Summary
Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.
Abstract
Macrofage accumulatie in getransplanteerde organen is al lang herkend als een kenmerk van allograft afwijzing 1 . Immunogene monocyten infiltreren de allotransplantatie vroeg na transplantatie, bevestig een transplantaatreactieve reactie tegen het getransplanteerde orgaan en start orgaanafstoting 2 . Recente gegevens suggereren dat onderdrukkende macrofagen succesvolle langetermijntransplantatie 3 vergemakkelijken en nodig zijn voor de inductie van transplantatietolerantie 4 . Dit suggereert een multidimensionaal concept van macrofage ontogenie, activatie en functie, die een nieuwe routekaart vereist voor de isolatie en analyse van macrofage functie 5 . Vanwege de plasticiteit van macrofagen is het nodig een methode te geven om macrofagen te isoleren en te karakteriseren, afhankelijk van de weefselomgeving, en om hun functies te definiëren volgens verschillende scenario's. Hier worden we beschrevenEen protocol voor immuun karakterisering van transfusie-infiltrerende macrofagen en de methoden die we functioneerden om hun capaciteit te evalueren om CD8 + T proliferatie te remmen en om de groei van CD4 + Foxp3 + Treg in vitro te bevorderen.
Introduction
Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de functie van weefsel-infiltrerende macrofagen die geïsoleerd zijn van cardiale allografen te bestuderen, volgens hun vermogen om T-cel responsen te moduleren. In de literatuur worden fluorescerende celopsporingskleurstoffen in combinatie met flowcytometrie beschreven, krachtige hulpmiddelen om de onderdrukkende functie van specifieke celsoorten in vitro en in vivo te bestuderen . Ons protocol volgt de carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) methode voor het monitoren van lymfocyt proliferatie in vitro .
Wanneer een CFSE-gemarkeerde cel verdeelt, verwerft zijn nageslacht het halve aantal carboxyfluoresceïne-gelabelde moleculen 6 . De bijbehorende afname in celfluorescentie door flowcytometrie kan worden gebruikt om celverdeling te beoordelen, de capaciteit van onderdrukkende macrofagen te monitoren om T-cel immuunresponsen te moduleren. Aangezien CFSE een fluoresceïne-gebaseerde kleurstof is, is het compatibel met een brOad reeks van andere fluorochromen, waardoor het van toepassing is op multi-color flow cytometry. De juiste keuze van fluorochromen voor fenotyping is ook belangrijk om overmatige spectrale overlap te vermijden en het onvermogen om antilichaam-positieve cellen te herkennen, met name met zichtbare proteïne kleurstoffen zoals CFSE 7 .
Er zijn vele voordelen van het gebruik van fluorescerende kleurstoffen over alternatieve technieken die cel proliferatie meten, zoals de thymidine incorporation assay, die radioactief gelabelde thymidine (TdR) 8 gebruikt . Deze bepaling maakt gebruik van tritiated thymidine ( 3 H-TdR) die in de nieuwe strengen van chromosomaal DNA is opgenomen tijdens de mitotische celdeling. Een veiligheidsprobleem in verband met deze analyse is het gebruik van radio-isotopen, aangezien een scintillatie-beta-teller gebruikt wordt om de radioactiviteit te meten in DNA die uit de cellen is hersteld om de mate van celverdeling te bepalen. Methodologisch, de tritiated thymidine assAy is niet flexibel genoeg om belangrijke klinische laboratorium beperkingen aan te passen, zoals een laag aantal cellen en vertraagde analyse na kleuring. Integendeel, CFSE-kleuring is aangetoond dat cel proliferatie voorkomt en interfereren met kritische activatie markers, zoals CD69, HLA-DR en CD25 9 . Daarom begrijpen de voordelen en beperkingen van elke methodologie, met name in multicolor studies waarbij meerdere kleurstoffen worden gebruikt om verschillende celtypes te volgen, om kritische en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In deze studie zijn muizen gehuisvest in overeenstemming met de richtlijnen van de Verenigde Staten van Landbouw en de aanbevelingen van de Public Health Service Guide voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. Alle experimentele technieken met betrekking tot dierlijk gebruik werden uitgevoerd in overeenstemming met de protocols van de Sinai School of Medicine van de Instituut voor Dierenartsen en Inrichtingen (IACUC).
