Summary
Мы представляем протокол для функциональной оценки комплексных библиотек мутагенеза насыщения Одноузельная белков с использованием высокой пропускной последовательности. Важно отметить, что этот подход использует ортогональные пары праймеров мультиплекс библиотека строительства и последовательности. Представитель результаты с использованием TEM-1 бета-лактамазу, выбранный при клинически значимой дозы ампициллина предоставляются.
Introduction
Мутагенеза уже давно используется в лаборатории для изучения свойств биологических систем и их эволюции, а также для создания мутантных белков или организмов с улучшенными или новыми функциями. В то время как ранние подходы опирались на методы , которые производят случайные мутации в организмах, появление технологии рекомбинантных ДНК позволило исследователям ввести выберите изменения ДНК в сайт-специфической манере, то есть., Сайт-направленный мутагенез 1,2. С учетом современных методов, как правило , с использованием мутагенных олигонуклеотидов в полимеразной цепной реакции (ПЦР), он относительно легкий , чтобы создавать и оценивать небольшое число мутаций (например., Точечные мутации) в данном гене 3,4. Это гораздо сложнее, однако, когда цель подходы, например, создание и оценка всех возможных одноузельных (или более высокого порядка) мутации.
В то время как многое узнали из ранних исследований, пытающихся оценить большое количество мutations в генах, методы , используемые часто трудоемкий, например , требующей оценки каждой мутации независимо друг от друга с помощью нонсенс - супрессоры штаммы 5-7, или были ограничены в количественном способности из - за низкой глубины секвенирование Sanger секвенирования 8. Методы , используемые в этих исследованиях , были в значительной степени вытеснен методами с использованием высокой пропускной способностью технологии секвенирования 9-12. Эти концептуально простые подходы влекут за собой создание библиотеки , содержащей большое количество мутаций, подвергая библиотеку на экран или выбора для функции, а затем глубокого секвенирования (то есть., По порядку> 10 6 секвенирования читает) библиотека , полученные до и после выбора. Таким образом, фенотипические или фитнес эффекты большого количества мутаций, представлен как изменение частоты популяции каждого мутанта, можно оценивать одновременно и более количественно.
Ранее мы ввели Simp(т. е, цельного белка мутагенеза насыщения библиотек) ле подход к оценке библиотек всех возможных мутаций отдельных аминокислот в белках, применимый к генам с длиной более , чем последовательности чтения длину 11,13: Во- первых, каждая позиция аминокислота представляет собой рандомизированное сайт-направленного мутагенных PCR. В ходе этого процесса ген разделен на группы, состоящие из прилежащих позиций с общей длиной размещены путем секвенирования платформы. Мутагенные ПЦР-продукты для каждой группы затем объединяются, и каждая группа независимо друг от друга подвергают селекции и высокой пропускной последовательности. Поддерживая соответствие между расположением мутаций в последовательности и длины последовательности чтения, этот подход имеет преимущество максимизации глубины секвенирования: в то время как можно было бы просто последовательность таких библиотек в коротких окнах без разделения на группы (например, с помощью стандартного дробовика. секвенирование подход), наиболее чтения, полученные бы дикого типа и, следовательно, мajority секвенирования пропускной способности неиспользуемого (например, для целого белка мутагенеза насыщения библиотеки белка кислоты 500 аминокислоты секвенировали в 100 аминокислот (300 пар оснований ) окон, при минимальном 80% читает будет последовательность дикого типа).
Здесь протокол представлен , который использует высокую пропускную способность секвенирования для функциональной оценки целого белка библиотек мутагенеза насыщения, с использованием вышеуказанного подхода (описанной на рисунке 1). Важно отметить, что мы вводим использование ортогональных праймеров в библиотеке процесса клонирования для штрих-кода каждой группы последовательности, которая позволяет им быть мультиплексированы в одну библиотеку, подвергаясь одновременно скрининга или отбора, а затем демультиплексируется для глубокого секвенирования. Так как группы последовательности не подвергаются отбору независимо друг от друга, это снижает нагрузку и гарантирует, что каждая мутация испытывает тот же уровень отбора. ТЕМ-1 β-лактамазы, фермента, который придает устойчивость на высоком уровне дляβ-лактамные антибиотики (например, ампициллин.) в бактерии используют в качестве модельной системы 14-16. Протокол описан для оценки в целом белка насыщения мутагенеза библиотеки TEM-1 в Е. палочка при отборе на приближенном уровне сыворотки для клинической дозы ампициллин (50 мкг / мл) 17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: На рисунке 1 контур протокола. Несколько шагов и реагенты в протоколе требуют меры безопасности (помеченные "ОСТОРОЖНО"). Обратитесь к Паспорта безопасности перед использованием. Все шаги протокола выполняются при комнатной температуре, если не указано другое.
1. Подготовить медиакультуры и планшеты
- Подготовка и стерилизовать автоклавированием 1 л очищенной воды, 100 мл Супер Оптимальное Бульон (Соб; Таблица 1), 1 л Лурии-Бертани бульона (LB; Таблица 2) и 1 л LB-агар (таблица 3). Приготовьте отдельно и стерилизовать по три культуры колбах каждая из которых содержит 1 L LB.
Примечание: В протокол "вода" относится к автоклава стерилизуют очищенной воды; SOB, LB и LB-агар относятся к автоклава стерилизуют растворами. - Приготовьте 12 мг / мл маточного ТЕТ путем растворения 0,12 г тетрациклина гидрохлорида в 10 мл 70% -ного этанола. Стерилизовать через фильтр 0,2 мкм и магазинпри 4 ° С в защищенном от света месте.
- Прохладный LB-агар до 50 ° С, а затем добавляют 1 мл Tet складе (конечная концентрация 12 мкг / мл Tet). Разлить в чашки Петри и охлаждаться при комнатной температуре в защищенном от света месте. Хранить при температуре 4 ° С в защищенном от света месте.
2. Построение полного гена Насыщенность мутагенеза Library
Примечание: Грунтовки; законченные ДЗП, дайджесты ограничение и лигатуры; и очищенных ДНК-образцов можно хранить при -20 ° С.
