Summary
Nous présentons un protocole pour l'évaluation fonctionnelle des bibliothèques saturation site unique mutagenèse complets de protéines en utilisant le séquençage à haut débit. Fait important, cette approche utilise des paires d'amorces orthogonales pour multiplexer la construction et le séquençage bibliothèque. Les résultats représentatifs en utilisant TEM-1 β-lactamase sélectionnée à une dose cliniquement pertinente de l'ampicilline sont fournis.
Introduction
Mutagenèse a longtemps été employé dans le laboratoire pour étudier les propriétés des systèmes biologiques et de leur évolution, et pour produire des protéines ou des organismes mutants avec des fonctions améliorées ou nouvelles. Alors que les premières approches comptaient sur les méthodes qui produisent des mutations aléatoires dans les organismes, l'avènement de la technologie de l' ADN recombinant a permis aux chercheurs d'introduire certains changements à l' ADN d'une manière spécifique au site, ie., La mutagenèse dirigée 1,2. Avec les techniques actuelles, typiquement en utilisant des oligonucléotides mutagènes dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR), il est relativement facile de créer et d' évaluer de petits nombres de mutations (par ex., Mutations ponctuelles) dans un gène donné 3,4. Il est beaucoup plus difficile mais quand les approches de but, par exemple, la création et l'évaluation de tous à un seul site possible (ou d'ordre supérieur) mutations.
Alors que beaucoup a été appris par les premières études qui tentent d'évaluer un grand nombre de mutations dans les gènes, les techniques utilisées étaient souvent laborieux, nécessitant par exemple l'évaluation de chaque mutation en utilisant indépendamment un non - sens suppresseur souches 5-7, ou ont été limités dans leur capacité quantitative en raison de la faible profondeur de Sanger séquençage 8 de séquençage. Les techniques utilisées dans ces études ont été largement supplanté par des procédés utilisant à haut débit la technologie de séquençage 9-12. Ces approches conceptuellement simples impliquent la création d' une bibliothèque comprenant un grand nombre de mutations, en soumettant la bibliothèque à un écran ou à la sélection pour la fonction, puis profonde séquençage (ie., De l'ordre de> 10 6 séquençage lit) la bibliothèque obtenue avant et après la sélection. De cette manière, les effets phénotypiques ou en forme d'un grand nombre de mutations représentées par la variation de fréquence de population de chaque mutant, peut être évalué simultanément, et de manière plus quantitative.
Nous avons déjà mis en place un simp(. -à- dire, protéine entière bibliothèques saturation de mutagenèse) approche le pour évaluer les bibliothèques de tous les possibles mutations d'acides aminés simples dans les protéines, applicable à des gènes d'une longueur plus longue que le séquençage lu longueur 11,13: Tout d' abord, chaque position d'acide aminé est randomisée par site dirigé PCR mutagène. Pendant ce processus, le gène est divisé en groupes composés de positions contiguës d'une longueur totale reçue par la plateforme de séquençage. Les produits de PCR mutagenes pour chaque groupe sont ensuite combinées et soumises à chaque groupe indépendamment de la sélection et le séquençage à haut débit. En maintenant une correspondance entre la localisation des mutations dans la séquence et la longueur séquençage de lecture, cette approche présente l'avantage de maximiser la profondeur de séquençage: alors que l' on pourrait tout simplement la séquence de ces bibliothèques dans les fenêtres courtes sans se diviser en groupes (par exemple, par un fusil standard. approche de séquençage), la plupart se lit obtenu serait de type sauvage et donc la majorité de séquençage débit gaspillé (par exemple, pour une bibliothèque mutagenèse à saturation protéine entière d'une protéine d'acide 500 aminé séquencé dans 100 acides aminés (300 pb) de fenêtres, au minimum 80% de lit sera la séquence de type sauvage).
Ici, un protocole est présenté qui utilise le séquençage à haut débit pour l'évaluation fonctionnelle des bibliothèques saturation mutagenèse-protéine entière, en utilisant l'approche ci - dessus (présenté sur la figure 1). Surtout, nous introduisons l'utilisation d'amorces orthogonales dans le processus de clonage bibliothèque à code-barres de chaque groupe de séquences, ce qui leur permet d'être multiplexés dans une bibliothèque, soumis simultanément à un dépistage ou à la sélection, puis démultiplexé pour le séquençage en profondeur. Etant donné que les groupes de séquences ne sont pas soumises à une sélection de façon indépendante, ce qui réduit la charge de travail et veille à ce que chaque mutation subit le même niveau de sélection. TEM-1 β-lactamase, une enzyme qui confère une résistance de haut niveau pourles antibiotiques β-lactames (par ex., à l' ampicilline) dans des bactéries est utilisé comme système modèle 14-16. Un protocole est décrit pour l'évaluation d'une saturation de banque de mutagenèse, la protéine entière TEM-1 dans E. coli sous sélection à un niveau sérique approximatif d'une dose clinique de l' ampicilline (50 pg / ml) 17,18.
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Protocol
Note: Voir la Figure 1 pour les grandes lignes du protocole. Plusieurs étapes et des réactifs dans le protocole nécessitent des mesures de sécurité (indiquées par «ATTENTION»). Consulter les fiches de données de sécurité avant utilisation. Toutes les étapes du protocole sont effectuées à la température ambiante, sauf si d'autres ont indiqué.
1. Préparer la culture des médias et plaques
- Et stériliser par autoclavage 1 L d' eau purifiée, 100 ml de Super Broth optimale (SOB; Tableau 1), 1 L de bouillon de Luria-Bertani (LB; tableau 2) et 1 L de LB-agar (Tableau 3). Préparer séparément et stériliser trois flacons de culture contenant chacun 1 L LB.
Remarque: Dans le protocole «eau» se réfère à l'autoclave stérilisé l'eau purifiée; SOB, LB et LB-agar se réfèrent aux solutions de l'autoclave stérilisé. - Préparer un 12 mg / stock ml de Tet en dissolvant 0,12 g de chlorhydrate de tétracycline dans 10 ml d'éthanol à 70%. Stériliser en utilisant un filtre de 0,2 um et magasinà 4 ° C à l'abri de la lumière.