1. Media Voorbereiding
- Bereid compleet RPMI 1640 medium met 10% FBS en 1% penicilline streptomycine (10.000 U / ml) op met 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 0,1 mM niet essentiële aminozuren, 5 mM HEPES en 0,05 mM 2 mercaptoëthanol.
2. Allograft Isolatie en een-cel Suspensie
OPMERKING: De transplantatie- en anastomose-techniek van de longslagader en de inferieure cava ader werd aanvankelijk beschreven door Corry en medewerkers en kan worden geïllustreerd in Liu & KangS = "xref"> 10 , 11 ( Figuur 1A ).
- Verdoof een getransplanteerde muis met 4-5% isofluraan in een inductiekamer. Offer het door cervicale dislocatie.
- Maak een middelste buikopname met standaardschaar en verwijder de buikinhoud om de aorta te lokaliseren.
OPMERKING: Het getransplanteerde hart staat aan de rechterkant van de ontvanger abdominale aorta ( Figuur 1B ). - Trek het transplantaat zachtjes uit met behulp van fijne scherpe tandenpennen en plaats het onmiddellijk in ijskoud RPMI-medium.
OPMERKING: Het gebruik van een chirurgische schaar om het transplantaat van de aorta te scheiden, kan het transplantaat beschadigen en ervoor zorgen dat er een weefsel aan de ontvanger blijft. - Nadat alle transplantaten zijn verzameld, verplaatsen ze in een steriele kweekkap voor weefselverwerking. Plaats het transplantaat in een petri schotel en doei het weefsel in kleine stukken (1 mm) met behulp van steriele, stompe, microchirurgische scharen.
- Met scherpe tanden forcEps, de stukken overbrengen naar een 50 ml buis met 5 ml collagenase A (0,1 mg / ml collagenase in steriele 1x PBS). Incubeer het gedurende 1 uur in een 37 ° C bad.
- Voeg 5 ml RPMI-medium toe om de collagenase te neutraliseren en het monster over te brengen door een 100 μm filter met behulp van de zuiger van een 1 ml spuit.
- Spoel het monster gedurende 4 minuten bij 400 xg bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet in 1 ml ACK lysis buffer. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 1 ml RPMI-medium toe om de lysisbuffer te neutraliseren en de monster gedurende 5 m bij 4 ° C naar 400 xg te draaien.
- Resuspendeer de celpellet in 200 μl RPMI-medium en overbreng deze naar een 5 ml polypropyleen ronde bodembuis.
OPMERKING: Polypropyleenbuizen ondersteunen minder aanhechting. Ook de handhaving van de cellen bij lage temperatuur, zoals 4 ° C, vermindert de hechting.
3. Isolatie van graft-infiltrerende macrofagen met behulp van fluorescentie-geactiveerde cel sorterening
- Blokkeer ongewenste specifieke binding op myeloïde cellen door gebruik te maken van Fc-receptor blokkerende mAb (rat anti-muis CD16 / 32). Voeg 1-2 μL per monster toe, 15 min voor het oppervlakkleuren.
- Vlek met anti-muis CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μL eindconcentratie in het RPMI-medium), anti-muis CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μl), anti-muis Ly6C APC (2 μg / μl) En anti-muis Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μl). Bedek de buizen met aluminiumfolie om de fluorescerende antilichamen tegen licht te beschermen en de buizen in de koelkast bij 45 ° C bij 4 ° C te incuberen.
OPMERKING: Voor eenvlekcompensaties, berei een negatieve controlebuis (geen vlek) en buizen op met cellen die enkel met elk van de fluorochromen gemerkt zijn. Om de poort op te zetten, kunnen de isotype controles vooral worden gebruikt voor Ly6C (IgG2a) en Ly6G (IgG2b). - Was de cellen tweemaal met RPMI-medium en draai ze 5 minuten bij 400 ° C bij 4 ° C. Tel de cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometeR en verdun ze in 1 ml RPMI medium per 1 x 106 cellen. Voordat u de sortering doorlaat, steek de monsters over via een 5 ml, 70 μm cilinderbuiskap. Voeg DAPI (1 μg / ml) als een cel levensvatbaarheidsmerker toe en ga verder met sorteren.
- Omdat macrofagen gevoelige en kwetsbare cellen zijn, stelt u de sorteeromstandigheden in op 20 psi en gebruikt u een 100 μm spuitmaten om macrofagen te isoleren met een 4-weg zuiverheidsmodus.