- Проектирование мутагенеза праймеров
- Для mutagenize каждой позиции аминокислоты для всех возможных аминокислот, разработать пару комплементарных мутагенных праймеров (смысл / вперед и антисмысловой / назад) для каждой позиции аминокислоты со следующими принципами:
- Замены кодон, соответствующий аминокислоте быть мутагенезу путем NNS (где N представляет собой смесь всех четырех нуклеотидных оснований и S представляет собой смесь цитозина (С) и гуанин (G)), и центр в чопорнаяэр, по бокам приблизительно на 15 нуклеотидов с каждой стороны.
- Убедитесь , что 5 'и 3' концы заканчиваются в C или G , и что температура плавления (Тпл) составляет приблизительно 70 ° С 3. С помощью вычислительной NNS_PrimerDesign.m сценария (см Дополнительный файл кода) для разработки NNS мутагенеза праймеров в соответствии с этими рекомендациями.
- Заказать праймеры из коммерческого источника. Для удобства использования, которые их синтезируют в формате 96-луночного планшета и предварительно разведенные в воде до 50 мкм, с одним набором пластин, содержащих смысл мутагенеза праймеров и еще антисмысловой праймеры.
- Наполните пипетку резервуар с водой и использовать многоканальную пипетку для переноса 95 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных планшетах. Развести Праймеры в 20 раз до 2,5 мкм с помощью многоканальной пипетки для передачи по 5 мкл из 96-луночные планшеты, содержащие смысловой мутагенеза праймеров к родственным лунки планшетов, содержащих воду.
- Повторениешаг протокола 2.1.3 для разбавления антисмысловой мутагенеза праймеров.
- Для mutagenize каждой позиции аминокислоты для всех возможных аминокислот, разработать пару комплементарных мутагенных праймеров (смысл / вперед и антисмысловой / назад) для каждой позиции аминокислоты со следующими принципами:
- Синтез НМВ подбиблиотек для каждой позиции аминокислотной последовательности с двухстадийной ПЦР сайт-направленного мутагенеза
- Выполните первом раунде мутагенные МКП. Для каждого праймера мутагенеза, готовят 25 мкл ПЦР-реакции с использованием pBR322_AvrII плазмиды в качестве матрицы и праймеров AatII_F или AvrII_R (смысловой мутагенеза праймеров в паре с праймером AvrII_R и антисмысловых праймеров мутагенеза спаренными с праймером AatII_F; в общей сложности 526 ДЗП). Таблицу материалов для AatII_F и AvrII_R последовательностей.
- Подготовка ПЦР "мастер - микс" путем добавления реагентов из таблицы 4 в конической трубе 15 мл. Переложить в пипетку бассейна. Используйте многоканальную пипетку для переноса 15 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных ПЦР планшет. С помощью многоканальной пипетки для передачи по 10 мкл из 96-луночные планшеты, содержащие разбавленные смысл мутагенеза праймеров к родственным скважин Iп планшеты ПЦР.
- Накройте каждую пластину ПЦР с уплотнительной пластины 96-луночного. Центрифуга при 200 х г в течение 2 мин.
- Передача пластин ПЦР в амплификатор и запустить следующую программу: 98 ° C в течение 30 секунд; 20 циклов: 98 ° C в течение 10 сек, 55 ° С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1 мин; 72 ° С в течение 2 мин; держать при температуре 4 ° С.
- Повторите шаги протокола 2.2.1.1 - 2.2.1.3 для 96-луночные планшеты, содержащие разбавленные антисмысловых праймеров мутагенеза.
- Выполнение второго круга мутагенные МКП. Для каждой позиции аминокислоты, готовят 25 мкл ПЦР-реакции с использованием праймеров AatII_F и AvrII_R, а также смешанный и разводили в первом раунде мутагенных продуктов ПЦР в качестве матрицы (всего 263 ДЗП).
- Наполните пипетку резервуар с водой и использовать многоканальную пипетку для передачи 198 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных планшетах.
- Комбинирование и разбавить в 100 раз мутагенных PCR продукты для каждой позиции аминокислотной последовательности с использованием многоканальной пипеткиПервая передача 1 мкл из 96-луночных ПЦР-планшеты, содержащие ПЦР-продуктов в результате смысле мутагенеза праймеров к родственным лунки планшетов, содержащих воду. Затем повторите передачу для ПЦР-продуктов в результате антисмысловых праймеров мутагенеза.
- Подготовка ПЦР "мастер - микс" путем добавления реагентов из Таблицы 5 к конической трубе 15 мл. Переложить в пипетку бассейна. С помощью многоканальной пипетки для передачи 24 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных ПЦР планшет. С помощью многоканальной пипетки для передачи 1 мкл из 96-луночные планшеты, содержащие смешанный и разводили в первом раунде мутагенных продуктов ПЦР с родственными лунки в пластинах ПЦР.
- Накройте каждую пластину ПЦР с уплотнительной пластины 96-луночного. Центрифуга при приблизительно 200 мкг в течение 2 мин. Передача пластин Термоциклеры и запустить ту же программу, как на стадии протокола 2.2.1.3.
- Анализ результатов второго круга мутагенных ДЗП методом гель-электрофореза.Убедитесь в том, что все продукты нужного размера и отсутствия загрязняющих продуктов.
- Добавить 2 мл 2Х геля красителем в пипетку бассейна, а затем использовать многоканальную пипетку для переноса 6 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных планшетах. Используйте многоканальную пипетку для переноса 6 мкл из 96-луночные ПЦР планшеты, содержащие второго круга мутагенных продуктов ПЦР к родственными лунки 96-луночных планшетов, содержащих краситель.
- Готовят гель 1,5% агарозном с 0,2 мкг / мл этидий-бромида (ВНИМАНИЕ).
- Нагрузка ДНК лестница в первой и последней полос движения каждой строки. Затем с помощью многоканальной пипетки, чтобы загрузить 10 мкл образцов из стадии протокола 2.2.3.1.
- Запуск геля при 100 V в течение 40 мин и изображения на УФ-просвечивания.
- Повторите шаги протокола 2.2.3.2 - 2.2.3.4, пока не будут проанализированы все образцы.
- Точное измерение концентрации каждого NNS подбиблиотеки продукта ПЦР с использованием реагента дц количественный.
