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Immunology and Infection

ग्रेगैट-रिएक्टिव इम्यूनिटी को रोकते हुए विनियामक मैक्रोफेज का कार्यात्मक लक्षण वर्णन

Published: June 7, 2017 doi: 10.3791/54242
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Department of Medicine, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Immunología de Trasplantes, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III

Summary

मैक्रोफेज हेमेटोपोएटिक प्रणाली की प्लास्टिक कोशिकाएं हैं जो सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा और होमोस्टैसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। इस रिपोर्ट में, हम इन विट्रो तकनीकों में प्रथितिक रूप से अनुकूलित और कार्यात्मक रूप से भ्रष्टाचार-घुसपैठ कर रहे विनियामक मैक्रोफेज का वर्णन करते हैं जो संक्रमित शर्तों के तहत प्रत्यारोपित अंग में जमा होते हैं।

Abstract

प्रत्यारोपित अंगों में मैक्रोफेज संचय लंबे समय से ऑलोग्राम अस्वीकृति 1 की एक विशेषता के रूप में मान्यता प्राप्त है। इम्यूनोजेनिक मोनोसाइट्स, ट्रांसप्लांटेशन के तुरंत बाद ऑलोग्राफ़्ट में घुसपैठ, प्रत्यारोपित अंग के खिलाफ एक भ्रष्टाचार प्रतिक्रियात्मक प्रतिक्रिया माउंट करता है और अंग अस्वीकृति 2 आरंभ करता है। हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि दबदबा मैक्रोफेज सफल दीर्घकालिक प्रत्यारोपण 3 की सुविधा देते हैं और ट्रांसप्लांटेशन सहिष्णुता 4 के शामिल होने के लिए आवश्यक हैं। यह मैक्रोफेज ऑनटोजनी, एक्टिवेशन और फ़ंक्शन की एक बहुआयामी अवधारणा का सुझाव देती है, जो मैक्रोफेज फ़ंक्शन 5 के अलगाव और विश्लेषण के लिए एक नया रोडमैप की मांग करता है। मैक्रोफेज के प्लास्टिसिटी के कारण, टिशू पर्यावरण पर निर्भर करते हुए मैक्रोफेज को अलग और रूपांतरित करने के लिए एक पद्धति प्रदान करना और विभिन्न परिदृश्यों के अनुसार अपने कार्यों को परिभाषित करना आवश्यक है। यहाँ, हम descriभ्रष्टाचार-घुसपैठ मैक्रोफेज के प्रतिरक्षा लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल और इन विधियों में हम सीडी 8 + टी प्रसार को रोकना और इन्हो में सीडी 4 + फॉक्सपेक्स + टे्रग विस्तार को बढ़ावा देने के लिए कार्यशील रूप से अपनी क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया।

Introduction

टी-सेल प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित करने की उनकी क्षमता के अनुसार, यह प्रोटोकॉल कार्डियक ऑलोग्राफ्ट से पृथक ऊतक-घुसपैठ मैक्रोफेज के कार्य का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो तकनीकों में वर्णित है। साहित्य में विस्तृत रूप से वर्णन किया गया है, प्रवाह कोशिका के साथ संयोजन में फ्लोरोसेंट सेल-ट्रैकिंग रंजक, इन विट्रो और विवो में विशिष्ट सेल प्रकार के दमनकारी फ़ंक्शन का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं । इन विट्रो में लिम्फोसाइट प्रोलीफ्रेशन की निगरानी के लिए हमारे प्रोटोकॉल कार्बोक्सीफ्लोरेससेन सुक्विनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई) विधि का अनुसरण करता है।

जब एक सीएफएसई-लेबल वाला सेल विभाजित होता है, तो उसकी संतान कार्बोक्सीफ्लोरेससिन-टैग अणुओं के आधे से ज्यादा संख्या प्राप्त करती है। प्रवाह कोशिकामितीय द्वारा सेल प्रतिदीप्ति में संबंधित कमी का उपयोग सेल डिवीज़न के आकलन के लिए किया जा सकता है, टी-सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को व्यवस्थित करने के लिए दबदबा मैक्रोफेज की क्षमता की निगरानी। चूंकि सीएफएसई एक फ्लोरोसिसिन आधारित डाई है, इसलिए यह ब्र के साथ संगत हैअन्य फ्लोरोरेमॉम्स की ओड रेंज, इसे बहु-रंग प्रवाह साइटोमेट्री पर लागू करते हैं। Phenotyping के लिए फ्लोरीरोमों की उचित पसंद भी अत्यधिक वर्णक्रमीय ओवरलैप और एंटीबॉडी पॉजिटिव कोशिकाओं को पहचानने में अक्षमता से महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से सीएफएसई 7 जैसी प्रोटीन डाईस के साथ।

