 ul brengen van de 96-well platen bevattende de sense mutagenese primers de verwante putjes van de platen met water.
- Herhalingprotocol stap 2.1.3 om de antisense mutagenese primers verdunnen.
- Aan elke aminozuurpositie alle mogelijke aminozuren mutageniseren, ontwerp een paar complementaire mutagenese primers (sense / antisense voorwaartse en / achteruit) voor elke aminozuurpositie de volgende richtlijnen:
- Synthese van NNS subbibliotheken voor elke aminozuurpositie van tweestaps PCR plaatsgerichte mutagenese
- Voer de eerste ronde mutageen PCR's. Voor elke mutagenese primer, bereiden een 25 pi PCR-reactie met behulp van pBR322_AvrII plasmide als template en primers AatII_F of AvrII_R (sense mutagenese primers in combinatie met primer AvrII_R en antisense mutagenese primers gecombineerd met primer AatII_F, in totaal 526 PCR). Zie tabel van materialen voor AatII_F en AvrII_R sequenties.
- Bereid een PCR "master mix" door toevoeging van de reagentia uit tabel 4 tot een 15 ml conische buis. Over te dragen aan een pipet bekken. Gebruik een multichannel pipet tot 15 pl transfer naar 263 wells over drie 96-well PCR-platen. Gebruik een multichannel pipet 10 pi te brengen van de 96-well platen met de verdunde zin mutagenese primers voor de verwante putjes in de PCR-platen.
- Bedek elk PCR-plaat met 96 putjes seal. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 2 minuten.
- Breng de PCR-platen te thermocycler en start het volgende programma: 98 ° C gedurende 30 seconden; 20 cycli: 98 ° C gedurende 10 sec, 55 ° C gedurende 20 seconden, 72 ° C gedurende 1 min; 72 ° C gedurende 2 min; houden op 4 ° C.
- Herhaal stap protocol 2.2.1.1 - 2.2.1.3 voor de 96-well platen met de verdunde antisense mutagenese primers.
- Voer de tweede-ronde-mutageen PCR's. Voor elk aminozuur positie, bereiden een 25 pi PCR-reactie met behulp van primers AatII_F en AvrII_R, en de gemengde en verdund eerste ronde mutagene PCR-producten als een template (in totaal 263 PCR).
- Vul een pipet bassin met water en gebruik een multichannel pipet om 198 ul brengen naar 263 putjes drie 96-well platen.
- Combineer en verdun 100-voudig de mutagene PCR-producten voor elk aminozuur positie met behulp van een multichannel pipet omeerste overdracht 1 pl van de 96-well platen met PCR het PCR producten verkregen door mutagenese sense primers de verwante putjes van de platen met water. Herhaal vervolgens de overgang voor de PCR-producten als gevolg van de antisense mutagenese primers.
- Bereid een PCR "master mix" door toevoeging van de reagentia uit tabel 5 naar een 15 ml conische buis. Over te dragen aan een pipet bekken. Gebruik een multichannel pipet tot 24 pl transfer naar 263 wells over drie 96-well PCR-platen. Gebruik een multichannel pipet 1 pi brengen van de 96-well platen die de gemengde en verdund eerste ronde mutagene PCR producten om de verwante putten in de PCR-platen.
- Bedek elk PCR-plaat met 96 putjes seal. Centrifugeer bij ongeveer 200 xg gedurende 2 minuten. Transfer platen thermocycler en start het hetzelfde programma als in protocol stap 2.2.1.3.
- Analyseer resultaten van de tweede ronde mutageen PCR's door gelelektroforese.Zorg ervoor dat alle producten zijn van de juiste maat en afwezigheid van vervuilende producten.
- Voeg 2 ml van 2 x gel laadkleurstof een pipet bassin en vervolgens een multichannel pipet om 6 pl brengen naar 263 putjes drie 96-well platen. Gebruik een meerkanaalspipet overdragen 6 ui van de 96-well PCR-platen met de tweede ronde mutagene PCR producten om de verwante putjes van de 96-well platen bevattende kleurstof.
- Bereid een 1,5% agarosegel met 0,2 ug / ml ethidiumbromide (NB).
- Load DNA ladder in de eerste en laatste lanen van elke rij. Maak dan gebruik van een multichannel pipet tot 10 pl van de monsters te laden van protocol stap 2.2.3.1.
- Voer de elektroforese bij 100 V gedurende 40 minuten en het op een UV transilluminator.
- Herhaal protocol stappen 2.2.3.2 - 2.2.3.4 totdat alle monsters worden geanalyseerd.
- Nauwkeurig de concentratie van elk NNS subbibliotheek PCR product op een dsDNA kwantificering reagens.
- Overdrachtongeveer 15 ml buffer EB een pipet bassin. Gebruik een multichannel pipet tot 49 pl transfer naar 263 wells over drie 96-well black-walled, heldere bodem assay platen.
- Gebruik een multichannel pipet 1 pi van elke tweede stap PCR-product (protocol stap 2.2.2) over te dragen aan de verwante putjes van de 96-well assay platen.