- LB-agar Refroidir à 50 ° C puis ajouter 1 ml de Tet stocks (concentration finale de 12 pg / ml Tet). Verser dans des boîtes de Pétri et laisser refroidir à la température ambiante à l'abri de la lumière. Conserver à 4 ° C à l'abri de la lumière.
2. Construction du Tout-gène Saturation mutagenèse Bibliothèque
Note: Amorces; RFP terminée, les digestions de restriction et ligatures; et les échantillons d'ADN purifiés peuvent être conservés à -20 ° C.
- La conception d' amorces de mutagénèse
- Pour mutagenèse chaque position d'acide aminé à tous les acides aminés possibles, concevoir une paire d'amorces de mutagenèse complémentaires (sens / antisens avant et / arrière) pour chaque position d'acide aminé avec les lignes directrices suivantes:
- Replacer le codon correspondant à l'acide aminé devant être soumis à une mutagenèse par NNS (où N est un mélange de quatre bases nucléotidiques et S est un mélange de cytosine (C) et guanine (G)) et le centre de la primer, flanqué d'environ 15 nucléotides de chaque côté.
- Faire en sorte que l'extrémité 5 'et 3' se terminent par C ou G , et que la température de fusion (Tm) est d' environ 70 ° C 3. Utilisez le NNS_PrimerDesign.m script de calcul (voir le fichier de code supplémentaire) pour concevoir NNS amorces de mutagenèse selon ces directives.
- Ordre des amorces provenant d'une source commerciale. Pour faciliter l'utilisation, les ont synthétisés sous forme de plaque de 96 puits et pré-dilué dans l'eau à 50 uM, avec un ensemble de plaques contenant les amorces de mutagénèse sens et une autre, les amorces antisens.
- Remplir un bassin de pipette à l'eau et utiliser une pipette multicanaux pour transférer 95 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits. Diluer les amorces 20 fois à 2,5 pM en utilisant une pipette à canaux multiples pour transférer 5 pi à partir des plaques à 96 puits contenant les amorces de mutagénèse sens dans les puits des plaques parentes contenant de l'eau.
- Répéterprotocole étape 2.1.3 pour diluer les amorces antisens de mutagenèse.
- Pour mutagenèse chaque position d'acide aminé à tous les acides aminés possibles, concevoir une paire d'amorces de mutagenèse complémentaires (sens / antisens avant et / arrière) pour chaque position d'acide aminé avec les lignes directrices suivantes:
- Synthèse du NNS sous-bibliothèques pour chaque position d'acides aminés par PCR en deux étapes mutagenèse dirigée
- Effectuer la première ronde PCR mutagène. Pour chaque amorce de mutagenèse, préparer une réaction PCR de 25 ul en utilisant pBR322_AvrII plasmidique comme matrice et des amorces AatII_F ou AvrII_R (amorces sens de mutagenèse appariés avec l'amorce AvrII_R, et antisens amorces de mutagenèse appariés avec l'amorce AatII_F; total de 526 RFP). Voir le tableau des matériaux pour les séquences AatII_F et AvrII_R.
- Préparer une PCR "mélange maître" en ajoutant les réactifs du tableau 4 dans un tube conique de 15 ml. Transférer vers un bassin de pipette. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 15 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits PCR. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 10 pi à partir des plaques à 96 puits contenant les amorces sens de mutagenèse dilué dans les puits parentes in les plaques PCR.
- Couvrir chaque plaque PCR avec un joint de plaque de 96 puits. Centrifuger à 200 g pendant 2 min.
- Transférer les plaques PCR pour thermocycleur et exécuter le programme suivant: 98 ° C pendant 30 secondes; 20 cycles: 98 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 1 min; 72 ° C pendant 2 min; maintenir à 4 ° C.
- Protocole répéter les étapes 2.2.1.1 - 2.2.1.3 pour les plaques à 96 puits contenant les amorces de mutagénèse antisens dilué.
- Procédez de second tour RFP mutagène. Pour chaque position d'acides aminés, de préparer une 25 ul de réaction PCR en utilisant des amorces et AatII_F AvrII_R et le mélange et on dilue les produits de PCR mutagenes du premier tour comme matrice (un total de 263 RAP).
- Remplir un bassin de pipette à l'eau et utiliser une pipette multicanaux pour transférer 198 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits.
- Combiner et diluer 100 fois les produits de PCR mutagenes pour chaque position d'acides aminés à l'aide d'une pipette multicanaux pour1 ul premier transfert à partir des plaques à 96 puits de PCR contenant les produits de PCR obtenus à partir des amorces de mutagénèse sens dans les puits des plaques parentes contenant de l'eau. Ensuite, répétez le transfert pour les produits de PCR obtenus à partir des amorces antisens de mutagenèse.
- Préparer une PCR "mélange maître" en ajoutant les réactifs du tableau 5 dans un tube conique de 15 ml. Transférer vers un bassin de pipette. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 24 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits PCR. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 1 pi des plaques à 96 puits contenant le mélange et dilué au premier tour des produits de PCR mutagène dans les puits parentes dans les plaques PCR.
- Couvrir chaque plaque PCR avec un joint de plaque de 96 puits. Centrifuger à environ 200 g pendant 2 min. plaques de transfert à thermocycleur et exécuter le même programme que dans le protocole étape 2.2.1.3.
- Analyser les résultats du second tour RFP mutagène par électrophorèse sur gel.Veiller à ce que tous les produits sont de la bonne taille et l'absence de contamination des produits.
- Ajouter 2 ml de 2x gel colorant de charge à un bassin de pipette, puis utiliser une pipette multicanaux pour transférer 6 pi à 263 puits sur trois plaques à 96 puits. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 6 pi des plaques à 96 puits PCR contenant les produits de PCR mutagène de second tour dans les puits parentes des plaques à 96 puits contenant un colorant.
- Préparer un gel d'agarose à 1,5% avec 0,2 pg / ml de bromure d'éthidium (ATTENTION).
- Charge échelle d'ADN en premier et dernier voies de chaque rangée. Ensuite, utilisez une pipette multicanaux pour charger 10 pi d'échantillons de protocole étape 2.2.3.1.