वैकल्पिक तकनीकों पर फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करने के कई फायदे हैं जो सेल प्रसार को मापते हैं, जैसे थाइमिडाइन इनकॉर्पोरेशन परख, जो रेडियोलैबैड थिइमिडीन (टीडीआर) 8 का उपयोग करता है। यह परख त्रयीकृत थाइमिडीन ( 3 एच-टीडीआर) का उपयोग करता है जो कि mitotic कोशिका विभाजन के दौरान क्रोमोसोमल डीएनए के नए किस्में शामिल होता है। इस परख से जुड़े एक सुरक्षा संबंधी चिंता रेडियोसोटोपों का उपयोग है, क्योंकि सेल डिवीजन की सीमा निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं से पुनः प्राप्त डीएनए में रेडियोधर्मिता को मापने के लिए एक बिच्छू बीटा-काउंटर का उपयोग किया जाता है। मेथोडोलॉजिकल, ट्रिकीटेड थिमिडीन गधेएई पर्याप्त चिकित्सीय प्रयोगशाला बाधाओं जैसे कि कम संख्या में कोशिकाओं और धुंधला हो जाने के बाद देरी से विश्लेषण के लिए पर्याप्त लचीला नहीं है। इसके विपरीत, सीएफएसई धुंधला सेल प्रसार को रोकने के लिए और महत्वपूर्ण सक्रियण मार्करों जैसे कि सीडी 6 9 , एचएलए-डीआर और सीडी 25 9 में हस्तक्षेप करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, विभिन्न तरीकों को ट्रैक करने के लिए कई रंगों का प्रयोग किया जाता है, विशेष रूप से बहुरंगा अध्ययन में प्रत्येक पद्धति के फायदे और सीमाओं को समझना, सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।

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Protocol

इस अध्ययन में, चूहों को संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग के दिशानिर्देशों और प्रयोगशाला प्रयोगशालाओं के देखभाल और उपयोग के लिए सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा गाइड की सिफारिशों के अनुसार रखा गया है। पशु उपयोग से जुड़े सभी प्रायोगिक तकनीकों को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुसार प्रदर्शन किया गया - माउंट सिनाई स्कूल ऑफ मेडिसिन के अनुमोदित प्रोटोकॉल

1. मीडिया तैयारी

  1. 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 1 एमएम सोडियम पायरेवेट, 0.1 एमएम गैर-अम्ल अमीनो एसिड, 5 एमएम HEPES, और 0.05 एमएम 2 का उपयोग करके पूर्ण आरपीएमआई 1640 मध्यम 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 यू / एमएल) के साथ तैयार करें -mercaptoethanol।

2. ऑलोग्राफ्ट अलगाव और एकल-सेल निलंबन

नोट: फुफ्फुसीय धमनी के प्रत्यारोपण और एनास्टोमोसिस तकनीक और अवर अवरुद्ध कैव को शुरू में Corry और सहयोगियों द्वारा वर्णित किया गया था और लियू और कांग में देखा जा सकता हैS = "xref"> 10 , 11 ( चित्रा 1 ए )।

  1. एक प्रेरण कक्ष में 4-5% isoflurane के साथ एक प्रत्यारोपित माउस anesthetize। ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इसे बलिदान करें
  2. मानक कैंची के साथ एक मिडलाइन पेट की चीई बनाएं और महाधमनी को स्थानीय बनाने के लिए पेट की सामग्रियों को हटा दें।
    नोट: प्रत्यारोपित हृदय प्राप्तकर्ता पेट की महाधमनी ( चित्रा 1 बी ) के दायीं ओर होगा।
  3. भ्रष्टाचार को धीरे से ठीक-ठीक दांत संदंश का उपयोग करके इसे तुरंत बर्फ-ठंडा आरपीएमआई माध्यम में रखें।
    नोट: महाधमनी से भ्रष्टाचार को अलग करने के लिए एक सर्जरी कैंची का उपयोग भ्रष्टाचार को नुकसान पहुंचा सकता है और कुछ ऊतकों को प्राप्तकर्ता के पालन के लिए बने रहना पड़ता है।
  4. सभी ग्राफ्ट एकत्र किए जाने के बाद, उन्हें टिशू प्रोसेसिंग के लिए बाँझ संस्कृति के हुड में ले जाएं। पेट्री डिश में भ्रष्टाचार रखें और ऊतक को छोटे टुकड़ों (1 मिमी) में बाँझ, कुंद, सूक्ष्म शल्यचिकित्सा का उपयोग करें।
  5. तेज दांतों के साथईपीएस, 5 मिलीलीटर कोलेजनज़ ए (0.1 एमजी / एमएल कोलेजनज़ बाँझ 1x पीबीएस में) के साथ टुकड़ों को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। इसे 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. कोलाजेज़ेज को बेअसर करने के लिए आरपीएमआई माध्यम के 5 एमएल जोड़ें और 1 एमएल सिरिंज के सवार की मदद से 100 माइक्रोग्राम झरनी के माध्यम से नमूना स्थानांतरण करें।
  7. नमूना नीचे 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 xg पर स्पिन करें
  8. 1 एमएल ऑफ एसीके लिसन बफर में गोली को फिर से खोलें। अच्छी तरह मिक्स करें और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक सेवन करें।
  9. एलसीएस बफर को बेअसर करने के लिए आरपीएमआई माध्यम के 1 एमएल को जोड़ें और नमूना को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 एम के लिए 400 एक्सजी पर नीचे स्पिन करें
  10. आरपीएमआई माध्यम के 200 μL में सेल गोली resuspend और इसे 5 एमएल पॉलीप्रॉपिलिन गोल नीचे ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
    नोट: पॉलीप्रोपीलेन ट्यूब, कम पालन का समर्थन करते हैं। इसके अलावा, कम तापमान पर कोशिकाओं को बनाए रखने, जैसे 4 डिग्री सेल्सियस, आसंजन कम कर देता है।