- Переводприблизительно 15 мл буфера EB в пипетку бассейна. Используйте многоканальную пипетку для переноса 49 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных плотными стенками, прозрачным дном планшеты для анализа.
- Используйте многоканальную пипетку для передачи по 1 мкл каждого второго этапа ПЦР-продукта (этап протокола 2.2.2) к родственным лунки планшеты для анализа 96-луночные.
- Приготовьте стандартную кривую концентрации ДНК путем разбавления ДНК фага лямбда до 2 нг / мкл в 300 мкл EB буфера, а затем сделать десять двукратных разведений (для общей сложности 11 концентраций). Передача 50 мкл в первых одиннадцати столбцах строки одного из анализа 96-луночные планшеты из предыдущего шага, который не содержит образца; к двенадцатой колонке добавить 50 мкл буфера EB (реагент пустой).
- Готовят реагент дц количественный путем добавления 75 мкл реагента (см Таблицу материалов) , 15 мл коническую пробирку, а затем добавляют 15 мл буфера EB. Взболтайте трубки, а затем передать в пипетку бассейна. Защита от света реагент,
- С помощью многоканальной пипетки для передачи 50 мкл приготовленного реагента дцДНК количественного в каждую лунку планшеты для анализа. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение 5 мин в защищенном от света.
- Измеряют флуоресценцию каждого образца с использованием микропланшет-ридера и стандартные флуоресцеина длины волн (возбуждение 485 нм, излучение 520 нм, 0,1 сек).
- Вычитание значения флуоресценции реагента бланка из всех образцов. Генерация стандартной кривой из измерений флуоресценции образцов фага лямбда. Вычислить концентрацию каждого образца с использованием их соответствующего измерения флуоресценции и стандартной кривой.
- Выполните первом раунде мутагенные МКП. Для каждого праймера мутагенеза, готовят 25 мкл ПЦР-реакции с использованием pBR322_AvrII плазмиды в качестве матрицы и праймеров AatII_F или AvrII_R (смысловой мутагенеза праймеров в паре с праймером AvrII_R и антисмысловых праймеров мутагенеза спаренными с праймером AatII_F; в общей сложности 526 ДЗП). Таблицу материалов для AatII_F и AvrII_R последовательностей.
- Клонирование НМВ суб-библиотек в векторы выбора
- Смешайте 100 нг каждого NNS подбиблиотеки продукта ПЦР на пять НМВ подбиблиотека групп. Следуя инструкциям производителя, очистка образцов с использованием набора для очистки ДНК, а затем измеряют концентрацию с помощью ДСДНК Количественное реагента.
Примечание: Каждая группа состоит примерно из 53 позиций смежных аминокислот, расположенных вдоль последовательности TEM-1 (НМВ подбиблиотека группы 1 - 5 состоят из позиций 26 - 78, 79 - 132, 133 - 183, 184 - 236, и 237 - 290, соответственно; нумерация в соответствии с Ambler и др 19).. - Создание клонировании векторов для каждой NNS подбиблиотека группы.
- Подготовьте пять 100 мкл МКП в соответствии с таблицей 6, с использованием праймеров AvrII_F и AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, и плазмидами pBR322_OP1-5 в качестве матрицы (AatII_OP1_R сопряженным с pBR322_OP1 и т.д.).
- Переезд в Термоциклеры и запустить следующую программу: 98 ° C в течение 30 секунд; 25 циклов: 98 ° C в течение 10 сек, 55 ° С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1,5 мин; 72 ° С в течение 2 мин; держать при температуре 4 ° С. См T в состоянии материалов для последовательностей AatII_R и AvrII_F.
- Готовят гель 1% -ном агарозном с 0,2 мкг / мл этидий-бромида (ВНИМАНИЕ).
- Добавьте 20 мкл 6х геля красителем для каждого образца ПЦР. Загрузите первую полосу геля с лестницы ДНК; загружать весь объем каждого образца, пропуская по меньшей мере, одной скважины между образцами.
- Выполнить гель при 100 В в течение 50 мин.
- Визуализируйте гель с помощью УФ-осветитель длинноволновое (Предупреждение). Акцизные срезы, содержащие продукт ПЦР при температуре ~ 3500 пар оснований; передавать отдельные микроцентрифуге трубки. Гелевые срезы, можно хранить при температуре -20 ° C.
- Следуя инструкциям производителя, очищают образцы с использованием набора для экстракции из геля и мера концентрации с использованием реагента дц количественный.
- Для обоих подбиблиотека групп НМВ (шаг протокол 2.3.1) и клонированию векторов (этап протокола 2.3.2), установленных ограничение дайджесты с AatII и AvrII ферментами в соответствии с Т умелым 7. Инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 часа. Следуя инструкциям производителя, очистка образцов с использованием набора для очистки ДНК, а затем измеряют концентрацию с помощью дц количественно онции реагента.
- Настройка реакции лигирования следующей таблице 8 для каждого ограничения переваренной NNS подбиблиотека группы с родственными рестрикции-перевариваются клонировании вектор (NNS подбиблиотека 1 -й группы с pBR322_OP1 и т.д.). Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Очистка реакции с использованием набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя; элюции ДНК с 20 мкл воды.
- Transform полноту очищенных реакций лигирования в библиотеку эффективных Е. палочки клетки с помощью электропорации.
- Оттепель Электрокомпетентные Е. клетки палочки , а затем поместить клетки и очищают реакции лигирования на льду.
- Передача 10 мкл оттаивают клеток к каждой очищенной реакции лигирования, а затем передать в кювету для электропорации. Электропорации 1,8 кВ.
- Восстановление клеток путем ресуспендирования в 1 мл рыдать. Инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.
- Ресуспендируют 10 мкл каждой культуры восстановления в 990 мкл LB; распространить 100 мкл на LB-чашки с агаром Containing 12 мкг / мл Tet. Инкубируйте пластины O / N (~ 16 ч) при 37 ° С.
- Для каждой культуры восстановления, подготовить культуры колбу 250 мл с 50 мл LB и 50 мкл Tet запаса. Перенести в колбу оставшиеся ~ 1 мл восстановления культуры. Выдержите O / N (~ 16 ч) при температуре 37 ° С при интенсивном помешивании (~ 200 оборотов в минуту).