- Bereid een DNA-concentratie standaardcurve door verdunning van lambda faag DNA 2 ng / ul in 300 ul buffer EB en dan 1002-voudige verdunningen (van totaal 11 concentraties). Breng 50 pl tot eerste elf kolommen van een rij van een van de 96-well testplaten uit de vorige stap waarin geen monster bevat; tot de twaalfde kolom voeg 50 ul buffer EB (blanco).
- Bereid dsDNA kwantificering reagens door het toevoegen van 75 pi reagens (zie tabel van Materialen) aan een 15 ml conische buis, voeg dan 15 ml EB buffer. Meng door de buis en vervolgens over te dragen aan een pipet bekken. Bescherm reagens tegen licht.
- Gebruik een multichannel pipet 50 pi bereid dsDNA kwantificatie reagensoverdracht aan elk putje van de assay platen. Meng door pipetteren up-and-down. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten beschermd tegen licht.
- Meten fluorescentie van elk monster met behulp van een microplaat reader en standaard fluoresceïne golflengte (excitatie 485 nm, emissie 520 nm; 0,1 sec).
- Trek de fluorescentie waarde van de blanco van alle monsters. Genereren van een standaardcurve van de fluorescentiemetingen lambda faagmonsters. Bereken de concentratie van elk monster met behulp van hun respectievelijke fluorescentiemetingen en de standaardcurve.
- Voer de eerste ronde mutageen PCR's. Voor elke mutagenese primer, bereiden een 25 pi PCR-reactie met behulp van pBR322_AvrII plasmide als template en primers AatII_F of AvrII_R (sense mutagenese primers in combinatie met primer AvrII_R en antisense mutagenese primers gecombineerd met primer AatII_F, in totaal 526 PCR). Zie tabel van materialen voor AatII_F en AvrII_R sequenties.
- Klonen van NNS sub-bibliotheken in selectie vectoren
- Meng 100 ng van elk NNS sub-bibliotheek PCR-product in vijf NNS sub-bibliotheek groepen. Na instructies van de fabrikant, het schoonmaken van monsters met behulp van een DNA-zuivering kit en meet de concentratie met behulp van een dsDNA kwantificatie reagens.
Opmerking: Elke groep bestaat uit ongeveer 53 contigue aminozuren posities afstand langs het TEM-1 sequentie (NNS subbibliotheek groepen 1-5 omvatten posities 26-78, 79-132, 133-183, 184-236, en 237-290, respectievelijk nummering volgens Ambler et al 19).. - Maak kloneringsvectoren voor elk NNS sub-bibliotheek groep.
- Bereid vijf 100 ul PCR volgens tabel 6, met gebruik van primers en AvrII_F AatII_OP1_R - AatII_OP5_R en plasmiden pBR322_OP1-5 als matrijs (AatII_OP1_R gekoppeld pBR322_OP1, etc.).
- Transfer naar thermocycler en start het volgende programma: 98 ° C gedurende 30 seconden; 25 cycli: 98 ° C gedurende 10 sec, 55 ° C gedurende 20 seconden, 72 ° C gedurende 1,5 min; 72 ° C gedurende 2 min; houden op 4 ° C. Zie T staat van Materialen voor sequenties van AatII_R en AvrII_F.
- Bereid een 1% agarosegel met 0,2 ug / ml ethidiumbromide (NB).
- Voeg 20 ul van 6x gel laadkleurstof elke PCR monster. Laad de eerste baan van de gel met DNA ladder; laden gehele volume van elk monster, het overslaan van ten minste ook een tussen de monsters.
- Run gel bij 100 V gedurende 50 min.
- Visualiseer gel met behulp van een lange golflengte UV-verlichting (LET). Accijnzen schijfjes met het PCR-product bij ~ 3500 bp; overbrengen naar microfugebuizen scheiden. Gelstukjes kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
- Volgens de instructies van de fabrikant, zuiveren monsters met behulp van een gel extractie kit en meet de concentratie dsDNA met een kwantificering reagens.
- Voor zowel de NNS subbibliotheek groepen (protocol stap 2.3.1) en kloneringsvectoren (protocol stap 2.3.2) ingestelde restrictiedigesten met AatII en AvrII enzymen volgens T abel 7. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Na instructies van de fabrikant, het schoonmaken van monsters met behulp van een DNA-zuivering kit en meet de concentratie met behulp van een dsDNA Quantitatie reagens.
- Opgericht ligatiereacties volgende Tabel 8 voor elk restrictie-gedigereerd NNS subbibliotheek groep cognate restrictie-gedigereerde kloneringsvector (NNS subbibliotheek groep 1 met pBR322_OP1, etc.). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Opruimen reacties met een DNA-zuivering kit volgens instructies van de fabrikant; elueer DNA met 20 pl water.
- Transformatie het geheel van de gezuiverde ligatiereacties in bibliotheek efficiënte E. coli-cellen door elektroporatie.