3. प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्ट का उपयोग ग्राफ्ट-घुसपैठ मैक्रोफेज का अलगावआईएनजी

  1. एमएबी (चूहे विरोधी माउस सीडी 16/32) एफसी रिसेप्टर ब्लॉकिंग का उपयोग करके मैलाइड कोशिकाओं पर अवांछित विशिष्ट बंधन को अवरोधित करें। प्रति नमूना 1-2 μL जोड़ें, सतह धुंधला होने से 15 मिनट पहले।
  2. विरोधी माउस CD11b Percp / Cy5.5 (RPMI माध्यम में 0.6 माइक्रोग्राम / μL अंतिम एकाग्रता), विरोधी माउस सीडी 45 एपीसी / ईफ्लोर्यू 780 (0.6 माइक्रोग्राम / μL), एंटी-माउस लीलिया एपीसी (2 माइक्रोग्राम / μL) के साथ दाग, और विरोधी माउस Ly6G Pe / Cy7 (2 माइक्रोग्राम / μL)। प्रकाश से फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की रक्षा के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ ट्यूबों को कवर करें और 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में ट्यूबों को सेते।
    नोट: एकल दाग मुआवजे के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब (कोई दाग) तैयार न करें और ट्यूबों को प्रत्येक फ्लोरोरेम्रोम के साथ अकेले लेबल के रूप में चिह्नित करें। गेट की स्थापना में सहायता के लिए, आइसोटाइप नियंत्रण विशेष रूप से ली 6 सी (आईजीजी 2 ए) और ली 6 जी (आईजीजी 2 बी) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. कोशिकाओं को आरपीएमआई माध्यम से दो बार धोएं और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 एक्सजी पर स्पिन करें। Trypan नीले और एक hemocytomete का उपयोग कर कोशिकाओं की गणनाआर और आरपीएमआई मध्यम प्रति 1 x 10 6 कोशिकाओं के 1 एमएल में उन्हें पतला। सॉर्ट करने से पहले, 5 एमएल, 70 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर ट्यूब कैप के माध्यम से नमूनों को स्थानांतरित करें। डीएपीआई (1 माइक्रोग्राम / एमएल) को सेल व्यवहार्यता मार्कर के रूप में जोड़ें और सॉर्ट करने के लिए आगे बढ़ें।
  4. क्योंकि मैक्रोफेज संवेदनशील और नाजुक कोशिकाएं हैं, सॉर्ट स्थितियों को 20 पीएसआई में सेट करें और एक 4-रास्ता शुद्धता मोड का उपयोग करके मैक्रोफेज को अलग करने के लिए 100 माइक्रोन नोजल आकार का उपयोग करें।
  5. 5 एमएल पॉलीप्रॉपलीन ट्यूब में आरपीएमआई माध्यम के 1 एमएल के साथ संग्रह ट्यूब तैयार करें।
  6. सॉर्टर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, नए प्रयोग को खोलें और सेटिंग्स को परिभाषित करने के लिए खाली पैनल के साथ खाली प्रयोग का चयन करें।
  7. एक डॉट प्लॉट सेट करें जो कि आगे की ओर (एफएससी) बनाम ( बनाम ) साइड स्कैटर (एसएससी) और सभी ल्यूकोसाइट्स पर फाटक को प्रदर्शित करता है, मलबे को छोड़कर और निम्न तरफ और साइड स्कैटर के साथ क्लंप इस माता-पिता के द्वार से, एक नई डॉट साजिश बनाओ जो कि एसएससी बनाम डीएपीआई और डीएपीआई कोशिकाओं पर गेट दिखाती है।
    1. इस नवगठित आबादी पर विज्ञापन बनाएंओ.टी. प्लॉट जो सीडी 11 बी बनाम सीडी 45 को दिखाती है और डबल पॉजिटिव (सीडी 11 बी + सीडी 45 + ) मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल पर गेट दिखाती है।
    2. यहां से, Ly6C बनाम Ly6G और गेट वांछनीय आबादी प्रदर्शित करने वाली एक अंतिम डॉट प्लॉट बनाएं: Ly6C हाय ली 6 जी - , ली 6 सी लो ली 6 जी - , और ली 6 सी इंट लि 6 जी + ( चित्रा 2 )।
  8. छंटाई के बाद, शुद्धता और सेल व्यवहार्यता (> 90%) के लिए जांचें और संग्रह ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 xg पर स्पिन करें ट्रिपैन नीली और एक हीमोसाइटेटोमीटर के उपयोग से कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें पूरे आरपीएमआई माध्यम में वांछित एकाग्रता ( जैसे 1 x 10 6 मैक्रोफेज / एमएल) पर पुन: resuspend।
  9. प्लेट के 50 एक्स 10 3 मैक्रोफेज प्रति 9 8 अच्छी तरह से गोल-नीचे की थाली में पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के 100 μL के अंतिम मात्रा के साथ। कम से कम 24 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 के लिए बिना सोखने वाली कोशिकाओं को छोड़ दें।