- Подсчитать количество колоний на каждой пластине. Подсчитать количество успешных трансформантов как
, где 
это количество колоний, 
является объем восстановления культуры (1000 мкл) и 
является объем культуры высевают восстановления (1 мкл).
Примечание: Для того, чтобы обеспечить полный охват всех мутаций, как правило число успешных трансформантов должно быть ≥100 раз по сравнению число ожидаемых мутаций. Каждый NNS подбиблиотека имеет 53 позиции ~, так что ожидаемое количество мутаций составляет 53 × 32 позиции кодона / позиция ≈ 1,7 × 10 3; чтобы дать библиотека размер ≥100 раз (≥1.7 × 10 5) должны быть ≥170 колоний на каждой пластине. - В соответствии с инструкциями производителя, выделения плазмидной ДНК из культур с использованием набора для очистки плазмиды и затем измеряют концентрацию с использованием реагента дц количественный. Смешайте 100 нг каждой плазмиды. Это создает окончательный целого белка библиотеки мутагенеза насыщения.
- Смешайте 100 нг каждого NNS подбиблиотеки продукта ПЦР на пять НМВ подбиблиотека групп. Следуя инструкциям производителя, очистка образцов с использованием набора для очистки ДНК, а затем измеряют концентрацию с помощью ДСДНК Количественное реагента.
, где 
это количество колоний, 
является объем восстановления культуры (1000 мкл) и 
является объем культуры высевают восстановления (1 мкл). 3. Выбор TEM-1 цельного белка Насыщенность мутагенеза Библиотека для антибиотикорезистентности
- Подготовка культуры предварительного отбора.
- Развести плазмиды, полученной на стадии протокола 2.3.7 до 0,5 нг / мкл в воде и переносят 20 мкл в микроцентрифужных трубки. Выполните преобразование, повторнотерпимого отношения к просрочен-, металлизированный и O / N роста, как описано выше на стадии протокола 2.3.5, за исключением передачи по 1 мкл культуры восстановления SOB до 999 мкл LB.
- Подсчитайте количество колоний. Для того, чтобы обеспечить полный охват всех мутаций должен быть ≥100 колонии, указывающие на ≥10 6 успешных трансформантов (100 × 263 × 32 позиции кодонов / положение ≈ 10 6).
- Измерьте концентрацию 50 мл O / N культуры.
- Подготовьте заготовку LB путем добавления 1 мл LB в спектрофотометре кювете. Мера OD600 на спектрофотометре.
- Развести O / N культуры в 10 раз путем ресуспендирования 100 мкл в 900 мкл LB. Измерьте OD600. Вычтите чтение OD600 заготовки и умножить на 10, чтобы дать OD600 от O / N культуры.
- Предварительно нагреть три колбах с культурой с шага протокола 1.1 в течение ~ 30 мин при 37 ° С. Развести O / N культуру OD600 = 0,1 и добавляют 1 мл в одну колбу (конечная OD600 = 0,001). Tего есть "предварительный отбор культуры".
- Выдержите "культуру предварительного отбора" при 37 ° С при интенсивном встряхивании (200 оборотов в минуту). Периодически контролировать рост путем измерения OD600, как на стадии протокола 3.1.3 (нет необходимости, чтобы разбавить культуру в 10 раз) до OD600 = 0,1 (~ 2,5 ч).
- Перенести 100 мл культуры предварительного отбора к двум 50 мл конические пробирки. Центрифуга при 4000 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Удалить большую часть надосадочной жидкости и объединить в единый 15 коническую трубку. Повторите центрифугирования и удалить все супернатант. Хранить при -20 ° C.
- Селекцией на устойчивость к ампициллину.
- В то время как культура предварительного выбора инкубирования, готовят 50 мг / мл маточного АМФ в воде путем растворения 0,5 г ампициллина натриевую в 10 мл воды. Стерилизуют с использованием фильтра и хранят 0,2 мкм при 4 ° С.
- Для остальных двух колб, добавляют Tet до конечной концентрации 12 мкг / мл и объемом предварительного отбора культуры, таких тха т окончательный OD600 = 0,001. К одной колбе, добавляют 1 мл Amp для конечной концентрации 50 мкг / мл - это "выбор культуры".
- Инкубируйте культур при температуре 37 ° С при интенсивном помешивании (200 оборотов в минуту). Мониторинг роста культуры, для которых не ампициллин не добавляли в предыдущем шаге, пока OD600 = 0,1 (~ 2,5 ч). В это время, также измеряют OD600 культуры селекции.
- Разделить OD600 культуры селекции в 0,1 и умножить на 100 мл. Передача этого объема (~ 400 мл) до 50 мл конические пробирки и центрифугируют при 4000 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Удалить большую часть надосадочной жидкости и объединить в единый 15 коническую трубку. Повторите центрифугирования и удалить все супернатант.
- В соответствии с инструкциями производителя, выделения плазмидной ДНК из предварительного отбора (этап протокола 3.1.6) и выбора (этап протокола 3.2.4) культуры клеток гранул, а затем измеряют концентрацию с использованием реагента дц количественный.
- Подготовка проб для высокой пропускной последовательности
- Готовят 25 мкл в МКП де-мультиплексирование NNS подбиблиотека группы с ортогональным праймеров
- Подготовка мастер смеси ПЦР в соответствии с таблицей 9; передать 23 мкл десяти ПЦР пробирки.
- Добавляют 1 мкл 0,5 нг мкл очищенной ДНК плазмиды / из культуры предварительного отбора ПЦР пробирки 1 - 5 и от культуры выбора для труб 6 - 10.
- Смешайте 50 мкл 50 мкМ вперед ортогональных праймеров OP1_F - OP5_F с соответствующей обратной ортогональные праймеров OP1_R - OP5_R. В том же порядке, передача 1 мкл в ПЦР - пробирки 1 - 5 и 6 - 10. См Таблица материалов для последовательностей OP1_F - OP5_F и OP1_R - OP5_R.
- Передача ПЦР пробирки в амплификатор. Выполните следующую программу: 98 ° C в течение 30 секунд; 20 циклов: 98 ° C в течение 10 сек, 55 °С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1,5 мин; 72 ° С в течение 2 мин; держать при температуре 4 ° С.