- Exécutez le gel à 100 V pendant 40 min et de l'image sur un transilluminateur UV.
- protocole Répétez les étapes 2.2.3.2 - 2.2.3.4 jusqu'à ce que tous les échantillons sont analysés.
- Mesurer avec précision la concentration de chaque produit PCR sous-bibliothèque NNS utilisant un réactif de quantification dsDNA.
- Transfertenviron 15 ml de tampon EB à un bassin de pipette. Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 49 pi à 263 puits sur trois 96 puits, des plaques noires à paroi essai fond transparent.
- Utiliser une pipette multicanaux pour transférer 1 pl de chaque produit de PCR de la seconde étape (protocole étape 2.2.2) dans les puits des plaques parentes de dosage à 96 puits.
- Préparer une courbe standard de la concentration d'ADN par dilution de l'ADN de phage lambda à 2 ng / ul dans du tampon EB 300 ul, puis faire dix dilutions de deux fois (pour un total de 11 concentrations). Transférer 50 ul à onze premières colonnes d'une ligne de l'une des plaques d'essai de 96 puits à partir de l'étape précédente qui ne contient aucun échantillon; à la douzième colonne ajouter 50 pi de tampon EB (réactif à blanc).
- Préparer dsDNA réactif de quantification en ajoutant 75 pi de réactif (voir le tableau des matériaux) à un tube conique de 15 ml, puis ajouter 15 ml de tampon EB. Mélanger en retournant le tube, puis transfert à un bassin de pipette. Protéger le réactif de la lumière.
- Utiliser une pipette à canaux multiples pour transférer 50 pi de réactif préparé ADNdb de quantification à chaque puits des plaques de dosage. Mélanger par pipetage de haut en bas. Incuber les plaques à température ambiante pendant 5 min à l'abri de la lumière.
- Mesurer la fluorescence de chaque échantillon en utilisant un lecteur de microplaques et des longueurs d'onde de fluorescéine standard (excitation 485 nm, émission 520 nm; 0,1 sec).
- Soustraire la valeur de la fluorescence du réactif à blanc de tous les échantillons. Générer une courbe d'étalonnage à partir des mesures de fluorescence d'échantillons de phage lambda. Calculer la concentration de chaque échantillon en utilisant les mesures de fluorescence respectifs et la courbe standard.
- Effectuer la première ronde PCR mutagène. Pour chaque amorce de mutagenèse, préparer une réaction PCR de 25 ul en utilisant pBR322_AvrII plasmidique comme matrice et des amorces AatII_F ou AvrII_R (amorces sens de mutagenèse appariés avec l'amorce AvrII_R, et antisens amorces de mutagenèse appariés avec l'amorce AatII_F; total de 526 RFP). Voir le tableau des matériaux pour les séquences AatII_F et AvrII_R.
- Le clonage des bibliothèques de sous-NNS dans des vecteurs de sélection
- Mélanger 100 ng de chaque produit de PCR de la sous-bibliothèque NNS en cinq sous-groupes de bibliothèque NNS. En suivant les instructions du fabricant, nettoyer les échantillons en utilisant un kit de purification d'ADN et ensuite mesurer la concentration en utilisant un dsle réactif de quantification d'ADN.
Remarque: chaque groupe est constitué des acides aminés d'environ 53 contigus des positions espacées le long de la séquence TEM-1 (groupes NNS la sous-bibliothèque: 1 - 5 sont constitués de positions 26-78, 79-132, 133-183, 184-236 et 237-290, respectivement; numérotation selon Ambler et al 19).. - Créer des vecteurs de clonage pour chaque sous-groupe de bibliothèque NNS.
- Préparer cinq 100 ul PCR selon le tableau 6, en utilisant des amorces et AvrII_F AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, et les plasmides pBR322_OP1-5 comme matrice (AatII_OP1_R couplé à pBR322_OP1, etc.).
- Transfert à thermocycleur et exécuter le programme suivant: 98 ° C pendant 30 secondes; 25 cycles: 98 ° C pendant 10 s, 55 ° C pendant 20 s, 72 ° C pendant 1,5 min; 72 ° C pendant 2 min; maintenir à 4 ° C. Voir T able des matériaux pour des séquences de AatII_R et AvrII_F.
- Préparer un gel d'agarose à 1%, avec 0,2 pg / ml de bromure d'éthidium (ATTENTION).
- Ajouter 20 pi de 6x gel colorant de charge à chaque échantillon PCR. Chargez la première piste du gel avec l'échelle de l'ADN; charger volume entier de chaque échantillon, en sautant au moins un puits entre les échantillons.
- Exécutez gel à 100 V pendant 50 min.
- Visualisez gel en utilisant un illuminateur UV longueur d'onde (ATTENTION). tranches d'accise contenant le produit PCR à ~ 3500 pb; transférer à séparer des tubes de microcentrifugation. Des tranches de gel peuvent être conservés à -20 ° C.
- En suivant les instructions du fabricant, de purifier les échantillons en utilisant un kit d'extraction de gel et de la concentration de mesure en utilisant un réactif de quantification dsDNA.
- Pour les deux groupes NNS sous-bibliothèque (protocole étape 2.3.1) et des vecteurs de clonage (protocole étape 2.3.2), mis en place avec des enzymes de restriction digère Aatll et AvrII selon la T ableau 7. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. En suivant les instructions du fabricant, nettoyer les échantillons en utilisant un kit de purification d'ADN et ensuite mesurer la concentration en utilisant un quantita dsDNARéactif tion.
- Mettre en place des réactions de ligature suivant le tableau 8 pour chaque sous-groupe de bibliothèque NNS restriction digéré avec le vecteur de restriction digéré le clonage apparenté (sous-bibliothèque groupe NNS 1 avec pBR322_OP1, etc.). Incubation à température ambiante pendant 1 heure. Nettoyer les réactions utilisant un kit de purification d'ADN selon les instructions du fabricant; éluer l'ADN avec 20 pi d'eau.
- Transformer l'ensemble des réactions de ligature purifiés dans la bibliothèque efficace E. cellules coli par électroporation.