4. अलगावप्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग का उपयोग कर टी कोशिकाओं के एन

नोट: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn एक X- लिंक किए गए लक्ष्यित दस्तक-इन माउस तनाव है जो कोशिकाएं फोकस (फोर्कप्ड बॉक्स पी 3) जीनोम को मोनोमेरिक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एमआरएफपी) के साथ व्यक्त करते हैं।

  1. पहले चरण 2.1 में बताए गए अनुसार C57BL / 6 और C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) चूहों को संज्ञाहरण और बलिदान करना। प्लीहा और लिम्फ नोड्स को अलग करें (एलएन: इंजीनल, लम्बर, एक्सेलर, ब्रेचियल और ग्रीवा) और तेजी से उन्हें बर्फ-ठंड आरपीएमआई माध्यम में रखें।
  2. एलएन को अलग करने के लिए, माउस को लापरवाह स्थिति में रखें, नीचे से ऊपर से एक मिनीलाइन त्वचा चीरा बनायें, सावधानीपूर्वक पेरिटोनियम काटने और धीरे-धीरे त्वचा को फैलाने से अलग करें एक बार सभी कंसीय, काठ, एक्सीलरी, ब्रेचियल और ग्रीवा एलएन एकत्र किए जाते हैं ( चित्रा 1 सी , लाल रंग में रंग), पेरिटोनियम में कटौती और आंत के ऊपरी बाएं तरफ प्लीहा को अलग करना।
  3. रखा एक 100 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग तिल्ली और एलएन को अलग करें50 एमएल ट्यूब के ऊपर 1-एमएल सिरिंज के सवार का प्रयोग करके, ऊतक को धीरे से दबाएं। आरपीएमआई माध्यम के साथ फिल्टर को कुल्ला करें जितना बार जब तक यह साफ न हो जाए।
    नोट: प्रत्येक माउस से एलएन और तिल्ली एक साथ एक ही ट्यूब में जमा किया जा सकता है।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 xg पर स्पिन करें
  5. 2 एमएल ऑफ एसीके लिसन बफर में गोली को फिर से खोलें। अच्छी तरह मिक्स करें और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस तक सेवन करें।
  6. Lysis बफर को बेअसर करने के लिए आरपीएमआई माध्यम के 2 एमएल जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 xg पर स्पिन करें
  7. आरपीएमआई माध्यम के 200 μL में सेल गोली resuspend और एक 5 एमएल पॉलीस्टायिन दौर नीचे ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
  8. विरोधी माउस सीडी 4 एपीसी (0.6 माइक्रोग्राम / μL) और / या एंटी-माउस सीडी 8 पेसीयू 7 (2 माइक्रोग्राम / μL) के लिए दाग। प्रकाश से फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी की रक्षा के लिए ट्यूबों को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें और 45 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रेफ्रिजरेटर में ट्यूबों को सेते।
    नोट: एकल दाग क्षतिपूर्ति के लिए, एक नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब (कोई दाग) और तैयार करेंप्रत्येक फ्लोरोरेमॉम के साथ अकेले लेबल वाले कोशिकाओं के साथ ट्यूब
  9. कोशिकाओं को आरपीएमआई माध्यम से दो बार धोएं और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 एक्सजी पर स्पिन करें। ट्रांस्पैन नीली और एक हीमोसाइटेटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: सीएफएसईई डाई को कार्बोक्सीफ्लोरेससेन डिसासेट सुक्सिमिनिडाइल एस्टर पाउडर के रूप में 50 ग्राम में प्रदान किया जाता है। सीएफएसई के शीश में 18 एमएल डीएमएसओ को 5 मिमी के अंतिम स्टॉक समाधान के लिए जोड़ें और कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  10. सीएफएसई लेबलिंग के लिए, स्टॉक समाधान से 5 माइक्रोन सीएफएसई के अंतिम कामकाज एकाग्रता में पीबीएस में प्रति एमएल तक 10 से 6 कोशिकाओं की एकाग्रता में सीडी 8 स्टेन्ड कोशिकाओं को पुन: resuspend। 5 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर एक स्नान में उन्हें सेते हैं जैसा कि पहले 6 वर्णित है।