- Dooi elektrocompetente E. coli-cellen en vervolgens plaats cellen en gezuiverd ligatiereacties op ijs.
- Breng 10 pl ontdooide cellen elk gezuiverd ligatiereactie en breng elektroporatie cuvet. Electroporate 1,8 kV.
- Recover cellen door resuspenderen in 1 ml SOB. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Resuspendeer 10 pi van elke herstel cultuur in 990 pi LB; 100 pl uitgespreid op LB-agarplaten containing 12 ug / ml Tet. Incubeer de platen O / N (= 16 uur) bij 37 ° C.
- Voor elk herstel cultuur, bereiden een 250 ml kolf met 50 ml LB en 50 pi Tet voorraad. Transfer naar het resterende ~ 1 ml van herstel cultuur kolf. Incubeer O / N (= 16 uur) bij 37 ° C onder krachtig schudden (-200 rpm).
- Tel het aantal kolonies op elke plaat. Bereken het aantal succesvolle transformanten als
waar 
is het aantal kolonies, 
is het herstel cultuur volume (1000 pl) en 
is het volume van het herstel cultuur vergulde (1 pl).
Opmerking: Om volledige dekking van alle mutaties te verzekeren, als vuistregel het aantal succesvolle transformanten moet ≥100-vouw over het aantal verwachte mutaties. NNS elke sub-bibliotheek ~ 53 posities, zodat het verwachte aantal mutaties posities 53 × 32 codons / positie ≈ 1,7 x 10 3; een bibliotheek maat geven ≥100-voudig (≥1.7 x 10 5) moet er ≥170 kolonies op elke plaat. - Volgens de instructies van de fabrikant, geïsoleerd plasmide-DNA uit kweken met behulp van een plasmide zuivering kit en concentraties te meten met behulp van een dsDNA kwantificering reagens. Meng 100 ng van elk plasmide. Hierdoor ontstaat de uiteindelijke gehele eiwit verzadigingsmutagenese bibliotheek.
- Meng 100 ng van elk NNS sub-bibliotheek PCR-product in vijf NNS sub-bibliotheek groepen. Na instructies van de fabrikant, het schoonmaken van monsters met behulp van een DNA-zuivering kit en meet de concentratie met behulp van een dsDNA kwantificatie reagens.
waar 
is het aantal kolonies, 
is het herstel cultuur volume (1000 pl) en 
is het volume van het herstel cultuur vergulde (1 pl). 3. Selectie van de TEM-1 Whole-eiwit verzadigingsmutagenese Library voor resistentie tegen antibiotica
- Bereiding van de voorselectie cultuur.
- Verdun het plasmide uit stap 2.3.7 protocol tot 0,5 ng / ul in water en breng 20 pl van een microcentrifugebuis. Voer transformatie, rehersteltools, plateren en O / N groei zoals eerder beschreven in stap protocol 2.3.5, behalve overdracht 1 pl van de SOB herstel cultuur aan 999 gl LB.
- Tel het aantal kolonies. Om volledige dekking van alle mutaties te waarborgen moeten er ≥100 kolonies, met vermelding van ≥10 6 succesvolle transformanten (100 × 263 × 32 posities codons / positie ≈ 10 6).
- Meet de concentratie van de 50 ml O / N kweek.
- Bereid een LB leeg door toevoeging van 1 ml LB een spectrofotometer cuvette. OD600 gemeten op een spectrofotometer.
- Verdun de O / N kweek 10-voudig door resuspenderen 100 pi in 900 ul LB. Meet de OD600. Trek de OD600 lezing van de blanco en vermenigvuldig met 10 tot de OD600 van de O / N cultuur.
- Pre-warm de drie kolven van protocol stap 1.1 voor ~ 30 minuten bij 37 ° C. Verdun de O / N kweek tot OD600 = 0,1 en voeg 1 ml tot één fles (uiteindelijke OD600 = 0,001). Thij is de "pre-selectie cultuur".
- Incubeer de "voorselectie cultuur 'bij 37 ° C onder heftig schudden (200 rpm). Periodiek controleren groei door het meten van OD600 volgens protocol stap 3.1.3 (het is niet nodig om de cultuur 10-voudig verdund) tot OD600 = 0,1 (-2,5 uren).
- Breng 100 ml van de pre-selectie kweek twee 50 ml conische buizen. Centrifugeer bij 4000 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Verwijder het grootste deel van supernatant en combineren in één 15 conische buis. Herhaal het centrifugeren en verwijder alle supernatant. Bewaar bij -20 ° C.
- Selectie op ampicillineresistentie.
- Terwijl de pre-selectie cultuur incubatie, bereiden een 50 mg / ml voorraad van Amp in het water door het oplossen van 0,5 g natrium ampicilline in 10 ml water. Steriliseren met een 0,2 pm filter en bewaar bij 4 ° C.
- De andere twee flessen, Tet voegen tot een eindconcentratie van 12 ug / ml en een volume van de voorselectie cultuur: tha t de uiteindelijke OD600 = 0,001. Een kolf, voeg 1 ml Amp, voor een eindconcentratie van 50 ug / ml - dit is de "selectie cultuur".