- Подготовить 25 мкл МКП для выделения каждой из подбиблиотека групп НМВ
- Развести в 100 раз десять с шага МКП протокола 4.1.1.4 путем передачи по 1 мкл каждого ПЦР для разделения трубок и добавления 99 мкл воды. Mix, затем пипеткой из 99 мкл и выбросить.
- Смешайте 50 мкл 50 мкМ праймеры Group1_F - Group5_F с соответствующим обратным праймерами Group1_R - Group5_R. В том же порядке, передача 1 мкл ПЦР пробирки 1 - 5 и 6 - 10. См Таблица материалов для последовательностей Group1_F - Group5_F и Group1_R - Group5_R.
- Подготовка мастер смеси ПЦР в соответствии с таблицей 9, передать 23 мкл в каждую пробирку PCR. Передача ПЦР пробирки в амплификатор; запустить ту же программу, что и в шаге протокола 2.2.1.3.
- Провести финальные 25 мкл, чтобы добавить МКП индексации последовательностей
- дилютня в 100 раз десять с шага МКП протокола 4.1.2.3 путем передачи по 1 мкл каждого ПЦР для разделения трубок и добавления 99 мкл воды. Mix, затем пипеткой из 99 мкл и выбросить.
- Подготовка мастер смеси ПЦР в соответствии с таблицей 9, передать 23 мкл в каждую пробирку PCR.
- Для труб с шаблоном, происходящих из НМВ подбиблиотека групп 1-5, передать 0,5 мкл на пробирку прямых праймеров 501_F - 505_F соответственно. Для труб с шаблоном в результате предварительного отбора и селекции культур, переноса 0,5 мкл на пробирку обратного праймеров 701_R и 702_R соответственно. Таблицу материалов для последовательностей 501_F - 505_F и 701_R и 702_R.
- Передача ПЦР пробирки в амплификатор и запустить программу с шага 2.2.1.3.
- Смешайте и очистить образцы
- Концентрации Измерение с использованием реагента согласно дц количественный с инструкциями производителя. Смешайте 100 нг каждого продукта Int PCRоа сингл микроцентрифужных трубки.
- Готовят гель 2% -ном агарозном с 0,2 мкг / мл этидий-бромида (ВНИМАНИЕ).
- Добавить 6х гель красителем смешанному продуктов ПЦР образца. Загрузите первую полосу геля с лестницы ДНК; загружать весь объем образца.
- Выполнить гель при 100 В в течение 50 мин. Визуализируйте гель с помощью УФ-осветитель длинноволновое (Предупреждение). Акцизный срез, содержащий продукт ПЦР при ~ 360 пар оснований; передать в пробирке. ломтик Гель можно хранить при -20 ° С.
- Следуя инструкциям производителей, очищают образец с использованием набора для экстракции из геля и измеряют концентрацию с использованием реагента дц количественный. Это последний образец для высокой пропускной последовательности.
- Последовательность на секвенирования платформы с высокой пропускной способностью (см таблицу материалов для платформы , используемых в данном протоколе).
- Вычислить концентрацию образца в нМ, как
концентрация образца в нг / мкл и 
длина последовательности ДНК образца (~ 360 п.н.). Разбавьте образец до 4 нМ в буфере EB. - Следуйте инструкциям производителя для денатурации образца и разбавить до 9 часов в буфере для гибридизации.
- Нагрузка 600 мкл образца в картридже реагента. Последовательность в соответствии с инструкциями изготовителя и подсказкам на экране.
- Вычислить концентрацию образца в нМ, как
- Готовят 25 мкл в МКП де-мультиплексирование NNS подбиблиотека группы с ортогональным праймеров
- Анализ данных секвенирования
- Скачать Flash (быстрый длина настройка коротких прочтений) 20, поместить в папку вместе с fastq.gz файлов , полученных в результате секвенирования.
- Используйте вспышку, чтобы присоединиться к fastq.gz файлы, соответствующие парного считывает для каждой пары индексов (вперед и назад считывает для каждой NNS подбиблиотека группы для предварительного отбора и селекции культур).
- После присоединения к каждой паре читает, поместите выходной файл out.extendedFrags.fastq в отдельные папки для результатов предварительного отбора или отбора культур. Переименовать выходной файл out.extendedFrags.fastq в соответствии с подбиблиотека группы NNS, которому оно соответствует (то есть., 1.fastq, 2.fastq и т.д.).
- Запуск вычислений NNS_DataAnalyzer.m скрипт (см символы дополнительного файла) из каждой папки для вычисления отсчетов для каждой мутации одной аминокислоты, а отсчеты для дикого типа, для каждого NNS подбиблиотека группы.
- Вычислить фитнес-эффект
каждой мутации как десятичное логарифму отношения отсчетов, полученных в отборе (
) По сравнению с предварительного отбора ( 
) Состояние, по сравнению с дикого типа: 
,
концентрация образца в нг / мкл и 
длина последовательности ДНК образца (~ 360 п.н.). Разбавьте образец до 4 нМ в буфере EB. 
каждой мутации 
) По сравнению с предварительного отбора ( 
) Состояние, по сравнению с дикого типа: 
, Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Карта плазмиды для пяти модифицированных плазмид pBR322 , содержащих ортогональные заливке сайты (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) показана на рисунке 2А. Для того, чтобы проверить, является ли ортогональные Праймеры специфичны, ПЦР проводили с использованием каждой пары ортогональных праймеров по отдельности, вместе со всеми пятью pBR322_OP1-5 плазмид, или со всеми плазмид минус плазмиде, соответствующей пары ортогональных праймера. Правильный продукт был получен только тогда , когда соответствующий плазмида была включена, и ни один продукт любого размера не был получен при его отсутствии (Фигура 2В).