    नोट: (गंभीर चरण) कम एकाग्रता (≤ 10 6 एमएल) पर कोशिकाओं के लिए, यह आवश्यक है कि कोशिकाओं को सीएफएसई के विषाक्त प्रभाव को बफर करने के लिए अतिरिक्त प्रोटीन की उपस्थिति में लेबल किया जाना चाहिए। इसलिए, पीबीएस 5% FBS हो सकता है ध्यान दें कि यदि मुझेडीआईएम का इस्तेमाल किया जाता है, मुफ्त एमिनो एसिड CFSE के लिए प्रतिस्पर्धा करके लेबलिंग दक्षता को कम कर सकता है।
  11. आरपीएमआई माध्यम के 2 एमएल के साथ CFSE को बेअसर करना 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 xg पर स्पिन प्रत्येक 1 x 10 6 सीडी 8 टी कोशिकाओं में आरपीएमआई माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
  12. सॉर्ट करने से पहले, नमूना को 5 एमएल ट्यूब कैप पर 70 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर के माध्यम से ट्रांसफर कर दें। एक सेल व्यवहार्यता मार्कर के रूप में 50 μL 1x डीएपीआई (1 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें और सॉर्टिंग के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: 1x का मतलब अभिप्राय का 1: 1 अनुपात अन्य घटकों के संबंध में है।
  13. डबल पॉजिटिव सीडी 8 + सीएफएसई + टी कोशिकाओं ( चित्रा 3 ए ) को अलग करने के लिए 20 पीएसआई और 100 माइक्रोन नोजल आकार पर सॉर्ट की शर्तें निर्धारित करें।
  14. 5 एमएल पॉलीप्रोपीलेन ट्यूब में आरपीएमआई माध्यम के 1 एमएल के साथ संग्रह ट्यूब तैयार करें और सॉर्ट करें।
  15. सॉर्टर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, नए प्रयोग को खोलें और सेटिंग्स को परिभाषित करने के लिए खाली पैनल के साथ खाली प्रयोग का चयन करें।
  16. सीडी 4 + टी सेल अलगाव के लिए, एक डॉट प्लॉट स्थापित करें जो कि डीआईएसडेस्कर के साथ-साथ बड़े दानेदार कोशिकाओं को छोड़कर एफसीसी बनाम एसएससी और लिम्फोसाइटों पर गेट खेलता है, जैसे वृक्ष के समान कोशिकाएं
    1. इस माता-पिता के द्वार से, एक नई डॉट प्लॉट बनाओ जो कि एसएससी बनाम डीएपीआई और डीएपीआई कोशिकाओं पर गेट दिखाता है।
    2. इस नवगठित आबादी पर, एक डॉट प्लॉट बनाएं जो कि सभी सीडी 4 + कोशिकाओं ( चित्रा 3 बी ) को अलग करने के लिए एसएससी बनाम सीडी 4 प्रदर्शित करता है। वैकल्पिक रूप से, एक विरोधी सीडी 3 एमएबी शुद्ध टी सेल आबादी के अलगाव को सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: सभी सीडी 4 + टी कोशिकाओं (5-10%) का एक छोटा अंश फॉक्सपेन + एमआरएफपी + + होना चाहिए।
  17. छंटाई के बाद, शुद्धता और सेल व्यवहार्यता (> 90%) के लिए जांचें और संग्रह ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 xg पर स्पिन करें ट्रांस्पैन नीली और एक हीमोसाइटेटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें। प्रति 2x10 6 टी कोशिकाओं के लिए पूर्ण आरपीएमआई माध्यम का 1 एमएल का उपयोग करके पुन: Respend
  18. पहले-सॉर्टेड मैक्रोफेज के साथ टी कोशिकाओं को संवर्धन करके दमन परख सेट करें। प्लेट 10 x 10 4 सीडी4 + टी और 10 एक्स 10 4 सीडी 8 + सीएफएसई + टी कोशिकाओं को एक ही अच्छी तरह से 100 एमएल के पूर्ण आरपीएमआई माध्यम के अंतिम मात्रा में। 96 डिग्री सेल्सियस के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 सेते हैं।
    नोट: मैक्रोफेज और टी कोशिकाओं का उपयोग 1: 4 अनुपात में किया गया था
  19. एजाइड युक्त बफर को साफ़ करने के लिए उन्हें प्रयोग करने से पहले 2 एमएल पीबीएस में टी कोशिका-उत्प्रेरक सीडी 3 / सीडी 28 चुंबकीय मोतियों को धोकर टी सेल डिवाइजन को उत्तेजित करें। माउस टी कोशिका-उत्प्रेरक सीडी 3 / सीडी 28 मोतियों की 5 μL प्रति अच्छी तरह से जोड़ें।
    नोट: मैग्नेटिक मोती एंटीजन-पेश करने वाली कोशिकाओं के आकार के समान हैं और टी-सीडी 3 और एंटी-सीडी 28 एमएबी के साथ जुड़ जाती हैं, टी कोशिकाओं के सक्रियण और विस्तार के लिए एक सरल विधि प्रदान करते हैं।