- Incubeer de kweken bij 37 ° C onder heftig schudden (200 rpm). Monitor groei van de kweek waarvoor geen ampicilline is in de vorige stap toegevoegd, totdat OD600 = 0,1 (-2,5 uren). Op dit moment, ook het meten van de OD600 van de cultuur selectie.
- Verdeel de OD600 van de selectie cultuur in 0,1 en vermenigvuldig met 100 ml. Breng de volume (~ 400 ml) aan 50 ml conische buizen en centrifugeer bij 4000 xg gedurende 6 min bij 4 ° C. Verwijder het grootste deel van supernatant en combineren in één 15 conische buis. Herhaal het centrifugeren en verwijder alle supernatant.
- Volgens de instructies van de fabrikant, isoleren plasmide-DNA uit de pre-selectie (protocol stap 3.1.6) en selectie (protocol stap 3.2.4) cultuur celpellets en vervolgens concentraties te meten met behulp van een dsDNA kwantificering reagens.
- Monstervoorbereiding voor high-throughput sequentiebepaling
- Bereid 25 pi PCR's om de-multiplexen van de NNS sub-bibliotheek groepen met orthogonale primers
- Bereid een PCR master mix volgens tabel 9; overdracht 23 ul tien PCR buizen.
- Voeg 1 pl 0,5 ng / ul gezuiverd plasmide DNA uit de voorselectie cultuur tubes 1 PCR - 5 en de selectie cultuur buizen 6-10.
- Meng 50 ul van 50 uM voorwaarts orthogonale primers OP1_F - OP5_F met de betreffende omgekeerde orthogonale primers OP1_R - OP5_R. In dezelfde volgorde, de overdracht 1 ui tot PCR-buisjes 1-5 en 6 - 10. Zie tabel van materialen voor sequenties van OP1_F - OP5_F en OP1_R - OP5_R.
- Transfer PCR buizen thermocycler. Het volgende programma: 98 ° C gedurende 30 seconden; 20 cycli: 98 ° C gedurende 10 sec, 55 °; C gedurende 20 seconden, 72 ° C gedurende 1,5 min; 72 ° C gedurende 2 min; houden op 4 ° C.
- Bereid 25 pi PCR om alle NNS subbibliotheek groepen isoleren
- Verdun 100 maal de tien PCR's van protocol stap 4.1.1.4 door de overdracht van 1 pi van elke PCR-buizen te scheiden en het toevoegen van 99 ul van water. Mix, dan pipet uit 99 ul en gooi ze weg.
- Meng 50 pi 50 pM forward primers Group1_F - Group5_F met de betreffende omgekeerde primers Group1_R - Group5_R. In dezelfde volgorde, de overdracht 1 ui buizen PCR 1 - 5 en 6 - 10. Zie tabel van materialen voor sequenties van Group1_F - Group5_F en Group1_R - Group5_R.
- Bereid een PCR master mix volgens tabel 9, overdracht 23 ul aan elke PCR-buis. Transfer PCR buizen thermocycler; lopen hetzelfde programma als in protocol stap 2.2.1.3.
- Voer de laatste 25 ul PCR's te indexeren sequenties toe te voegen
- diluit 100 maal de tien PCR's van protocol stap 4.1.2.3 door de overdracht van 1 pi van elke PCR-buizen te scheiden en het toevoegen van 99 ul van water. Mix, dan pipet uit 99 ul en gooi ze weg.
- Bereid een PCR master mix volgens tabel 9, overdracht 23 ul aan elke PCR-buis.
- Voor buizen met template afkomstig van NNS sub-bibliotheek groepen 1-5, overdracht 0,5 ul per buis forward primers 501_F - respectievelijk 505_F. Voor buizen met template die voortvloeien uit de pre-selectie en de selectie culturen, overdracht 0,5 ul per buis reverse primers 701_R en 702_R, respectievelijk. Zie tabel van materialen voor sequenties van 501_F - 505_F en 701_R en 702_R.
- Transfer PCR buizen naar de thermocycler en voer het programma uit stap 2.2.1.3.
- Mix en zuiveren samples
- Maatregel door gebruikmaking van een dsDNA kwantificatie reagens volgens de instructies van de fabrikant. Meng 100 ng van elk PCR-product intoa enkele microcentrifugebuis.
- Bereid een 2% agarosegel met 0,2 ug / ml ethidiumbromide (NB).
- Voeg 6x gel laden kleurstof aan de gemengde PCR-producten monster. Laad de eerste baan van de gel met DNA ladder; laden gehele volume van het monster.
- Run gel bij 100 V gedurende 50 min. Visualiseer gel met behulp van een lange golflengte UV-verlichting (LET). Accijnzen slice met de PCR-product bij ~ 360 bp; overbrengen naar microcentrifuge buis. Gelplakje kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C.