Представитель эксперимент был проведен в соответствии с протоколом , описанным в данном тексте (рисунок 1). После обработки (раздел протокола 4.2), 6,2 × 10 6 считывает из условия предварительного отбора , и 6,3 × 10 6 считывает данные из 50 мкг / мл ампициллина conditi селекциина были получены. Подсчеты , полученные для каждой аминокислоты мутации из условия предварительного выбора отображения характерный лог-нормального распределения (рис 3A) 13. По крайней мере один отсчет от секвенирования культуры предварительного отбора на 98,9% мутаций (58 не было графов), и больше , чем 100 рассчитывает на 91,2% (465 было менее 100 отсчетов) были получены. Фигура 3В изображает относительную фитнес - эффект () для каждой мутации в каждом положении TEM-1; распределение показано на фиг.3С. При отборе в 50 мкг / мл ампициллина, большинство мутаций имеют нейтральный или почти нейтральный эффект фитнес (≈ 0, что соответствует белых пикселей на фигуре 3В и большой пик на фиг.3С). Небольшая часть мутаций при этой концентрации имеют существенное влияние на пригодность (<< 0, что соответствует синих пикселей на рисунке 3B и левый хвост на рисунке 3C); ехр ectedly, они включают в себя мутации в пределах высоко консервативных остатков активного сайта (S70, K73, S130, D131, N132, K234 и G236) 13,14. В отличие от этого , несколько мутаций значительно увеличить пригодность более , что из TEM-1 (>> 0, что соответствует красной пикселей на фигуре 3В), как и следовало ожидать , так как ТЕМ-1 имеет высокую эффективность при гидролизе ампициллину ( 
≈ 10 7 М -1 с -1) 14.
Рисунок 1. Схема из цельного белка Насыщенность мутагенеза протокола для TEM-1 бета-лактамазы при селекции ампициллин. Действия, описанные в протоколе, выделены жирным шрифтом. Номерные шаги протокола отображаются слева, для справки к основному тексту.к "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Проверка ортогональным Грунтовка сайта плазмидных векторов. (A) плазмидная карта для пяти модифицированных плазмид pBR322 , содержащих ортогональные инициирующих сайтов (pBR322_OP1 - pBR322_OP5). Расположение и направление ортогональных сайтов инициирующих указаны. Места расположения нескольких сайтов рестрикции, помечены; ТЭМ-1 целого белка мутагенеза насыщения библиотека (которая включает в себя весь TEM-1 ген и промотор) клонируют в-между сайтами рестрикции AatII и AvrII. Сокращения: ген устойчивости к тетрациклину Tet, Ori начало репликации (В) Каждая пара ортогональных праймеров (ОР1-OP5) тестировали в ПЦР , содержащий все пять pBR322_OP1-5 плазмид (+), или со всеми плазмид минус соответствующей плазмиды (. ˗). Показанный является бромид этидияЗапятнанное агарозном геле (1% вес / объем) загружаются с каждой ПЦР-реакции, размер разделяли с помощью электрофореза. Ожидаемый размер продукта 1628 п.н.; первая полоса представляет собой ДНК лестницы, размеры соответствующих стандартов указаны. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Результаты TEM-1 бета-лактамазы цельного белка Насыщенность эксперимента. (А) Гистограмма , показывающая распределение отсчетов для каждой мутации аминокислоты , полученной из высокой пропускной последовательности библиотеки из условия предварительного отбора. Для простоты, мутации с нулевыми результатами (53 мутации) показаны как имеющие счет один. (В) соответствия эффекты всех одиночных аминокислотных мутаций в TEM-1 при отборе при 50 мкг / мл ампициллина. Показана данныематрица, содержащая относительный фитнес эффект (), изображенную колориметрическим методом с синим представляющим пагубное воздействие, красный положительный эффект и белый не приспособленность эффект по сравнению с диким типом. Мутации, для которых нет на счету не были получены из культуры предварительного выбора окрашены черным цветом. Ряды изображают позиции вдоль первичной последовательности и столбцы указывают мутации к одной из двадцати аминокислот или кодон (обозначен одной буквой кода * является кодон); вторичная структура TEM-1 показан на левой и несколько высоко консервативных мотивов в пределах активного участка обозначены справа. (С) Гистограмма , показывающая распределение относительных эффектов пригодности. Показаны результаты для этих мутаций с> 100 отсчетов , полученных в результате секвенирования культуры предварительного отбора. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| реактив | Масса или объем | Комментарий |
| Typtone | 2 г | |
| Экстракт дрожжей | 0,5 г | |
| хлористый натрий | 0,06 г | |
| Хлорид калия | 0,02 г | |
| сульфат магния | 0,24 г | |
| Дистиллированная вода | 100 мл |
Таблица 1. Супер Оптимальное Бульон (Соб). Реактива наименования и количества , используемые при получении 100 мл SOB (шаг 1.1) Протокол.
| реактив | Массовый или Volумэ | Комментарий |
| Typtone | 10 г | |
| Экстракт дрожжей | 5 г | |
| хлористый натрий | 10 г | |
| Дистиллированная вода | 1 L |
Таблица 2. Лурия-Бертани Отвар (LB). Имена Реагент и количества , использованные при подготовке 1 л LB (этап протокола 1.1).
| реактив | Масса или объем | Комментарий |
| Typtone | 10 г | |
| Экстракт дрожжей | 5 г | |
| хлористый натрий | 10 г | |
| агар | 15 г | |
| Дистиллированная вода | 1 L |
Таблица 3. Имена LB-агар. Реагент и количества , используемые при приготовлении LB-агар (шаг протокола 1.1).
| реактив | объем | Комментарий |
| 5х буфер для ПЦР | 1,450 мкл | |
| ПЦР добавка | 1,450 мкл | |
| 2 мМ дНТФ | 725 мкл | 2 мМ каждого нуклеотида |
| 50 мкМ AatII_F или AvrII_R праймера | 145 мкл | |
| 1 нг / мкл плазмиду pBR322_AvrII | 145 мкл | |
| 2 ед / мкл ДНК-полимеразы | 72,5 мкл | |
| воды | 363 мкл |
Таблица 4. Первый тур мутагенный PCR Master Mix. Названия Реагент и количества для получения основной смеси для первого раунда мутагенным ПЦР (этап протокола 2.2.1). Общее количество достаточно для 290 25 реакций мкл.