- Bereid de collectiebuizen op met 1 ml RPMI-medium in een 5 ml polypropyleenbuis.
- Met behulp van de sorteringssoftware opent u een nieuw experiment en selecteert u leeg experiment met een leeg paneel om instellingen te definiëren.
- Stel een puntplot op die de voorwaartse (FSC) versus ( vs. ) zijverspreiding (SSC) en poort op alle leukocyten toont, met uitzondering van puin en klontjes met de laagste voor- en zijkantverdeling. Vanuit deze ouderpoort maak je een nieuw stipplot dat SSC versus DAPI en poort op DAPI-cellen toont.
- Op deze nieuwe gated bevolking, maak een advertentieOt plot die CD11b versus CD45 en poort toont op dubbele positieve (CD11b + CD45 + ) macrofagen en neutrofielen.
- Maak hiervandaan een definitief puntplot dat Ly6C versus Ly6G weergeeft en de gewenste populaties halen: Ly6C hi Ly6G-, Ly6Clo Ly6G- en Ly6C int Ly6G + ( Figuur 2 ).
- Controleer na het sorteren op de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de cel (> 90%) en draai de collectiebuizen bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Tel de cellen met behulp van trypanblauw en een hemocytometer en zet ze opnieuw op bij de gewenste concentratie ( bijv. 1 x 10 6 macrofagen / ml) in compleet RPMI-medium.
- Platte 50 x 10 3 macrofagen per putje in een 96-putjes ronde bodemplaat met een eindvolume van 100 μl volledig RPMI-medium. Laat de cellen ongestoord blijven gedurende minstens 24 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
4. IsolatioN van T-cellen met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering
OPMERKING: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn is een X-linked gerichte inklapbare muisstam die co-merken voor cellen die het Foxp3-gen (voorhoofd P3) uitdrukken met monomeer rood fluorescent eiwit (mRFP).
- Verdoof en offer C57BL / 6 en C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) muizen zoals eerder beschreven in stap 2.1. Isoleer de milt en lymfeklieren (LN: inguinale, lumbale, axillaire, brachiale en cervicale) en plaats ze snel in ijskoud RPMI-medium.
- Om de LN te isoleren, zet de muis in de rugpositie, maak een onderkant van de onderkant van de onderkant naar boven, snijd het peritoneum zorgvuldig en verdeel de huid zachtjes uit elkaar. Zodra alle ingewanden, lumbale, okselvormige, brachiale en cervicale LN zijn verzameld ( Figuur 1C , rood gekleurd), snijd het peritoneum en isoleer de milt aan de linkerbovenkant van de darm.
- Ontmelt de milt en LN met behulp van een 100 μm filter geplaatstBoven op een 50 ml buis. Druk met behulp van de plunjer van een 1 ml injectiespuit voorzichtig op het weefsel. Spoel het filter met RPMI-medium zo vaak als nodig totdat het schoon is.
OPMERKING: LN en milt van elke muis kunnen in dezelfde buis samengevoegd worden. - Spin bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer de pellet in 2 ml ACK lysis buffer. Meng goed en incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 2 ml RPMI medium toe om de lysisbuffer te neutraliseren. Spin bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer de celpellet in 200 μl RPMI-medium en overbreng deze naar een 5 ml polystyreen ronde bodembuis.
- Vlek voor anti-muis CD4 APC (0,6 μg / μl) en / of anti-muis CD8 PeCy7 (2 μg / μL). Bedek de buizen met aluminiumfolie om de fluorescerende antilichamen tegen licht te beschermen en de buizen in de koelkast te incuberen bij 4 ° C gedurende 45 minuten.
OPMERKING: Voor eenvlek compensaties, maak een negatieve controlebuis (geen vlek) enBuizen met cellen gemerkt afzonderlijk met elk van de fluorochromen. - Was de cellen tweemaal met RPMI-medium en draai ze 5 minuten bij 400 ° C bij 4 ° C. Tel de cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer.
OPMERKING: CFSE-kleurstof wordt standaard aangeboden als carboxyfluoresceendiacetaatsuccinimidylesterpoeder, bij 50 μg. Voeg 18 μL DMSO toe aan een injectieflacon van CFSE voor een laatste voorraadoplossing van 5 mM en houd het bij een paar maanden bij -20 ° C. - Voor CFSE-labeling, resuspendeer CD8-gekleurde cellen bij een concentratie van maximaal 10 6 cellen per ml in PBS bij een uiteindelijke werkconcentratie van 5 μM CFSE uit de voorraadoplossing. Incubeer ze gedurende 5 minuten in een bad bij 20 ° C zoals eerder beschreven 6 .