- Na instructies van de fabrikant, zuiveren monster met behulp van een gel extractie kit en meet de concentratie met behulp van een dsDNA kwantificering reagens. Dit is het eindmonster voor high-throughput sequencing.
- Volgorde op een high-throughput sequencing platform (zie tabel van Materialen voor platform gebruikt in dit protocol).
- Bereken sample-concentratie in nM als
de concentratie van het monster in ng / pl en 
de sequentie lengte van het monster DNA (~ 360 bp). Verdun monster tot 4 nM in EB buffer. - Volg de instructies van de fabrikant om het monster te denatureren en verdun tot 21:00 in hybridisatiebuffer.
- Belasting 600 ui monster in cartridge reagens. Sequence volgende instructies van de fabrikant en de on-screen prompts.
- Bereken sample-concentratie in nM als
- Bereid 25 pi PCR's om de-multiplexen van de NNS sub-bibliotheek groepen met orthogonale primers
- Analyse van de sequentiegegevens
- Download Flash (Fast Lengte aanpassing van de Short gelezen) 20, te plaatsen in de map samen met fastq.gz bestanden verkregen uit sequencing.
- Gebruik Flash te treden tot de fastq.gz bestanden die overeenkomen met de gepaarde-end leest voor elk paar van indices (vooruit en achteruit leest voor elke NNS sub-bibliotheek groep voor de pre-selectie en culturen).
- Na de toetreding tot elk paar leest, plaatst u het out.extendedFrags.fastq output file in aparte mappen voor de resultaten van de pre-selectie of selectie culturen. Naam van het out.extendedFrags.fastq uitvoerbestand volgens de NNS subbibliotheek waartoe deze overeenkomt (bijv., 1.fastq, 2.fastq, etc.).
- Voer het computationele script NNS_DataAnalyzer.m (Zie Aanvullende Code File) van elke map naar de tellingen voor elk enkel aminozuur mutatie, en de graven te berekenen voor het wild-type, voor elke NNS sub-bibliotheek groep.
- Bereken de fitness effect
elke mutatie als basis tien logaritme van de verhouding tussen de tellingen verkregen in de selectie (
) Ten opzichte van de pre-selectie ( 
) Staat ten opzichte van de wild-type: 
.
de concentratie van het monster in ng / pl en 
de sequentie lengte van het monster DNA (~ 360 bp). Verdun monster tot 4 nM in EB buffer. 
elke mutatie 
) Ten opzichte van de pre-selectie ( 
) Staat ten opzichte van de wild-type: 
. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De plasmide kaart van de vijf gemodificeerde pBR322 plasmiden die orthogonaal priming site (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) wordt getoond in Figuur 2A. Om te testen of de orthogonale primers specifiek zijn, PCRs werden uitgevoerd met elk paar orthogonaal primers afzonderlijk, samen met alle vijf pBR322_OP1-5 plasmiden of met alle plasmiden minus het plasmide overeenkomt met de orthogonale primerpaar. Het juiste product werd alleen verkregen wanneer het overeenkomende plasmide werd opgenomen en geen van elke grootte werd verkregen in de afwezigheid (Figuur 2B).
Een representatief experiment werd uitgevoerd volgens de in deze tekst (Figuur 1) beschreven protocol. Na verwerking (protocol paragraaf 4.2), 6,2 x 10 6 leest uit de pre-selectie staat en 6,3 × 10 6 leest van de 50 ug / ml ampicilline selectie condition werden verkregen. De verkregen voor elk telt aminozuur mutatie uit de pre-selectie staat weer een karakteristieke log-normale verdeling (figuur 3A) 13. Ten minste één telling van sequentiebepaling van de voorselectie cultuur 98,9% van mutaties (58 had geen tellingen), en groter dan 100 telt voor 91,2% (465 waren minder dan 100 tellingen) werden verkregen. Figuur 3B geeft de relatieve fitness effect () voor elke mutatie op elke positie van TEM-1; de verdeling van wordt getoond in figuur 3C. Onder selectiedruk bij 50 ug / ml ampicilline, de meeste mutaties neutraal of bijna neutraal fitness effect (≈ 0, overeenkomend met witte pixels in figuur 3B en de grote piek in figuur 3C). Een klein deel van de mutaties op deze concentratie hebben belangrijke gevolgen voor fitness (<< 0, wat overeenkomt met blauwe pixels in figuur 3B en de linker staart in figuur 3C); exp ectedly, deze omvatten mutaties binnen de sterk geconserveerde actieve site residuen (S70, K73, S130, D131, N132, K234 en G236) 13,14. Daarentegen enkele mutaties aanzienlijk fitheid boven die van TEM-1 (>> 0, overeenkomend met rode pixels in Figuur 3B), zoals te verwachten omdat TEM-1 is zeer efficiënt bij ampicilline hydrolyse ( 
≈ 10 7 M s -1 -1) 14.