| реактив | объем | Комментарий |
| 5х буфер для ПЦР | 1,450 мкл | |
| ПЦР добавка | 1,450 мкл | |
| 2 мМ дНТФ | 725 мкл | 2 мМ каждого нуклеотида |
| 50 мкМ праймера AatII_F | 145 мкл | |
| 50 мкМ праймера AvrII_R | 145 мкл | |
| 2 ед / мкл ДНК-полимеразы | 72,5 мкл | |
| воды | 2973 мкл |
Таблица 5. Второй раунд мутагенный PCR Master Mix. Названия Реагент и количества для получения основной смеси для второго раунда ПЦР мутагенным (этап протокола 2.2.2). Общее количество достаточно для 290 мкл 25 реакций.
| реактив | объем | Комментарий |
| 5х буфер для ПЦР | 20 мкл | |
| ПЦР добавка | 20 мкл | |
| 2 мМ дНТФ | 10 мкл | 2 мМ каждого нуклеотида |
| 50 мкМ праймера AvrII_F | 2 мкл | |
| 50 мкМ AatII_OP1_R - AatII_OP5_R праймер | 2 мкл | одного праймера на реакцию, в паре с соответствующей плазмиде |
| 1 нг / мкл pBR322_OP1-5 плазмиду | 2 мкл | одна плазмида на реакцию |
| 2 ед / мкл ДНК-полимеразы | 1 мкл | |
| воды | 43 мкл |
Таблица 6. Клонирование Вектор ПЦР. Реагент имена и количества для подготовки ПЦР , чтобы сделать векторы клонирования (шаг протокола 2.3.2).
| реактив | объем | Комментарий |
| 10х буфера фермента рестрикции | 5 мкл | |
| 4 ед / мкл AvrII | 2,5 мкл | |
| 20 ед / мкл AatII | 0,5 мкл | |
| ДНК рестрикции дайджеста | объем для 500 нг | |
| воды | до 50 мкл общего объема |
Таблица 7. Ограничение Дайджесты. Имена реактива и количества для ограничения дайджестов клонированию векторов и НМВ подбиблиотека групп (этап протокола 2.3.3).
| реактив | объем | Комментарий |
| буфер лигазная 10x T4 ДНК | 5 мкл | |
| Очищенный ограничение переваренной NNS группа ДНК подбиблиотека | Объем 48 нг | |
| Очищенный ограничение переваренной клонирование ДНК-вектор | Объем 52 нг | |
| 400 единиц / мкл Т4 ДНК-лигазы | 1 мкл | |
| воды | 20 мкл общего объема |
Таблица 8. Лигирование названия реактива и количества для лигирования векторов клонирования с ограничением-переваренной НМВ подбиблиотека групп в 1: 3. Вектора: вставить молярное отношение (шаг протокола 2.3.4).
| реактив | объем | Комментарий |
| 5х буфер для ПЦР | 55 мкл | |
| ПЦР добавка | 55 мкл | |
| 2 мМ дНТФ | 27.5 мкл | 2 мМ каждого нуклеотида |
| 2 ед / мкл ДНК-полимеразы | 2,75 мкл | |
| воды | 113 мкл |
Таблица 9. ПЦР Реагенты для подготовки проб для высокой пропускной последовательности. Реагент имен и количествах для приготовления смесей ПЦР мастер , используемых для демультиплексирования с ортогональным праймеров (4.1.1), изолируя НМВ подбиблиотека групп (этап протокола 4.1.2) и добавление индексации последовательностей (этап протокола 4.1.3). Общее количество является достаточным для 11 по 25 мкл реакции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь протокол описан для проведения функциональной оценки целого белка библиотек мутагенеза насыщения, используя высокую пропускную способность технологии секвенирования. Важным аспектом способа является использование ортогональных праймеров во время процесса клонирования. Если коротко, то каждая позиция аминокислоты рандомизированы по мутагенной ПЦР, и смешивают вместе в группы позиций, совокупная длина последовательности размещается высокой пропускной последовательности. Эти группы клонированы в плазмидные векторы, содержащие пары ортогональных сайтов Грунтовочные, смешивают вместе и подвергнуты селекции, затем демультиплексируется с использованием ортогональных праймеров, а затем глубоко секвенировали. Поскольку мутации заключены в пределах последовательности чтения предел длины, этот подход увеличивает количество полезной чтений, содержащих мутации в генах размером больше, чем последовательности чтения длины. Кроме того, этот метод позволяет одновременно или "один-пакетного" Выбор всей mutatioNAL библиотека, снижая рабочую нагрузку, а также возможность того, что мутации испытывают различные уровни отбора. Практически, критические шаги в протоколе во многом связана с организацией: в процессе клонирования (этап протокола 2.3) необходимо обеспечить правильное смешивание мутагенных продуктов ПЦР в группы и их последующее клонирование в правильный вектор ортогонален сайта грунтование; во время подготовки образца для секвенирования (этап протокола 4.1), тщательности ортогональных праймеров, а также в качестве праймеров для выделения каждой из НМВ подбиблиотека групп и добавить индексации последовательностей, должны быть использованы.
Три основные этапы протокола - Библиотека строительства, выбор, и секвенирования - могут быть изменены в нескольких аспектах. Во время строительства библиотеки можно ввести мутации с использованием различных методов, например, подверженной ошибкам ПЦР, или путем конструирования гена с использованием олигонуклеотиды, синтезированные с помощью легирования в небольшой доли альтернативной нуклеотидаS 21. Можно было бы построить библиотеку , чтобы включать в себя двойные или более высокого порядка мутаций в сегментах белка (т.е. NNS подбиблиотека групп), или в альтернативных фонов генотипов 22. Важно то, что все модификации строительного шага библиотеки, однако, должна удовлетворять критерию, что соответствие между расположением мутаций в последовательности и последовательности считывания длины поддерживается. Таким образом, этот критерий исключает применение протокола к комплексных исследований нескольких мутаций по всему белка. Изменения во второй части протокола включают альтернативные условия выбора: (. , Например, температура, уровни питательных веществ) различных типов β-лактамные (или их комбинации) , а также концентрации, внешние условия , стресс, тип хоста (например, различные виды бактерий), или разное время выборки (часов до нескольких дней). Например, в предыдущей работе мы рассмотрели фитнес эффекты всех мутаций одной аминокислотыв TEM-1 при различных концентрациях ампициллин, и под цефалоспорин цефотаксим третьего поколения 13. Что касается третьего шага протокола, мы в настоящее время не рекомендуется отклоняться от выбора платформы для секвенирования, используемой здесь (см Таблицу материалов). В то время как последовательность чтения длины действительно в настоящее время уже на других платформах, количество просмотров, имеющихся в настоящее время гораздо ниже; в целом точность, с которой эффект мутации может быть определена пропорционально количеству чтений получено (см уравнение в шаге протокола 4.2.5).