- Thaw électrocompétentes E. cellules coli, puis les cellules de lieu et des réactions de ligature purifiés sur la glace.
- Transférer 10 ul décongelés cellules à chaque réaction de ligature purifié, puis transfert à cuvette d'électroporation. Électroporation à 1,8 kV.
- Récupérer les cellules par remise en suspension dans 1 ml SOB. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
- Resuspendre 10 pi de chaque culture de récupération dans 990 ul LB; étaler 100 pi sur LB-gélose contenant 12 pg / ml Tet. Incuber les plaques O / N (~ 16 h) à 37 ° C.
- Pour chaque culture de récupération, préparer un flacon de culture de 250 ml avec 50 ml de LB et 50 pl Tet stock. Transfert dans le ballon les ~ 1 ml restants de la culture de récupération. Incuber O / N (~ 16 h) à 37 ° C avec agitation vigoureuse (~ 200 rpm).
- Compter le nombre de colonies sur chaque plaque. Calculer le nombre de transformants réussis que
, où 
est le nombre de colonies, 
est le volume de culture de récupération (1000 pi), et 
est le volume de la culture de recouvrement en métal (1 ul).
Remarque: Pour assurer une couverture complète de toutes les mutations, en règle générale le nombre de transformants devrait être ≥100 fois par rapport au nombre de mutations attendues. Chaque sous-bibliothèque NNS a ~ 53 positions, de sorte que le nombre attendu de mutations est de 53 positions x 32 codons / position de ≈ 1,7 × 10 3; pour donner une taille de bibliothèque ≥100 fois (≥1.7 × 10 5) il devrait y avoir ≥170 colonies sur chaque plaque. - Selon les instructions du fabricant, isoler l'ADN plasmidique à partir de cultures en utilisant un kit de purification de plasmide puis de mesurer la concentration en utilisant un réactif de quantification ADNdb. Mélanger 100 ng de chaque plasmide. Cela crée la bibliothèque finale la protéine entière mutagenèse à saturation.
- Mélanger 100 ng de chaque produit de PCR de la sous-bibliothèque NNS en cinq sous-groupes de bibliothèque NNS. En suivant les instructions du fabricant, nettoyer les échantillons en utilisant un kit de purification d'ADN et ensuite mesurer la concentration en utilisant un dsle réactif de quantification d'ADN.
, où 
est le nombre de colonies, 
est le volume de culture de récupération (1000 pi), et 
est le volume de la culture de recouvrement en métal (1 ul). 3. Sélection du TEM-1 entier protéines Saturation mutagenèse Library pour la résistance aux antibiotiques
- Préparation de la culture pré-sélection.
- Diluer le plasmide de protocole 2.3.7 à 0,5 ng / ul dans l'eau et transférer 20 pi à un tube de microcentrifugeuse. Effectuer la transformation, redécouverte, le placage et O / N croissance comme décrit précédemment dans le protocole de l'étape 2.3.5, à l'exception de transfert 1 ul de la culture de récupération SOB à 999 ul LB.
- Compter le nombre de colonies. Pour assurer une couverture complète de toutes les mutations qu'il devrait y avoir ≥100 colonies, indiquant ≥10 6 transformants réussis (100 × 263 × 32 positions codons / Position ≈ 10 6).
- Mesurer la concentration de 50 ml d'O / N culture.
- Préparer une ébauche de LB en ajoutant 1 ml de LB dans une cuvette de spectrophotomètre. Mesurer la DO600 sur un spectrophotomètre.
- Diluer le / N culture 10 fois O par remise en suspension 100 pi dans 900 LB. ul Mesurer la DO600. Soustraire la lecture de DO600 de l'ébauche et multiplier par 10 pour donner la DO600 de la culture O / N.
- Préchauffer les trois flacons de culture de protocole étape 1.1 pour ~ 30 min à 37 ° C. Diluer la culture O / N à DO600 = 0,1 et ajouter 1 ml d'une fiole (DO600 finale = 0,001). Tla sienne est la «culture pré-sélection".
- Incuber la "culture pré-sélection" à 37 ° C avec agitation vigoureuse (200 rpm). Périodiquement surveiller la croissance en mesurant DO600 que dans le protocole étape 3.1.3 (il est nécessaire de diluer la culture 10 fois) jusqu'à DO600 = 0,1 (~ 2,5 h).
- Transférer 100 ml de la culture pré-sélection à deux 50 ml tubes coniques. Centrifuger à 4000 g pendant 6 min à 4 ° C. Retirer le plus de surnageant et de combiner en un seul 15 tube conique. Répéter centrifugation et enlever tout surnageant. Conserver à -20 ° C.
- La sélection pour la résistance à l'ampicilline.
- Bien que la culture pré-sélection est en phase d'incubation, préparer un 50 mg / ml stock d'Amp dans l'eau par dissolution de 0,5 g d'ampicilline de sodium dans 10 ml d'eau. Stériliser à l'aide d'un filtre et un magasin de 0,2 um à 4 ° C.
- Les deux autres flacons, ajouter Tet à une concentration finale de 12 pg / ml et un volume de pré-culture telle sélection tha t la DO600 finale = 0,001. Pour un flacon, ajouter 1 ml Amp, pour une concentration finale de 50 pg / ml - ce qui est la «culture de sélection".
- Incuber les cultures à 37 ° C avec agitation vigoureuse (200 rpm). Surveiller la croissance de la culture pour laquelle aucune ampicilline a été ajoutée à l'étape précédente, jusqu'à DO600 = 0,1 (~ 2,5 h). A ce moment, mesurer également la DO600 de la culture de sélection.
- Divisez la DO600 de la culture de sélection dans 0,1 et multiplier par 100 ml. Transférer ce volume (~ 400 ml) à 50 ml tubes et centrifuger coniques à 4000 g pendant 6 min à 4 ° C. Retirer le plus de surnageant et de combiner en un seul 15 tube conique. Répéter centrifugation et enlever tout surnageant.