Figuur 1. Overzicht van Whole-eiwit verzadigingsmutagenese Protocol voor TEM-1 β-lactamase onder ampicilline selectie. Acties zoals beschreven in het protocol zijn vetgedrukt. Genummerde protocol stappen links getoond, voor verwijzing naar de hoofdtekst.k "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Validatie van Orthogonal Primer Site plasmidevectoren. (A) Plasmid kaart voor de vijf gemodificeerde pBR322 plasmiden die orthogonale priming sites (pBR322_OP1 - pBR322_OP5). Locatie en richting van de orthogonale priming zijn aangegeven. Locaties van verschillende restrictieplaatsen zijn gelabeld; het TEM-1-eiwit geheel verzadigingsmutagenese bibliotheek (waarbij de gehele TEM-1-gen en -promotor) gekloneerd tussenin de Aatll en AvrII- restrictieplaatsen. Afkortingen: tet tetracycline resistentiegen ori replicatieoorsprong (B) Elk paar orthogonale primers (OP1-OP5) werd getest in een PCR met alle vijf pBR322_OP1-5 plasmiden (+) of met alle plasmiden minus de respectieve plasmide (. ˗). Getoond wordt een ethidium bromidegekleurde agarosegel (1% w / v) Film elke PCR-reactie, grootte gescheiden door elektroforese. De verwachte grootte product is 1628 bp; de eerste baan is een DNA-ladder, maten relevante normen zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De resultaten van TEM-1 β-lactamase Whole-eiwit verzadiging Experiment. (A) Histogram van de verbreiding van tellingen per aminozuur mutatie verkregen van high-throughput sequentiebepaling van de bibliotheek van de voorselectie staat. Eenvoudigheidshalve zijn mutaties met nul tellingen (53 mutaties) getoond met een telling van een. (B) Fitness effecten van enkel aminozuur mutaties in TEM-1 onder selectie bij 50 ug / ml ampicilline. Getoond wordt de datamatrix met de relatieve fitness effect () colorimetrisch afgebeeld met blauwe die nadelig effect, rood een positief effect wit geen fitness effect ten opzichte van wildtype. Mutaties waarvoor geen tellingen werden verkregen uit de pre-selectie cultuur zijn zwart gekleurd. Tr tonen posities langs de primaire sequentie en kolommen geven mutatie één van twintig aminozuren of stopcodon (aangeduid met een-lettercode, * is stopcodon); de secundaire structuur van TEM-1 is aangegeven linker en een aantal zeer geconserveerde motieven in de actieve site aangegeven rechts. (C) Histogram geeft de verdeling van relatieve fitness effecten. Getoond worden de resultaten voor de mutaties met> 100 tellingen verkregen van het sequencen van de voorselectie cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens | Massa of Volume | Commentaar |
| Typtone | 2 g | |
| Gist extract | 0,5 g | |
| natriumchloride | 0,06 g | |
| Kaliumchloride | 0,02 g | |
| Magnesiumsulfaat | 0,24 g | |
| gezuiverd water | 100 ml |
Tabel 1. Super Optimal Bouillon (SOB). Reagens namen en hoeveelheden gebruikt in de bereiding van 100 ml SOB (Protocol stap 1.1).
| Reagens | Massa of VolUme | Commentaar |
| Typtone | 10 g | |
| Gist extract | 5 g | |
| natriumchloride | 10 g | |
| gezuiverd water | 1 L |
Tabel 2. Luria-Bertani bouillon (LB). Reagens namen en hoeveelheden gebruikt in de bereiding van 1 L LB (protocol stap 1.1).
| Reagens | Massa of Volume | Commentaar |
| Typtone | 10 g | |
| Gist extract | 5 g | |
| natriumchloride | 10 g | |
| agar-agar | 15 g | |
| gezuiverd water | 1 L |
Tabel 3. LB-agar. Reagens namen en hoeveelheden gebruikt in de bereiding van LB-agar (protocol stap 1.1).
| Reagens | Volume | Commentaar |
| 5x PCR-buffer | 1450 pl | |
| PCR additief | 1450 pl | |
| 2 mM dNTPs | 725 pl | 2 mM elk nucleotide |
| 50 pm AatII_F of AvrII_R primer | 145 pl | |
| 1 ng / pl plasmide pBR322_AvrII | 145 pl | |
| 2 eenheden / pl DNA polymerase | 72,5 pl | |
| water | 363 pl |
Tabel 4. Eerste-round Mutagene PCR Master Mix. Reagens namen en hoeveelheden voor de voorbereiding van de master mix voor de eerste ronde mutagene PCR (protocol stap 2.2.1). Totale hoeveelheid is voldoende voor 290 25 pi reacties.
| Reagens | Volume | Commentaar |
| 5x PCR-buffer | 1450 pl | |
| PCR additief | 1450 pl | |
| 2 mM dNTPs | 725 pl | 2 mM elk nucleotide |
| 50 pm AatII_F primer | 145 pl | |
| 50 pm AvrII_R primer | 145 pl | |
| 2 eenheden / pl DNA polymerase | 72,5 pl | |
| water | 2973 pl |
Tabel 5. Tweede-round Mutagene PCR Master Mix. Reagens namen en hoeveelheden voor de voorbereiding van de master mix voor de tweede ronde mutagene PCR (protocol stap 2.2.2). Totale hoeveelheid is voldoende voor 290 reacties van 25 pl.