В основном для простоты, протокол использует TEM-1 бета-лактамазы в качестве модельной системы, однако методология, описанная здесь, может быть распространено на другие системы, для которых выбор с высокой пропускной способностью или скрининг анализа на месте. Построение таких анализов, однако, часто нетривиально: Во-первых, должна быть установлена стратегия компартментализацией гена (мутации) и белка вместе, Например, в пределах соты, капли жидкости (как в микрофлюидики платформы), или с помощью фагового дисплея. Во- вторых, и самое главное, количественное связь между функцией белка и выбираемой фенотипа, или пригодности, должны быть установлены. Для ферментов, участвующих в обмене веществ или устойчивости к антибиотикам, способность клеток расти в питательном отсева или антибиотических средств массовой информации часто является прямой функцией ферментативной активности. Более синтетический подход может быть использован и в других системах, например , путем связывания аффинности связывания с геном - репортером белок-белок (например., Флуоресцентный белок) экспрессии в бактериях или дрожжей 11,23, или с использованием флуорогенный субстрат фермента в системе 24 микрофлюидики , Наконец, такой анализ должен быть масштабируемым, чтобы обратиться размер библиотеки мутагенеза целого белка.
Таким образом, высокая пропускная способность секвенирования на основе подхода для функциональной оценки целого белка библиотек мутагенеза насыщения DESCRibed здесь. Центральное место в подходе является строительство библиотеки мутагенеза в пределах сегментов вдоль гена, а также использование ортогональных штрихкодов праймеров, чтобы пометить каждый сегмент для мультиплексирования и демультиплексирования библиотеки. Мы предполагаем, что этот протокол может быть легко применен к другим белкам, для которых соответствующий выбор с высокой пропускной способностью или экран был разработан.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Typtone | Research Products Intl. Corp. | T60060-1000.0 | |
| Yeast extract | Research Products Intl. Corp. | Y20020-500.0 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| Tetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | T7660-5G | |
| Petri plates | Corning | 351029 | |
| MATLAB | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ | |
| Oligonucleotide primers | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos | 25 nmol scale, standard desalting |
| pBR322_AvrII | available upon request | pBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene | |
| pBR322_OP1 – pBR322_OP5 | available upon request | five modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0491L | includes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer) |
| 15 ml conical tube | Corning | 430025 | |
| Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus) | Eppendorf | ||
| PCR plate, 96 well | Fisher Scientific | 14230232 | |
| 96 well plate seal | Excel Scientific | F-96-100 | |
| Veriti 96-well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
| 6x gel loading dye | New England Biolabs | B7024S | |
| Agarose | Research Products Intl. Corp. | 20090-500.0 | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | 161-0433 | |
| UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech) | Fotodyne Inc. | http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| 96-well black-walled, clear bottom assay plates | Corning | 3651 | |
| Lambda phage DNA | New England Biolabs | N3011S | |
| PicoGreen dsDNA reagent | Invitrogen | P7581 | dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4 |
| Victor 3 V microplate reader | PerkinElmer | ||
| DNA purification kit | Zymo Research | D4003 | |
| Microcentrifuge tubes | Corning | 3621 | |
| Long-wavelength UV illuminator | Fisher Scientific | FBUVLS-80 | |
| Agarose gel DNA extraction buffer | Zymo Research | D4001-1-100 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174L | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| EVB100 electrocompetent E. coli | Avidity | EVB100 | |
| Electroporator (E. coli Pulser) | Bio-Rad | 1652102 | |
| Electroporation cuvettes | Bio-Rad | 165-2089 | |
| Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro) | Amersham Biosciences | 80211237 | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| Plasmid purification kit | Macherey-Nagel | 740588.25 | |
| 8 well PCR strip tubes | Axygen | 321-10-551 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32854 | dsDNA quantitation reagent |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Ampicillin sodium salt | Akron Biotechnology | 50824296 | |
| MiSeq reagent kit v2 (500 cycles) | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq desktop sequencer | Illumina | http://www.illumina.com/systems/miseq.html | alternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform |
| FLASh software | John Hopkins University - open source | http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/ | software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data |
| AatII_F | GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC |
||
| AvrII_R | CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG |
||
| AvrII_F | CTTCATTTTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG |
||
| AatII_OP1_R | ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP2_R | ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP3_R | ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP4_R | ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC |
||
| AatII_OP5_R | ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC |
||
| OP1_F | GACCGGACAGTTGAAATACG | ||
| OP1_R | CGACGTACAGGACAATTTCC | ||
| OP2_F | ATTAGTACACTCCGTGAGCG | ||
| OP2_R | AGTATTAGGCGTCAAGGTCC | ||
| OP3_F | AGTCCCAAGTTCAGACGTAC | ||
| OP3_R | GAAAAGTCCCAATGAGTGCC | ||
| OP4_F | TCACTTGGTATCGAGAACGG | ||
| OP4_R | TATCACGGAAGGACTCAACG | ||
| OP5_F | AGATTGTTACTCCGACGGAC | ||
| OP5_R | TATAACAGGCTGCTGAGACC | ||
| Group1_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC |
||
| Group1_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC |
||
| Group2_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC |
||
| Group2_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG |
||
| Group3_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC |
||
| Group3_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC |
||
| Group4_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC |
||
| Group4_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC |
||
| Group5_F | ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC |
||
| Group5_R | GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG |
||
| 501_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 502_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACATAGAGGCACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 503_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC |
||
| 504_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 505_F | AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC |
||
| 701_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
||
| 702_R | CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG |
References
- Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
- Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
- Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
- Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
- Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
- Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
- Fowler, D. M., et al.
- Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
- McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
- Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
- Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
- Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
- Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
- Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
- Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
- Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
- Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
- Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
- Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
- Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).