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम उपरोक्त प्रोटोकॉल में वर्णित गेटिंग रणनीति दिखाते हैं। परिणाम भ्रष्टाचार-घुसपैठ की मैक्रोफेज के साथ सह-संस्कृति के बाद टी-सेल प्रसार गतिविधि का विश्लेषण भी प्रदर्शित करते हैं। चित्रा 4 में मैक्रोफेज सबसेट का इन विट्रो दबाने वाली क्षमता का विश्लेषण किया गया था। परिणाम बताते हैं कि Ly6C लो Ly6G - संतोषित प्राप्तकर्ताओं से प्राप्त मैक्रोफेज दबाने वाली हैं। परिणाम यह भी इंगित करते हैं कि Ly6C इंट लि 6 जी + कोशिकाएं एक साधारण दबाने वाली क्षमता प्रदर्शित करती हैं। केवल ली 6 सी लो ली 6 जी - कोशिकाओं ने इन विट्रो में सीडी 4 + फॉक्सपेक्स + टेग के विस्तार को बढ़ावा दिया। साथ में, डेटा निष्कर्ष का समर्थन करता है कि भ्रष्टाचार-घुसपैठ CD11b + ली 6 सी लो ली 6 जी - मैक्रोफेज में कई गुण हैं जो मोनोसाइट-व्युत्पन्न सोधी कोशिकाओं 12 के साथ जुड़े हुए हैंसीडी 8 टी-सेल प्रसार 13 को रोकना और CD4 + Foxp3 + Treg विस्तार 14 को प्रोत्साहित करने की उनकी क्षमता पर विचार करना।