| Reagens | Volume | Commentaar |
| 5x PCR-buffer | 20 gl | |
| PCR additief | 20 gl | |
| 2 mM dNTPs | 10 gl | 2 mM elk nucleotide |
| 50 pm AvrII_F primer | 2 gl | |
| 50 pm AatII_OP1_R - AatII_OP5_R primer | 2 gl | een primer per reactie, gekoppeld aan respectieve plasmide |
| 1 ng / pl plasmide pBR322_OP1-5 | 2 gl | een plasmide per reactie |
| 2 eenheden / pl DNA polymerase | 1 pi | |
| water | 43 ul |
Tabel 6. Klonen Vector PCR. Reagent namen en hoeveelheden voor de voorbereiding van de PCR om het klonen vectoren (protocol stap 2.3.2) te maken.
| Reagens | Volume | Commentaar |
| 10x restrictie-enzym buffer | 5 gl | |
| 4 eenheden / ul AvrII | 2,5 pl | |
| 20 eenheden / ul Aatll | 0,5 pl | |
| DNA restrictie digest | volume van 500 ng | |
| water | 50 ui totaal volume |
Tabel 7. restrictiedigestie. Reagens namen en hoeveelheden restrictiedigesten van kloneringsvectoren en NNS sub-bibliotheek groepen (protocol stap 2.3.3).
| Reagens | Volume | Commentaar |
| 10x T4 DNA ligasebuffer | 5 gl | |
| gezuiverd-beperking verteerd NNS sub-bibliotheekgroep DNA | volume van 48 ng | |
| gezuiverd restrictie-gedigereerde DNA kloneringsvector | volume van 52 ng | |
| 400 eenheden / ul T4 DNA ligase | 1 pi | |
| water | 20 ui totaal volume |
Tabel 8. ligaties reagensnamen en hoeveelheden ligaties kloneringsvectoren met restrictie gedigereerde NNS subbibliotheek groepen in een 1:. 3 vector: invoegen molverhouding (protocol stap 2.3.4).
| Reagens | Volume | Commentaar |
| 5x PCR-buffer | 55 ul | |
| PCR additief | 55 ul | |
| 2 mM dNTPs | 27,5 pl | 2 mM elk nucleotide |
| 2 eenheden / pl DNA polymerase | 2.75 ul | |
| water | 113 pl |
Tabel 9. PCR reagentia voor het bereiden van monsters voor High-throughput sequencing. Reagens namen en hoeveelheden voor het bereiden van PCR mastermengsels gebruikt voor de-multiplexen met orthogonale primers (4.1.1), het isoleren van NNS sub-bibliotheek groepen (protocol stap 4.1.2) en het toevoegen van indexering sequenties (protocol stap 4.1.3). Totale hoeveelheid is voldoende voor 11 25 pi reacties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier een protocol beschreven voor het uitvoeren van de functionele beoordeling van gehele eiwitten verzadigingsmutagenese bibliotheken, met behulp van high-throughput sequencing technologie. Een belangrijk aspect van de werkwijze is het gebruik van orthogonale primers tijdens het klonen. Kort samengevat, wordt elke aminozuurpositie gerandomiseerd door mutagene PCR en gemengd in groepen van posities waarvan de totale sequentielengte wordt opgevangen door high-throughput sequencing. Deze groepen worden gekloneerd in plasmidevectoren die paren orthogonale priming, vergezeld gemengd en onderworpen aan selectie en de-gemultiplext met de orthogonale primers, en vervolgens diep sequentie. Aangezien mutaties worden opgesloten binnen de sequencing lezen limiet, deze aanpak maximaliseert het aantal nuttige leest met mutaties voor genen van grootte langer dan de sequencing lezen lengte. Daarnaast is deze techniek maakt de gelijktijdige of "één-batch" samenstelling van de gehele mutational bibliotheek, zodat de werkdruk en de mogelijkheid dat mutaties ervaren verschillende selectie. Praktisch, de kritische stappen in het protocol grotendeels betrekking op de organisatie: tijdens het klonen (protocol stap 2.3) moet men zorgen voor de juiste menging van mutagene PCR-producten in groepen en de daaropvolgende klonen in de juiste orthogonale priming website vector; tijdens de voorbereiding van het monster voor sequentiebepaling (protocol stap 4,1), de juiste orthogonale primers en primers voor elk van de sub-NNS bibliotheekgroepen isoleren en voeg indexeren sequenties worden gebruikt.