- Selon les instructions du fabricant, isoler l'ADN plasmidique de la pré-sélection (protocole étape 3.1.6) et de sélection (protocole étape 3.2.4) des culots de cellules de culture et ensuite mesurer les concentrations en utilisant un réactif de quantification dsDNA.
- Préparation des échantillons pour le séquençage à haut débit
- Préparer 25 RFP pi à dé-multiplexer les groupes NNS sous-bibliothèque avec des amorces orthogonales
- Préparer un mélange maître PCR selon le tableau 9; transférer 23 pi à dix tubes PCR.
- Ajouter 1 pi de 0,5 ng d'ADN plasmidique / ul purifié à partir de la culture pré-sélection de tubes PCR 1 - 5 et de la culture de sélection de tubes 6 - 10.
- Mélanger 50 pi de 50 uM avant amorces orthogonales OP1_F - OP5_F avec le respectif inverse amorces orthogonales OP1_R - OP5_R. Dans le même ordre, le transfert 1 pi à tubes PCR 1 - 5 et 6 - 10. Voir le tableau des matériaux pour des séquences de OP1_F - OP5_F et OP1_R - OP5_R.
- Transfert tubes PCR pour thermocycleur. Exécutez le programme suivant: 98 ° C pendant 30 secondes; 20 cycles: 98 ° C pendant 10 sec, 55 °; C pendant 20 s, 72 ° C pendant 1,5 min; 72 ° C pendant 2 min; maintenir à 4 ° C.
- Préparer 25 pi PCR pour isoler chacun des groupes de sous-bibliothèques NNS
- Diluer 100 fois les RFP dix de protocole étape 4.1.1.4 en transférant 1 pi de chacun pour séparer les tubes de PCR et en ajoutant 99 pi d'eau. Mix, puis pipetez sur 99 pi et jeter.
- Mélanger 50 pi de 50 uM amorces sens Group1_F - Group5_F avec les amorces respectives inverse Group1_R - Group5_R. Dans le même ordre, transfert 1 pl de PCR tubes 1 - 5 et 6 - 10. Voir le tableau des matériaux pour des séquences de Group1_F - Group5_F et Group1_R - Group5_R.
- Préparer un mélange maître PCR selon le tableau 9, transférer 23 pi à chaque tube PCR. Transfert tubes PCR pour thermocycleur; exécuter le même programme que dans le protocole étape 2.2.1.3.
- Effectuer les 25 derniers RFP ul d'ajouter des séquences d'indexation
- Diluth 100 fois les RFP dix de protocole étape 4.1.2.3 en transférant 1 pi de chacun pour séparer les tubes de PCR et en ajoutant 99 pi d'eau. Mix, puis pipetez sur 99 pi et jeter.
- Préparer un mélange maître PCR selon le tableau 9, transférer 23 pi à chaque tube PCR.
- Pour les tubes avec la matrice provenant de sous-groupes bibliothèque NNS 1-5, transférer 501_F 0,5 pl par tube amorces sens - 505_F respectivement. Pour les tubes avec la matrice résultant de la présélection et de sélection des cultures, transférer 0,5 pl par tube inverse amorces 701_R et 702_R, respectivement. Voir le tableau des matériaux pour des séquences de 501_F - 505_F et 701_R et 702_R.
- Transfert tubes PCR pour le thermocycleur et exécuter le programme de l'étape 2.2.1.3.
- Mélanger et purifier des échantillons
- Les concentrations de Mesure à l'aide d'un réactif de quantification ADNdb selon les instructions du fabricant. Mélanger 100 ng de chaque produit int PCRoa seul tube à centrifuger.
- Préparer un gel d'agarose à 2% avec 0,2 pg / ml de bromure d'éthidium (ATTENTION).
- Ajouter 6x colorant de chargement de gel au mélange PCR produits échantillon. Chargez la première piste du gel avec l'échelle de l'ADN; charger tout le volume de l'échantillon.
- Exécutez gel à 100 V pendant 50 min. Visualisez gel en utilisant un illuminateur UV longueur d'onde (ATTENTION). tranche d'accise contenant le produit PCR à ~ 360 pb; transfert à microcentrifugation tube. Gel tranche peut être conservé à -20 ° C.
- En suivant les instructions du fabricant, de purifier l'échantillon en utilisant un kit d'extraction de gel et de mesurer la concentration en utilisant un réactif de quantification dsDNA. Ceci est l'échantillon final pour le séquençage à haut débit.
- Séquence sur une plate - forme de séquençage à haut débit (voir le tableau des matériaux pour la plate - forme utilisés dans ce protocole).
- Calculer la concentration de l'échantillon en nM comme
est la concentration de l'échantillon en ng / pl et 
est la longueur de la séquence de l'échantillon d'ADN (~ 360 pb). Diluer l'échantillon à 4 nM dans un tampon EB. - Suivez les instructions du fabricant pour dénaturer l'échantillon et diluer à 21 heures dans un tampon d'hybridation.
- Charge à 600 pi d'échantillon dans la cartouche de réactif. Séquence suivant les instructions du fabricant et les invites à l'écran.
- Calculer la concentration de l'échantillon en nM comme
- Préparer 25 RFP pi à dé-multiplexer les groupes NNS sous-bibliothèque avec des amorces orthogonales
- L' analyse des données de séquençage
- Téléchargez Flash (Fast Réglage de la longueur du court lit) 20, placer dans le dossier ainsi que les fichiers fastq.gz obtenus à partir de séquençage.
- Utilisez le flash pour joindre les fichiers fastq.gz correspondant à la fin appariés lit pour chaque paire d'indices (avant et arrière lectures pour chaque sous-groupe de bibliothèque NNS pour les pré-sélection et de sélection des cultures).
- Après avoir rejoint chaque paire de lectures, placez le fichier de sortie out.extendedFrags.fastq dans des dossiers séparés pour les résultats de la présélection ou de sélection des cultures. Renommez le fichier de sortie out.extendedFrags.fastq selon le sous-groupe de la bibliothèque NNS à laquelle elle correspond (ie., 1.fastq, 2.fastq, etc.).