OPMERKING: (CRITISCHE STAP) Voor cellen met een lage concentratie (≤10 6 per ml) is het van essentieel belang dat de cellen worden gemerkt in aanwezigheid van toegevoegde eiwitten om de giftige effecten van CFSE te bufferen. Daarom kan PBS 5% FBS bevatten. Merk op dat als ikDium wordt gebruikt, kunnen vrije aminozuren de etiketteringsefficiëntie verlagen door te concurreren voor CFSE. - Neutraliseer de CFSE met 2 ml RPMI-medium. Spin bij 400 xg gedurende 5 min bij 4 ° C. Voeg 1 ml RPMI medium per 1 x 10 6 CD8 T-cellen toe.
- Voordat u het sorteren, steek het monster door een 70 μm celfilter op een 5 ml buisdop. Voeg 50 μL 1x DAPI (1 μg / ml) als een cel levensvatbaarheidsteken toe en ga verder met sorteren.
OPMERKING: 1x betekent 1: 1 verhouding van het reagens met respect voor ander bestanddeel. - Stel de sorteeromstandigheden bij 20 psi en 100 μm nozzle grootte in om dubbele positieve CD8 + CFSE + T cellen te isoleren ( Figuur 3A ).
- Bereid de collectibuizen met 1 ml RPMI-medium in een 5 ml polypropyleenbuis en ga verder met sorteren.
- Met behulp van de sorteringssoftware opent u een nieuw experiment en selecteert u leeg experiment met een leeg paneel om instellingen te definiëren.
- Voor CD4 + T-celisolatie, stel een dotplot op die dat isSpeelt de FSC vs SSC en de poort op lymfocyten, met uitzondering van puin en grote granulaire cellen, zoals dendritische cellen.
- Vanuit deze ouderpoort maak je een nieuw stipplot dat SSC versus DAPI en poort op DAPI-cellen toont.
- Op deze nieuwbevolkte populatie creëert u een dotplot die SSC vs. CD4 weergeeft om alle CD4 + -cellen te isoleren ( Figuur 3B ). Als alternatief kan een anti-CD3 mAb worden gebruikt om isolatie van pure T-celpopulaties te waarborgen.
OPMERKING: een kleine fractie van alle CD4 + T-cellen (5-10%) moet Foxp3 + mRFP + zijn .
- Controleer na het sorteren op de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de cel (> 90%) en draai de collectiebuizen bij 400 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Tel de cellen met behulp van trypan blauw en een hemocytometer. Resuspenderen met 1 ml volledig RPMI-medium per 2x10 6 T-cellen.
- Onderdrukkingstest opstellen door T cellen te cultiveren met eerder gesorteerd macrofagen. Plaat 10 x 10 4 CD4 + T en 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T-cellen in dezelfde put in een eindvolume van 100 μl volledig RPMI-medium. Incubeer bij 37 ° C en 5% C02 gedurende 96 uur.
OPMERKING: Macrofagen en T-cellen werden gebruikt in een 1: 4 verhouding. - Stimuleer T-celverdeling door het wassen van T-cel-activator CD3 / CD28 magnetische kralen in 2 ml PBS voordat u ze gebruikt om de azide bevattende buffer te verwijderen. Voeg 5 μl muis T-cel-activator CD3 / CD28 kralen per put toe.
OPMERKING: Magnetische kralen hebben een soortgelijke grootte als antigeen presenterende cellen en zijn gekoppeld aan anti-CD3 en anti-CD28 mAb, waarbij een eenvoudige methode voor de activatie en uitbreiding van T-cellen wordt aangeboden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representatieve resultaten tonen de gate strategie beschreven in het bovenstaande protocol. Resultaten tonen ook de analyse van de T-cel proliferatie activiteit na de co-cultuur met transplantatie-infiltrerende macrofagen. De in vitro onderdrukkende capaciteit van macrofaag subsets werd geanalyseerd in figuur 4 . De resultaten wijzen erop dat de Ly6C lo Ly6G - macrofagen verkregen uit getolereerde ontvangers onderdrukkend zijn. De resultaten geven aan dat Ly6C int Ly6G + cellen een bescheiden onderdrukkende capaciteit aantonen. Alleen Ly6C lo Ly6G - cellen bevorderden de uitbreiding van CD4 + Foxp3 + Treg in vitro . Samen ondersteunen de data de conclusie dat transfusie-infiltrerende CD11b + Ly6Clo Ly6G - macrofagen veel van de eigenschappen bezitten die gerapporteerd worden geassocieerd met monocyt-afgeleide suppressorcellen 12 , inCluding hun vermogen om CD8 T-cel proliferatie 13 te remmen en CD4 + Foxp3 + Treg expansie 14 te bevorderen.