आकृति 1
चित्रा 1: पशु मॉडल ( ए ) बाल्क / सी दिल (एच 2 डी) को पूरी तरह से एलोोजेनीक सी 57 बीएल / 6 (एच 2-बी) में ट्रांसप्लांट किया गया था जैसा कि पहले 10 वर्णित है। प्राप्तकर्ता की कावा शिरा और दाह की फुफ्फुसीय धमनी और आरोही महाधमनी के साथ पेट की महाधमनी के अनुस्फुरण, को दिखाया गया है। प्राप्तकर्ता चूहों को 250 μg एंटी-सीडी40एल एमएबी (क्लोन एमआर 1) के साथ दिन 0, 2 और 4 पर सहिष्णुता के लिए इस्तेमाल किया गया था, जैसा हमने हाल ही में 4 में बताया था। गैस्ट्रैक्ट फ़ंक्शन को हर दूसरे दिन पेट की टहनी से मॉनिटर किया गया था। अस्वीकृति को एक स्पष्ट दिल की धड़कन की पूरी समाप्ति के रूप में परिभाषित किया गया था और प्रत्यक्ष दृश्य द्वारा इसकी पुष्टि की गई थी laparotomy। ( बी ) प्रतिनिधि छवि और ( सी ) एलएन और प्लीहा (लाल रंग में) और ऑलोग्राफ़्ट (बैंगनी रंग में) के शारीरिक स्थान का चित्रण इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: मैक्रोफेज सॉर्टिंग रणनीति ऊपरी बाएं से शुरू होने से, ल्यूकोसाइट्स पहले आकार के द्वारा गेट किए जाते हैं, और फिर गाना कोशिकाओं को मलबे और clumps से भेदभाव किया जाता है। एकल से, मृत कोशिकाओं को डीएपीआई नकारात्मक अंश पर गेटिंग शामिल नहीं किया जाता है। लाइव कोशिकाओं से, सीडी 45 + सीडी 11 बी + का उपयोग मायलोयॉइड कोशिकाओं को पहचानने के लिए किया जाता है। लिय 6 सी और ली 6 जी की अभिव्यक्ति के आधार पर तीन मायलोइड कोशिकाओं की आबादी आगे की पहचान की गई है।= "_ Blank"> कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: लिम्फोसाइट सॉर्टिंग रणनीति लिम्फोसाइट सॉर्टिंग रणनीति के लिए प्रतिनिधि प्रवाह साइटमैट्री परिणाम। ऊपरी बाएं से आगे और साइड स्कैटर के अनुसार लिम्फोसाइट जनसंख्या पर गेट। मलबे और clumps को छोड़ दें सिंगलट्स से, डीएपीआई नकारात्मक अंश पर गेटिंग द्वारा मृत कोशिकाओं को बाहर रखा गया है लाइव कोशिकाओं से, ( ए ) सीडी 8 + सीएफएसई + डबल-पॉजिटिव कोशिकाएं और ( बी ) सभी सीडी 4 + टी कोशिकाएं, जिनमें फॉक्सपेक्स + पॉजिटिव सेल के अंश होते हैं, इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4 चित्रा 4: दमन परख। ( ए ) प्रत्येक मायोलॉइड सबसेट के इन विट्रो दबाने वाली क्षमता में सीडी 8 + टी-सेल प्रसार को सीईएफएसई कमजोर पड़ने पर निगरानी रखी गई थी जिसमें मैलॉइड सबसेट के साथ सह-संस्कृति के 96 घंटे थे। ( बी ) प्रत्येक मायलोइड सबसेट का इन विट्रो टे्रग विस्तार में। मैलॉइड सबसेट के साथ सह संस्कृति के 96 घंटे के बाद सीडी 4 + टी कोशिकाओं पर फोकस एक्सपी के फ्लो साइटमैट्री विश्लेषण। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यह प्रोटोकॉल उन तरीकों का वर्णन करता है जो हम हृदय प्रत्यारोपण के एक प्रयोगात्मक मूरीन मॉडल में भ्रष्टाचार-घुसपैठ वाले मायलोयॉइड सेल सबसेट को अनियंत्रित करते थे, जो कि अलग-अलग मुरीइन प्रयोगात्मक मॉडल में अन्य ऊतकों पर भी लागू होता है। शुद्ध कोशिका सबसेट्स की अच्छी उपज को अलग करने के लिए 20 पीएसआई में कम-दबाव वाले सेल वर्गीकरण को प्राथमिकता दी गई थी। विभिन्न मायलोयॉइड आबादी के बीच दबाने वाली क्षमता के निर्णायक परिणामों को स्थापित करने के लिए प्रत्येक माइलॉइड सबसेट की शुद्धता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। हालांकि, विभिन्न तरीकों का इस्तेमाल विभिन्न ल्यूकोसाइट आबादी के अलगाव के लिए किया जा सकता है, जैसे वाणिज्यिक संवर्धन किट। ब्याज की सेल आबादी के बावजूद, इष्टतम सतह धुंधला और प्रवाह cytometry परिणामों के लिए प्रत्यारोपित ऊतक से व्यवहार्य एकल-सेल निलंबन प्राप्त करना आवश्यक है। गलत ऊतक हेरफेर सेल का नुकसान हो सकता है और इसलिए मैलॉइड सबसेट का एक कम उपज। उपज बढ़ाने के लिए, नमूना यू पर कार्रवाई सुनिश्चित करेंठंडे बफ़र्स गाओ और कम सेल के पालन (पॉलीप्रोपीलीन ट्यूबों) वाले कंटेनरों में कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए। इस प्रोटोकॉल में, हम सी। हिस्टोलिटिकम से कोलेजनज़ ए का उपयोग करते थे , जो कि कई प्रकार के ऊतकों ( उदा। , फेफड़े, हृदय, मांसपेशियों, हड्डी, वसा, यकृत, गुर्दा, उपास्थि, स्तन ग्रंथि, प्लेसेंटा, रक्त) की असंगति के लिए व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। पोत, मस्तिष्क, और ट्यूमर)। सॉर्टिंग करते समय कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए, एंटीबॉडी का अनुकूलन करना और एक कुशल गेटिंग रणनीति बनाने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल में, हमने CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, ली 6 सी / एपीसी, और ली 6 जी पे / साइ -7 फ्लोरोसेंट-संयुग्मित एंटीबॉडी और फ्लो साइटोमेट्री का इस्तेमाल करते हुए मूरीन मैक्रोफेज का वर्णन किया है। चूंकि ल्यू 6 सी / जी एपोटोप्स इंसान में मौजूद नहीं हैं, इसलिए मानव मैलॉयड कोशिकाओं को क्रमबद्ध करने के लिए सीडी 14 / सीडी 15 / सीडी 16 का इस्तेमाल करना आवश्यक है।

बहुरंगा प्रवाह cytometry विश्लेषण में, चयनित fluorochromes के संभावित वर्णक्रमीय ओवरलैप हो सकता है। इसलिए, जैसा कि विख्यात बीफ़ोपुनः, एकल-दाग मुआवजा अतिव्यापी मुद्दों से बचने के लिए बहुत उपयोगी हैं। इसके अलावा, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम करने और इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए एंटीबॉडी अनुरेखण की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण विचार व्यवहार्यता रंजक का उपयोग है। इस प्रोटोकॉल में, डीएपीआई को व्यवहार्यता डाई के रूप में प्रयोग किया जाता है। डीएपीआई (4 ', 6-डायरिडिनो-2-फेनिलंडोल) एक ब्लू फ्लोरोसेंट डेन है जो डीएनए में एटी अमीर क्षेत्रों के लिए दृढ़ता से बांधता है। डीएपीआई को डीएनए के लिए अधिकतम उत्तेजना 358 एनएम है, और अधिकतम उत्सर्जन 461 एनएम है। प्रोटोकॉल के अनुसार प्रयोग किया जाता है, डीएपीआई विशेष रूप से नाभिक दागता है, प्रवाह विश्लेषण में मृत कोशिकाओं को छोड़कर, बहुत कम या कोई साइटोप्लास्मिक लेबलिंग नहीं करता है। हालांकि, चुना गया एंटीबॉडी के पैनल के आधार पर, अन्य व्यावहारिकता रंगों, जैसे कि 7-अमीनोएक्टिनोमायसीन डी (7-एएडी) और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) का उपयोग किया जा सकता है। सटीक मृत-सेल बहिष्कार और लाइव-सेल पहचान एक महत्वपूर्ण शर्त है जो इन विट्रो टी कोशिकाओं में सफलतापूर्वक निगरानी रखती है, क्योंकि यह महत्व हैतांत के पास प्रक्रियाएं हैं जो सेल व्यवहार्यता और फ़ंक्शन के लिए न्यूनतम विघटन के साथ लिम्फोसाइट प्रसार का अनुसरण कर सकते हैं।

