Функциональная характеристика регуляторных макрофагов, которые ингибируют трансплантат-реактивную иммунитет

Summary

Макрофаги представляют собой пластиковые клетки гемопоэтической системы, которые играют решающую роль в защитном иммунитете и гомеостазе. В этом отчете мы описываем оптимизированные методы in vitro для фенотипической и функциональной характеристики трансплантируемых регуляторных макрофагов, которые накапливаются в трансплантированном органе в условиях толерогенности.

Abstract

Накопление макрофагов в трансплантированных органах уже давно признано признаком отторжения аллотрансплантата ¹ . Иммуногенные моноциты проникают в аллотрансплантат рано после трансплантации, устанавливают реактивный ответ трансплантата против трансплантированного органа и инициируют отторжение органа. Недавние данные свидетельствуют о том, что подавляющие макрофаги облегчают успешную долгосрочную трансплантацию ³ и необходимы для индукции толерантности к трансплантации ⁴ . Это предполагает многомерную концепцию онтогенеза, активации и функции макрофагов, которая требует новой дорожной карты для изоляции и анализа функции макрофагов ⁵ . Из-за пластичности макрофагов необходимо предоставить методологию для выделения и характеристики макрофагов в зависимости от тканевой среды и определения их функций в соответствии с различными сценариями. Здесь мы descriБыть протоколом для иммунной характеристики привитых трансплантатом макрофагов и методов, которые мы использовали для функциональной оценки их способности ингибировать пролиферацию CD8 ⁺ T и стимулировать экспрессию CD4 ⁺ Foxp3 ⁺ Treg in vitro .

Introduction

В этом протоколе описаны методы in vitro для изучения функции тканепроникающих макрофагов, выделенных из аллотрансплантатов сердца, в соответствии с их способностью модулировать ответы Т-клеток. Широко описанные в литературе флуоресцентные клеточные следящие красители в сочетании с проточной цитометрией являются мощными инструментами для изучения супрессивной функции конкретных типов клеток in vitro и in vivo. Наш протокол следует методу карбоксифлуоресцеина сукцинимидина (CFSE) для контроля пролиферации лимфоцитов in vitro .

Когда клетка с мечеными CFSE делит, ее потомство получает половину числа молек....

Protocol

В этом исследовании мышей размещают в соответствии с руководящими принципами Департамента сельского хозяйства Соединенных Штатов и рекомендациями Руководства по обслуживанию и использованию лабораторных животных в Службе общественного здравоохранения. Все экспериментальные методы, связанные с использованием животных, проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Институтом по уходу за животными и утилизации (IACUC) в Медицинской школе горы Синай.

1. Подготовка средств массовой информации

1. Подготовьте полную среду RPMI 1640 с 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином (10000 U / мл) с использованием 2 мМ L-глутамина, ....

Results

Репрезентативные результаты показывают стратегию стробирования, описанную в вышеуказанном протоколе. Результаты также показывают анализ активности пролиферации Т-клеток после совместной культуры с трансплантирующими макрофагами. Подавляющая способность in vitro подмножеств макрофагов была проанализирована на рисунке 4 . Результаты показывают, что Ly6C ^lo Ly6G ^- макрофаги, полученные от терпимых реципиентов, являются подавляющими. Результаты.......

Discussion

Этот протокол описывает методы, которые мы использовали для иммуноанализа трансплантат-проникающих миелоидных подмножеств на экспериментальной мышиной модели трансплантации сердца, которая также применима к другим тканям в разных экспериментальных моделях мыши. Сортировка ячейки низкого давления при 20 psi была предпочтительным методом для выделения хорошего выхода чистых подмножеств клеток. Поддержание чистоты каждого миелоидного подмножества имеет решающее значение для установления убедительных результатов подавляющей.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 Media	Life Technologies	11875119
10% FBS	Life Technologies	26140-079
1,000x 2-меркаптоэтанол	Life Technologies	21985023
100x Pen/Strep	Life Technologies	15140122
100x L-глутамин	Life Technologies	25030081
100x Non Эфирные аминокислоты	Corning	25025039
1 М буфер HEPES	Corning	25060CL
100 мМ пируват натрия	ThermoScientific	SH30239.01
Пеницилин/стрептавидин	ThermoScientific	15140122
коллагене А	Рош	70381322
DPBS (без кальция и магний)	Corning	21031CV
70 &микро; m Клеточный фильтр	Fisher	22363548
ACK лизисный буфер	Life Technologies	A10492-01
DAPI	Sigma	32670-5mg-F
CFSE-FITC	Invitrogen	C34554
Dynabeads Мышиный активатор Т-клеток CD3/CD28	Life Technologies	11452D
96 well  U-образная нижняя пластина	Corning	353077
Антитела:
анти-Ly6C-APC	eBioscience	175932-80
анти-Ly6G-Pe/Cy7	Biolegend	127617
анти-CD11b-Percp/Cy5.5	eBioscience	45011282
анти-CD45-APC/Cy7	eBioscience	47045182
анти-CD4-APC	eBioscience	17004181
анти-CD8-P/Cy7	eBioscience	25008181
проточный цитометр LSRII	BD Bioscience
FACSDiva Software	BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J	Лаборатория Джексона	008374
C57BL/6	Лаборатория Джексона	000664
Balb/c	Лаборатория Джексона	000651