Figuur 1: Diermodel. ( A ) Balb / c harten (H2-d) werden getransplanteerd tot volledig allogene C57BL / 6 (H2-b) zoals eerder beschreven 10 . Anastomose, van de cava ader van de ontvanger en abdominale aorta met de donor's pulmonale arterie en respectievelijk oplopende aorta wordt getoond. Ontvanger muizen werden behandeld met 250 μg anti-CD40L mAb (kloon MR1) voor tolerantie-inductie op dagen 0, 2 en 4, zoals we onlangs 4 hebben gerapporteerd. Graftfunctie werd elke andere dag gecontroleerd door buikpalpatie. Afwijzing werd gedefinieerd als een volledige beëindiging van een tastbare hartslag en werd bevestigd door directe visualisatie bij laparotomie. ( B ) Representatieve afbeelding en ( C ) illustratie van anatomische plaats van LN en milt (in rood gekleurd) en de allograft (in paars gekleurd) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 2: Macrofagesorteringsstrategie. Vanaf de linkerbovenhoek worden leukocyten eerst door de grootte gaten, en vervolgens worden enkelvoudige cellen gediscrimineerd van puin en klontjes. Van singlets worden uitgesloten dode cellen uitgesloten op de DAPI negatieve fractie. Van levende cellen wordt CD45 + CD11b + gebruikt om myeloïde cellen te identificeren. Drie myeloidcellenpopulaties worden verder geïdentificeerd op basis van Ly6C- en Ly6G-expressie.= "_ Blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 3: Lymfocytsorteringsstrategie. Representatieve flowcytometrie resulteert in de lymfocytsorteringsstrategie. Van linksboven komt de poort op de lymfocytenpopulatie naar voren en in de zijde. Exclusief puin en klontjes. Van singlets worden dode cellen uitgesloten door de DAPI-negatieve fractie te gaten. Van levende cellen, ( A ) CD8 + CFSE + dubbele positieve cellen en ( B ) alle CD4 + T-cellen, die een fractie Foxp3 + positieve cellen bevatten, zijn gated. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
![Figuur 4]("/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg")
Figuur 4: Onderdrukkingstest. ( A ) In vitro suppressieve capaciteit van elke myeloid subset. CD8 + T-cel proliferatie werd gecontroleerd door CFSE verdunning na 96 uur co-cultuur met myeloid subsets. ( B ) In vitro Treg uitbreiding van elke myeloid subset. Flowcytometrie analyse van Foxp3 expressie op CD4 + T cellen na 96 uur co-cultuur met myeloid subsets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de methoden die we gebruikt om immuun-infiltrerende myeloïde cel subsets te immunocharacteriseren in een experimenteel murine model van harttransplantatie, die ook van toepassing is op andere weefsels in verschillende muizen experimentele modellen. Lage drukcellen sorteren bij 20 psi was de voorkeursmethode om een goede opbrengst van subgroepen met zuivere cellen te isoleren. Het behouden van de zuiverheid van elke myeloïde subset is essentieel om afdoende resultaten van de onderdrukkende capaciteit tussen de verschillende myeloïde populaties vast te stellen. Andere methoden kunnen echter worden gebruikt voor het isoleren van verschillende leukocytenpopulaties, zoals commerciële verrijkingskits. Ongeacht de celpopulatie van belang, is het verkrijgen van levensvatbare enkelcelsuspensies van het getransplanteerde weefsel nodig voor optimale oppervlakkleuring en flowcytometrie resultaten. Onjuiste weefselmanipulatie kan celverlies veroorzaken en daarom een lage opbrengst van myeloid subsets. Om de opbrengst te verhogen, zorg ervoor dat u het monster u verwerktKoude buffers zingen en de cellen in containers met een lage celadhesie (polypropyleenbuizen) onderhouden. In dit protocol hebben we Collagenase A van C. histolyticum gebruikt , die veel gebruikt wordt voor de disaggregatie van vele soorten weefsels ( bijv. Long-, hart-, spier-, bot-, vet-, lever-, nier-, kraakbeen-, membraan-, placenta-, bloed- Vaartuig, hersenen en tumor). Om het verlies van cellen te voorkomen tijdens het sorteren, wordt het optimaliseren van de antilichamen en het opwekken van een efficiënte gateway strategie sterk aanbevolen. In dit protocol gekenmerkt we murine macrofagen onder gebruikmaking van CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, Ly6C / APC en Ly6G Pe / Cy7 fluorescerende geconjugeerde antilichamen en stromingscytometrie. Aangezien de epitopen Ly6C / G niet in mens bestaan, is het gebruik van CD14 / CD15 / CD16 nodig voor het sorteren van humane myeloïde cellen 15 .