- Exécutez le NNS_DataAnalyzer.m script de calcul (voir le fichier de code supplémentaire) de chaque dossier pour calculer les chiffres pour chaque mutation d'acide aminé unique, et les chiffres pour le type sauvage, pour chaque sous-groupe de bibliothèque NNS.
- Calculer l'effet de remise en forme
de chaque mutation comme le logarithme de base dix du rapport des comptages obtenus lors de la sélection (
) En fonction de la pré-sélection ( 
) État, par rapport au type sauvage: 
.
est la concentration de l'échantillon en ng / pl et 
est la longueur de la séquence de l'échantillon d'ADN (~ 360 pb). Diluer l'échantillon à 4 nM dans un tampon EB. 
de chaque mutation 
) En fonction de la pré-sélection ( 
) État, par rapport au type sauvage: 
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Representative Results
La carte de plasmide pour les cinq plasmides pBR322 modifié contenant des sites d'amorçage orthogonales (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) est représentée sur la figure 2A. Pour tester si les amorces sont spécifiques orthogonales, PCR ont été réalisées en utilisant des amorces de chaque paire individuellement orthogonaux, ainsi que l'ensemble des cinq plasmides pBR322_OP1-5 ou avec tous les plasmides moins le plasmide correspondant à la paire d'amorces orthogonale. Le produit correct n'a été obtenue que lorsque le plasmide correspondant a été inclus, et aucun produit de toute taille a été obtenu en son absence (figure 2B).
Une expérience représentative a été réalisée selon le protocole décrit dans ce document (figure 1). Après traitement (section du protocole 4.2), 6,2 × 10 6 lit à partir de l'état de pré-sélection et de 6,3 × 10 6 lit à partir de la sélection ampicilline 50 ug / ml conditisur ont été obtenus. Les chiffres obtenus pour chaque mutation acide aminé de l'état pré-sélection affiche un log-normale caractéristique de distribution (figure 3A) 13. Au moins un compte de séquençage de la culture pré-sélection pour 98,9% des mutations (58 avait pas de chiffres), et plus de 100 chefs d' accusation pour 91,2% (465 avaient moins de 100 chiffres) ont été obtenus. La figure 3B illustre l'effet relatif de remise en forme () pour chaque mutation au niveau de chaque position de TEM-1; la distribution de est représentée sur la figure 3C. Sous sélection à 50 pg / ml d' ampicilline, la plupart des mutations ont un effet de remise en forme neutre ou presque neutre (≈ 0, ce qui correspond à des pixels blancs sur la figure 3B et le grand pic dans la figure 3C). Une petite fraction des mutations à cette concentration ont des effets importants sur la condition physique (<< 0, correspondant à des pixels bleus dans la figure 3B et la queue gauche de la figure 3C); exp ectedly, ceux - ci comprennent des mutations dans les résidus de sites actifs hautement conservés (S70, K73, S130, D131, N132, K234 et G236) 13,14. En revanche, quelques mutations augmentent considérablement remise en forme sur celle de TEM-1 (>> 0, correspondant à des pixels rouges dans la figure 3B), comme on pouvait s'y attendre depuis TEM-1 est très efficace à l' ampicilline hydrolyse ( 
≈ 10 7 M -1 s -1) 14.
Figure 1. Plan de Whole-protéine Saturation Protocole mutagenèse pour TEM-1 β-lactamase sous ampicilline Sélection. Actions tel que décrit dans le protocole sont indiqués en gras. étapes de protocole numérotées sont affichés à gauche, pour la référence au texte principal.k "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Validation de Orthogonal Amorçage Site vecteurs plasmidiques. Carte (A) plasmide pour les cinq plasmides pBR322 modifiés contenant des sites d'amorçage orthogonales (de pBR322_OP1 - pBR322_OP5). Localisation et direction des sites d'amorçage orthogonales sont indiqués. Emplacements de plusieurs sites de restriction sont marqués; la protéine entière bibliothèque TEM-1 mutagenèse à saturation (qui inclut l'ensemble de gène TEM-1 et le promoteur) est clone en entre les sites de restriction Aatll et AvrII. Abréviations: Tet gène de résistance à la tetracycline, ori origine de réplication (b) chaque paire d'amorces orthogonales (OP1-à OP5) a été testé dans une PCR contenant l' ensemble des cinq plasmides pBR322_OP1-5 (+) ou avec tous les plasmides moins le plasmide respectif (. ˗). Montré est un bromure d'éthidiumun gel d'agarose coloré (1% p / v) chargé avec chaque réaction de PCR, la taille séparé par électrophorèse. Le produit de la taille attendue est 1628 pb; la première voie est une échelle d'ADN, les tailles des normes pertinentes sont indiquées. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Résultats de TEM-1 β-lactamase entier protéines Saturation Experiment. (A) Histogramme montrant la répartition des chiffres pour chaque mutation d'acides aminés obtenue à partir d'un séquençage à haut débit de la bibliothèque à partir de la condition de pré-sélection. Pour plus de simplicité, les mutations avec zéro comptages (53 mutations) sont présentés comme ayant un compte d'une. Effets (B) de remise en forme de toutes les mutations d'acides aminés simples dans TEM-1 sous sélection à 50 pg / ml d'ampicilline. Montré est les donnéesmatrice contenant l'effet de remise en forme relative () représenté par colorimétrie avec le bleu représentant effet délétère, rouge un effet positif et blanc aucun effet de remise en forme par rapport au type sauvage. Les mutations pour lesquelles aucun comptages ont été obtenus à partir de la culture pré-sélection sont de couleur noire. Les lignes représentent des positions le long de la séquence primaire et les colonnes indiquent une mutation à l'un des vingt acides aminés ou codon d'arrêt (indiqué par code à une lettre, * est le codon stop); la structure secondaire de TEM-1 est indiquée à motifs gauche et plusieurs hautement conservées au sein du site actif sont indiqués à droite. (C) Histogramme montrant la répartition des effets relatifs de remise en forme. Montré sont les résultats de ces mutations avec> 100 comptages obtenus à partir de séquençage de la culture pré-sélection. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Réactif | Masse ou volume | Commentaire |
| Typtone | 2 g | |
| Extrait de levure | 0,5 g | |
| Chlorure de sodium | 0,06 g | |
| Chlorure de potassium | 0,02 g | |
| Sulfate de magnésium | 0,24 g | |
| Eau purifiée | 100 ml |
Tableau 1. super Optimal Broth (SOB). Les noms de réactifs et les quantités utilisées dans la préparation de 100 ml SOB (Protocole étape 1.1).