De drie stappen van het protocol - bankconstructie, selectie en sequentiebepaling - kan op verschillende aspecten worden gewijzigd. Tijdens bibliotheekconstructie kon mutaties met behulp van verschillende technieken te voeren, bijvoorbeeld door fouten gevoelige PCR, of door het construeren van het gen onder toepassing van oligonucleotiden gesynthetiseerd door dotering in een kleine fractie van alternatieve nucleotides 21. Men zou het construeren dubbele of hogere orde mutaties in segmenten van het eiwit (dat wil zeggen, NNS subbibliotheek groepen), of in alternatieve genotype achtergronden 22 omvatten. Belangrijk alle aanpassingen aan de bankconstructie stap dient echter het criterium dat de overeenkomst tussen de locatie mutaties in de sequentie en de sequentie leest lengte behouden blijft voldoen. Dit criterium sluit daarom de toepassing van het protocol in de richting van uitgebreide studies van meerdere mutaties over een eiwit. Wijzigingen aan het tweede deel van het protocol bevatten alternatieve selectievoorwaarden: (bijv., Temperatuur, nutriënten) verschillende β-lactam (of combinaties) en concentraties uitwendige spanningen, host type (bijvoorbeeld verschillende soorten bacteriën) of verschillende sampling tijden (uren tot dagen). Bijvoorbeeld in eerder werk onderzochten we de effecten van fitness enkel aminozuur mutatiesin TEM-1 onder verschillende concentraties van ampicilline, en onder de derde generatie cefalosporine cefotaxim 13. Met betrekking tot de derde stap van het protocol, hebben we momenteel niet aan af te wijken van de keuze van de sequencing platform hier gebruikt (zie tabel of Materials). Terwijl sequencing lezen lengtes zijn langer inderdaad in andere platforms, het aantal leest verkrijgbaar is op dit moment veel lager; in het algemeen een nauwkeurigheid die het effect van een mutatie kan worden bepaald in verhouding tot het aantal leest verkregen (zie vergelijking protocol in stap 4.2.5).
Grotendeels omwille van de eenvoud, het protocol gebruikt TEM-1 β-lactamase als modelsysteem, maar de hier beschreven methodologie kan worden uitgebreid tot andere systemen waarvoor een high-throughput assay selectie of screening op zijn plaats. Het construeren van dergelijke testen echter vaak niet triviaal: Ten eerste moet een strategie voor compartimentering van gen (mutatie) en eiwitten samen te stellenBijvoorbeeld in een cel, vloeistofdruppel (zoals in een microfluidics platform), of door faagdisplay. Ten tweede, en belangrijker nog, een kwantitatief verband tussen eiwit functie en een selecteerbaar fenotype, of geschiktheid, moet worden vastgesteld. Voor enzymen betrokken bij het metabolisme of antibioticaresistentie het vermogen van cellen om te groeien in nutriënt uitval of antibioticum media vaak een directe functie van enzymatische activiteit. Een synthetische benadering kan worden gebruikt in andere systemen, bijvoorbeeld door het koppelen van eiwit-eiwitbinding affiniteit voor reportergen (bv. Fluorescerende proteïne) expressie in bacteriën of gist 11,23, of met een fluorogeen enzymsubstraat in een microfluïdisch systeem 24 . Tenslotte moeten dergelijke test schaalbaar, om de grootte van een gehele eiwitmutagenese bibliotheekadres.
Kortom, een high-throughput sequencing-gebaseerde benadering voor de functionele beoordeling van gehele eiwitten verzadigingsmutagenese bibliotheken descrIBED hier. Centraal in de aanpak is de constructie van de mutagenese bibliotheek in segmenten langs het gen en het gebruik van orthogonale primer barcodes elk segment voor het multiplexen en demultiplexen de bibliotheek taggen. We verwachten dat dit protocol kon gemakkelijk worden toegepast op andere eiwitten waarvoor een geschikte hoge-doorvoer screen selectie of ontwikkeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typtone | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| Yeast extract | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| Petri plates | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol scale, standard desalting |
| pBR322_AvrII | available upon request | pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | available upon request | five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491L | includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer) |
| 15 ml conical tube | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR plate, 96 well | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 well plate seal | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96-well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| 96-well black-walled, clear bottom assay plates | Corning | 3651 | |
| Lambda phage DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA reagent | Invitrogen | P7581 | dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4 |
| Victor 3 V microplate reader | PerkinElmer | ||
| DNA purification kit | Zymo Research | D4003 | |
| Microcentrifuge tubes | Corning | 3621 | |
| Long-wavelength UV illuminator | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| Agarose gel DNA extraction buffer | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 electrocompetent E. coli | Avidity | EVB100 | |
| Electroporator (E. coli Pulser) | Bio-Rad | 1652102 | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| Plasmid purification kit | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 well PCR strip tubes | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32854 | dsDNA quantitation reagent |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Ampicillin sodium salt | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq desktop sequencer | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform |
| FLASh software | John Hopkins University - open source | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC |
||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG |
||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG |
||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC |
||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC |
||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC |
||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC |
||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG |
||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC |
||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC |
||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC |
||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC |
||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC |
||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG |
||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
References
- Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
- Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
- Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
- Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
- Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
- Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
- Fowler, D. M., et al.
- Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
- McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
- Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
- Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
- Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
- Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
- Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
- Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
- Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
- Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
- Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
- Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
- Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).