In multicolor flow cytometry analyse kunnen mogelijke spectrale overlapjes van de gekozen fluorochromen optreden. Daarom, zoals vermeldRe, single-stain compensaties zijn zeer nuttig om overlappende problemen te vermijden. Daarnaast wordt antilichaamtitratie sterk aanbevolen om de achtergrondfluorescentie te verminderen en om optimale resultaten te verkrijgen. Een ander belangrijk oordeel om niet-specifieke binding te verminderen is het gebruik van levensvatbaarheidskleurstoffen. In dit protocol wordt DAPI gebruikt als levensvatbaarheidsverf. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool) is een blauwe fluorescerende vlek die sterk bindt aan AT-rijke gebieden in DNA. Het excitatie maximum voor DAPI gebonden aan DNA is 358 nm en het emissie maximum is 461 nm. Wanneer dit volgens protocol wordt gebruikt, vlekt DAPI specifiek nucleair, met weinig of geen cytoplasmatische etikettering, met uitzondering van dode cellen in de stromingsanalyse. Afhankelijk van het gekozen paneel van antilichamen kunnen echter andere levensvatbaarheidskleurstoffen, zoals 7-Aminoactinomycine D (7-AAD) en propidiumjodide (PI), worden gebruikt. Nauwkeurige uitsluiting van dode cellen en identificatie van levende cellen is een voorwaarde om in vitro T-cellen succesvol te kunnen volgen, aangezien het impor isGeneigd om procedures te hebben die lymfocyten proliferatie kunnen volgen met minimale verstoring van de levensvatbaarheid en functie van de cel.
Zoals hierboven vermeld, zijn er kritische stappen voor cel-etikettering en proliferatie-analyses met cell tracking kleurstoffen zoals CFSE. Als voorbeeld van de literatuur moet er zorgvuldig aandacht worden besteed aan de uitsluiting van dode / sterfcellen om uniforme verdelingen en onderscheidbare dochterpieken te verkrijgen bij gebruik van CFSE 16 . Er zijn veel commercieel verkrijgbare cell tracking kleurstoffen om uit te kiezen, afhankelijk van de kleurplaten. Als alternatief voor celopsporende kleurstoffen worden thymidine getitreerde assay uitgevoerd om de proliferatie van lymfocyten en andere cellen in kankerstudies 13 , 14 te evalueren. Thymidine-incorporatieprotocollen beoordelen de replicatie van DNA tijdens celverdeling door de maat van radioactief gemerkte 3H- of 14C-thymidine. Hoewel deze methode iIs vrij gevoelig en goed vastgesteld, de belangrijkste nadelen voor thymidine getitreerde techniek is dat het radioactiviteit inhoudt en geen informatie op het enkelcelniveau biedt. Anderzijds geeft CFSE-flowcytometrie analyse duidelijke informatie over het reageren van lymfocytonderdelen en heeft minder inter- en intralaboratoire variabiliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij erkennen de technische bijdragen van de Flow Cytometry, Microchirurgie, en Bio-repository / Patologie Centra of Excellence in onderzoek in Mount Sinai. Dit werk werd ondersteund door de COST Action BM1305: Actie om de Tolerogene Therapieën van de Cel te concentreren en te versnellen (FACTT), de ontwikkelingsfondsen van het Sinai Recanati / Miller Transplantatie Instituut, Ministerio de Ciencia en Innovacion SAF2013-48834-R en SAF2016-80031-R JO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V.
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