| Réactif | Mass ou Volume | Commentaire |
| Typtone | 10 g | |
| Extrait de levure | 5 g | |
| Chlorure de sodium | 10 g | |
| Eau purifiée | 1 L |
Tableau 2. Luria-Bertani (LB). Les noms de réactifs et les quantités utilisées dans la préparation de 1 L LB (protocole étape 1.1).
| Réactif | Masse ou volume | Commentaire |
| Typtone | 10 g | |
| Extrait de levure | 5 g | |
| Chlorure de sodium | 10 g | |
| Gélose | 15 g | |
| Eau purifiée | 1 L |
Tableau 3. LB-agar. Les noms et les quantités de réactifs utilisés dans la préparation LB-agar (protocole étape 1.1).
| Réactif | Le volume | Commentaire |
| tampon 5x PCR | 1450 pi | |
| additif de PCR | 1450 pi | |
| 2 mM dNTPs | 725 pi | 2 mM de chaque nucleotide |
| AatII_F 50 uM ou AvrII_R amorce | 145 pi | |
| 1 ng / ul de plasmide pBR322_AvrII | 145 pi | |
| 2 unités / ul d'ADN polymerase | 72,5 pi | |
| eau | 363 pi |
Tableau 4. Première ronde Mutagène PCR Master Mix. Les noms de réactifs et les quantités pour la préparation du mélange maître pour le premier tour mutagène PCR (protocole étape 2.2.1). Quantité totale est suffisante pour 290 25 réactions ul.
| Réactif | Le volume | Commentaire |
| tampon 5x PCR | 1450 pi | |
| additif de PCR | 1450 pi | |
| 2 mM dNTPs | 725 pi | 2 mM de chaque nucleotide |
| 50 uM AatII_F primaire | 145 pi | |
| 50 uM AvrII_R primaire | 145 pi | |
| 2 unités / ul d'ADN polymerase | 72,5 pi | |
| eau | 2.973 pi |
Tableau 5. Deuxième tour Mutagène PCR Master Mix. Les noms de réactifs et les quantités pour la préparation du mélange maître pour le second tour mutagène PCR (protocole étape 2.2.2). Quantité totale est suffisante pour 290 25 réactions ul.
| Réactif | Le volume | Commentaire |
| tampon 5x PCR | 20 ul | |
| additif de PCR | 20 ul | |
| 2 mM dNTPs | 10 ul | 2 mM de chaque nucleotide |
| 50 uM AvrII_F primaire | 2 ul | |
| 50 uM AatII_OP1_R - AatII_OP5_R amorce | 2 ul | une amorce par réaction, couplé avec le plasmide respectif |
| 1 ng / ul plasmide pBR322_OP1-5 | 2 ul | un plasmide par réaction |
| 2 unités / ul d'ADN polymerase | 1 ul | |
| eau | 43 pi |
Tableau 6. Vecteur de clonage par PCR. Les noms et les quantités de réactifs pour la préparation de la PCR pour rendre les vecteurs de clonage (protocole étape 2.3.2).
| Réactif | Le volume | Commentaire |
| un tampon d'enzyme de restriction 10x | 5 ul | |
| 4 unités / AvrII ul | 2,5 ul | |
| 20 unités / ul Aatll | 0,5 ul | |
| ADN de digestion par restriction | volume pour 500 ng | |
| eau | 50 volume total ul |
Tableau 7. Restriction Digests. Les noms de réactifs et quantités pour les digestions des vecteurs de clonage et sous-groupes de la bibliothèque NNS (protocole étape 2.3.3) restriction.
| Réactif | Le volume | Commentaire |
| tampon ligase 10x ADN T4 | 5 ul | |
| ADN purifié groupe restriction digéré NNS sous-bibliothèque | volume 48 ng | |
| ADN vecteur de clonage digéré par restriction purifié | volume 52 ng | |
| 400 unités / pl de T4 ADN ligase | 1 ul | |
| eau | 20 ul volume total |
Tableau 8. ligatures noms de réactifs et les quantités pour les ligatures des vecteurs de clonage avec des groupes de sous-bibliothèque NNS restriction digéré dans un 1:. Vecteur 3: insérer rapport molaire (protocole de l' étape 2.3.4).
| Réactif | Le volume | Commentaire |
| tampon 5x PCR | 55 pi | |
| additif de PCR | 55 pi | |
| 2 mM dNTPs | 27,5 pi | 2 mM de chaque nucleotide |
| 2 unités / ul d'ADN polymerase | 2,75 pi | |
| eau | 113 pi |
Tableau 9. Réactifs PCR pour la préparation d' échantillons pour haut débit de séquençage. Les noms de réactifs et les quantités pour la préparation de PCR master mix utilisés pour de multiplexage avec des amorces orthogonales (4.1.1), d' isolement sous-groupes de la bibliothèque NNS (protocole étape 4.1.2) et l'ajout de séquences d'indexation (protocole étape 4.1.3). La quantité totale est suffisante pour 11 25 réactions ul.