जैसा कि ऊपर बताया गया है, सेल लेबलिंग और प्रसार के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं जैसे सीएफ़सीई जैसे सेल ट्रैकिंग डाईज़ के साथ। साहित्य में वर्णित उदाहरण के रूप में, सीएफएसई 16 का उपयोग करते हुए एकसमान वितरण प्राप्त करने और अलग-अलग बेटी चोटियों को प्राप्त करने के लिए मृत / मरते हुए कोशिकाओं को बहिष्कृत करने के लिए सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए। धुंधला पैनलों के आधार पर चुनने के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल ट्रैकिंग रंजक हैं सेल ट्रैकिंग रंगों के विकल्प के रूप में, कैमिस्ट्री अध्ययन 13 , 14 में लिम्फोसाइट्स और अन्य कोशिकाओं के प्रसार के मूल्यांकन के लिए थाइमिडाइन टाइटेनेटेड परख किया जाता है। थिइमिडीन शामिल प्रोटोकॉल रेडियोलैब्लेड 3 एच- या 14 सी-थिइमाइडिन के माप से सेल डिवीजन के दौरान डीएनए की प्रतिकृति का आकलन करते हैं। हालांकि यह विधि मैंहै काफी संवेदनशील और अच्छी तरह से स्थापित, thymidine titrated तकनीक के लिए प्रमुख नुकसान यह है कि यह रेडियोधर्मी शामिल है और एक सेल स्तर पर जानकारी प्रदान नहीं करता है दूसरी ओर, सीएफएसई फ्लो साइटमैट्री विश्लेषण लिम्फोसाइट के सबसेटों का जवाब देने के बारे में स्पष्ट जानकारी प्रदान करता है और इसमें कम अंतर और अंतःस्रावी परिवर्तनशीलता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम माउंट सिनाई में रिसर्च एक्सलंस के फ्लो साइटोमेट्री, माइक्रोस्कोरी और बायो-रिपॉजिटरी / पैथोलॉजी सेंटर के तकनीकी योगदान को स्वीकार करते हैं। यह कार्य COST एक्शन बीएम -1305 द्वारा समर्थित था: सेल टूलेरोजेनिक चिकित्सा (एक तथ्य), माउंट सिनाई रिकानती / मिलर ट्रांसप्लांटेशन इंस्टीट्यूट डेवलपमेंट फंड, फोकस और एक्सेरेट करने के लिए एक्शन, सेमिनियो डी सिएन्सिया ए इनोवेशन एसएएफ 2013-48834-आर और एसएएफ2016-80031-आर JO

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
10% FBS Life Technologies 26140-079
1,000x 2-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
100x Pen/Strep Life Technologies 15140122
100x L-glutamine Life Technologies 25030081
100x Non Esential amino acids Corning 25025039
1 M HEPES buffer  Corning 25060CL
100 mM Sodium Pyruvate ThermoScientific SH30239.01
Penicilin/Streptavidyn ThermoScientific 15140122
Collagenese A Roche 70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium) Corning 21031CV
70 µm Cell strainer Fisher 22363548
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01
DAPI Sigma 32670-5mg-F
CFSE-FITC Invitrogen C34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 Life Technologies 11452D
96 well  U-bottom plate Corning 353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APC eBioscience 175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7 Biolegend 127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5 eBioscience 45011282
anti-CD45-APC/Cy7 eBioscience 47045182
anti-CD4-APC eBioscience 17004181
anti-CD8-P/ Cy7 eBioscience 25008181
LSRII Flow Cytometer BD Bioscience
FACSDiva Software BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J  The Jackson Laboratory 008374
C57BL/6 The Jackson Laboratory 000664
Balb/c The Jackson Laboratory 000651

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 124 विनियामक मैक्रोफेज ऑलोग्राफ़्ट इम्यून सहिष्णुता प्रत्यारोपण कॉस्मिमुलेटरी नाकाबंदी दमन एटे।
ग्रेगैट-रिएक्टिव इम्यूनिटी को रोकते हुए विनियामक मैक्रोफेज का कार्यात्मक लक्षण वर्णन
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Ochando, J., Conde, P. Functional… More

Ochando, J., Conde, P. Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity. J. Vis. Exp. (124), e54242, doi:10.3791/54242 (2017).

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