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Discussion
Ici, un protocole est décrit pour effectuer l'évaluation fonctionnelle des bibliothèques de mutagenèse à saturation de protéine entière, en utilisant la technologie de séquençage à haut débit. Un aspect important du procédé est l'utilisation d'amorces orthogonales au cours du processus de clonage. En bref, chaque position d'acide aminé est aléatoire par PCR mutagène et mélangés ensemble dans des groupes de positions dont la longueur séquence combinée est reçue par séquençage à haut débit. Ces groupes sont clonés dans des vecteurs plasmidiques contenant des paires de sites d'amorçage orthogonaux, mélangés et soumis à une sélection, puis démultiplexé en utilisant les amorces orthogonales, et ensuite séquencées en profondeur. Les mutations sont confinés dans le séquençage lu limite de longueur, cette approche maximise le nombre de lectures utiles contenant des mutations des gènes de taille plus longue que la longueur de séquençage lire. En outre, cette technique permet de "one-batch" sélection simultanée ou de l'ensemble mutatioBibliothèque nale, ce qui réduit la charge de travail, ainsi que la possibilité que des mutations subissent différents niveaux de sélection. Pratiquement, les étapes critiques dans le protocole largement concernent l'organisation: au cours du processus de clonage (protocole de l'étape 2.3) on doit assurer le mélange correct des produits de PCR mutagène en groupes et leur clonage ultérieur dans le vecteur correct orthogonal site d'amorçage; lors de la préparation de l'échantillon pour le séquençage (protocole étape 4.1), les amorces orthogonales correctes, ainsi que des amorces pour isoler chacun des groupes NNS sous-bibliothèque et ajouter des séquences d'indexation, doivent être utilisés.
Les trois principales étapes du protocole - construction de la banque, la sélection et le séquençage - peut être modifiée à plusieurs égards. Au cours de la construction de bibliothèque, on pourrait introduire des mutations en utilisant une variété de techniques, par exemple, par PCR sujette à l'erreur, ou en construisant le gène en utilisant des oligonucléotides synthétisés par dopage dans une petite fraction de nucléotides de remplacements 21. On pourrait construire la bibliothèque pour inclure des mutations doubles ou d'ordre supérieur au sein de segments de la protéine ( par exemple, les groupes NNS sous-bibliothèque), ou dans les milieux alternatifs de génotype 22. Surtout, toutes les modifications de l'étape de la construction de la bibliothèque doivent cependant répondre au critère que la correspondance entre l'emplacement des mutations dans la séquence et la séquence lue longueur est maintenue. Ce critère exclut donc l'application du protocole vers des études approfondies de multiples mutations à travers une protéine. Les modifications apportées à la deuxième partie du protocole comprennent les conditions de sélection alternatives: (. Par exemple, la température, les niveaux de nutriments) différents types β-lactamines (ou des combinaisons) et des concentrations, des conditions de stress externes, type d'hôte (par exemple, les différents types de bactéries), ou différents temps d'échantillonnage (heures à quelques jours). Par exemple, dans les travaux précédents, nous avons examiné les effets de conditionnement physique de toutes les mutations d'acides aminés uniquedans TEM-1 sous différentes concentrations d'ampicilline, et sous la Cephalosporine de troisième génération 13 céfotaxime. En ce qui concerne la troisième étape du protocole, nous ne recommandons pas actuellement dévier du choix de la plate-forme de séquençage utilisé ici (voir le tableau des matériaux). Bien que le séquençage lu longueurs sont en effet actuellement plus dans d'autres plates-formes, le nombre de lectures obtenue est actuellement beaucoup plus faible; en général, la précision à laquelle l'effet d'une mutation peut être déterminée est proportionnelle au nombre de lectures obtenues (voir l'équation dans le protocole étape 4.2.5).
En grande partie pour la simplicité, le protocole utilise TEM-1 β-lactamase comme un système modèle, mais la méthodologie décrite ici peut être étendue à d'autres systèmes pour lesquels une sélection à haut débit ou un test de dépistage est en place. La construction de ces essais est cependant souvent non-trivial: Tout d'abord, une stratégie pour la compartimentation du gène (mutation) et la protéine ensemble doit être établiePar exemple dans une cellule, des gouttelettes de liquide (comme dans une plate-forme de micro-fluidique), soit par expression phagique. Deuxièmement, et plus important encore , une connexion quantitative entre la fonction de la protéine et un phénotype sélectionnable, ou remise en forme, doit être établi. Pour des enzymes impliquées dans le métabolisme ou la résistance aux antibiotiques, la capacité des cellules à croître en éléments nutritifs d'abandon ou de support aux antibiotiques est souvent une fonction directe de l'activité enzymatique. Une approche plus synthétique pourrait être utilisée dans d' autres systèmes, par exemple en liant une affinité de liaison au gène rapporteur de la protéine-protéine (par exemple., La protéine fluorescente) expression dans des bactéries ou des levures 11,23, ou en utilisant un substrat d'enzyme fluorogène dans un système microfluidique 24 . Enfin, un tel test doit être évolutive, afin de répondre à la taille d'une banque de mutagenèse protéine entière.
En résumé, une approche basée sur le séquençage à haut débit pour l'évaluation fonctionnelle des bibliothèques saturation mutagenèse-protéine entière est described ici. Au centre de cette approche est la construction de la bibliothèque de segments le long de l'intérieur de la mutagénèse du gène, et l'utilisation de codes à barres d'amorce orthogonales pour marquer chaque segment de multiplexage et de démultiplexage de la bibliothèque. Nous prévoyons que ce protocole pourrait être facilement appliquée à d'autres protéines pour lesquelles une sélection ou un écran à haut débit approprié a été mis au point.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typtone | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| Yeast extract | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| Petri plates | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol scale, standard desalting |
| pBR322_AvrII | available upon request | pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | available upon request | five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491L | includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer) |
| 15 ml conical tube | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR plate, 96 well | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 well plate seal | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96-well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| 96-well black-walled, clear bottom assay plates | Corning | 3651 | |
| Lambda phage DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA reagent | Invitrogen | P7581 | dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4 |
| Victor 3 V microplate reader | PerkinElmer | ||
| DNA purification kit | Zymo Research | D4003 | |
| Microcentrifuge tubes | Corning | 3621 | |
| Long-wavelength UV illuminator | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| Agarose gel DNA extraction buffer | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 electrocompetent E. coli | Avidity | EVB100 | |
| Electroporator (E. coli Pulser) | Bio-Rad | 1652102 | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| Plasmid purification kit | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 well PCR strip tubes | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32854 | dsDNA quantitation reagent |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Ampicillin sodium salt | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq desktop sequencer | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform |
| FLASh software | John Hopkins University - open source | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC |
||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG |
||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG |
||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC |
||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC |
||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC |
||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC |
||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG |
||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC |
||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC |
||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC |
||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC |
||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC |
||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG |
||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
References
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