Summary
대 식세포는 방어 면역과 항상성에 결정적인 역할을하는 조혈 시스템의 플라스틱 세포입니다. 이 보고서에서 우리는 관용적 조건 하에서 이식 장기에 축적되는 이식편 침윤 조절 macrophage를 표현형 및 기능적으로 특성화하기 위해 최적화 된 시험 관내 기술을 설명합니다.
Abstract
이식 장기의 대 식세포 축적은 동종 이식 거부 1 의 특징으로 오래 동안 인식되어왔다. 면역 원성 단핵구는 이식 후 조기에 동종 이식종에 침투하고, 이식 장기에 대한 이식편 반응 반응을 일으키며 장기 거부 반응을 시작합니다 2 . 최근 데이터는 억제 성 대 식세포가 장기 이식 성공을 촉진하고 이식 내성의 유도에 필요하다는 것을 시사한다. 이것은 macrophage 기능의 분리 및 분석을위한 새로운 로드맵을 요구하는 macrophage ontogeny, activation 및 function의 다차원 개념을 제안합니다. 대 식세포의 소성 때문에 조직 환경에 따라 대 식세포를 분리하고 특성화하는 방법론을 제공하고 여러 시나리오에 따라 기능을 정의해야합니다. 여기, 우리는 descri이식편 침윤성 대 식세포의 면역 특성 규명 및 우리가 기능적으로 CD8 + T 증식을 억제 하고 체외에서 CD4 + Foxp3 + Treg 확장을 촉진시키는 능력을 기능적으로 평가하는 데 사용한 방법이 될 수 있습니다.
Introduction
이 프로토콜은 T 세포 반응을 조절하는 능력에 따라 심장 동종 이식으로부터 격리 된 조직 침윤성 대 식세포의 기능을 연구하기위한 시험 관내 기술을 기술한다. 문헌에 널리 기술되어 있듯이, 형광 세포 추적 염료는 유세포 분석과 함께 체외 및 특정 생체 내 특정 세포 유형 의 억제 기능을 연구하는 강력한 도구 입니다. 우리의 프로토콜 은 체외에서 림프구 증식을 모니터링하기 위해 carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) 방법을 따른다.
CFSE로 표지 된 세포가 분열하면 그 자손은 카르복시 플루 오레 신 표지 분자의 수의 절반을 얻습니다. 유동 세포 계측법에 의한 세포 형광의 감소는 T 세포 면역 반응을 조절하는 억제 성 대 식세포의 능력을 모니터링하는 세포 분열을 평가하는데 사용될 수있다. CFSE는 플루 오레 신계 염료이기 때문에 br다량의 유동 세포 계측법에 적용 할 수있는 다른 형광 크로마토 그래피의 범위를 제공합니다. phenotyping을위한 fluorochromes의 적절한 선택은 과도한 스펙트럼의 중복과 항원 양성 세포, 특히 CFSE 7 와 같은 가시 단백질 염료를 인식하지 못하는 것을 피하기 위해서도 중요합니다.
방사성 표지 된 티미 딘 (TdR) 8 을 사용하는 티미 딘 도입 분석과 같은 세포 증식을 측정하는 대체 기술에 비해 형광 염료를 사용하면 많은 이점이 있습니다. 이 분석은 mitotic 세포 분열 동안 염색체 DNA의 새로운 가닥에 통합되는 삼중 티미 딘 ( 3 H-TdR)을 이용한다. 이 분석과 관련된 안전 문제는 방사성 동위 원소의 사용이다. 왜냐하면 신틸레이션 베타 계수기가 세포 분열 정도를 결정하기 위해 세포에서 회수 된 DNA의 방사능을 측정하기 때문이다. 방법 론적으로, 삼중 수소 티미 딘 엉덩이ay는 세포 수가 적고 염색 후 지연된 분석과 같은 중요한 임상 실험실 제약 조건에 맞을만큼 유연하지 않습니다. 반대로, CFSE 염색은 세포 증식을 예방하고 CD69, HLA-DR 및 CD25와 같은 중요한 활성화 마커를 방해하는 것으로 나타났습니다. 따라서 각 방법론의 장점과 한계를 이해하는 것은 특히 여러 염료를 사용하여 여러 세포 유형을 추적하는 다색 연구에서 정확하고 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구에서 쥐는 미국 농무성 지침 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 보건 서비스 안내서의 권고에 따라 보관됩니다. 동물 실험과 관련된 모든 실험 기술은 Mount Sinai School of Medicine의 IACUC (Institutional Animal Care and Utilization Committee) 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 미디어 준비
- 2 MM L - 글루타민, 1 MM 나트륨 피루 베이트, 0.1 MM 비 필수 아미노산, 5 MM HEPES 및 0.05 MM 2를 사용하여 10 % FBS와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (10,000 U / ML)와 완전한 RPMI 1640 매체를 준비 - 머 캅토 에탄올.
2. 동종 이식 및 단일 세포 현탁액
참고 : 폐동맥과 하대 정맥 정맥의 이식 및 문합 기법은 Corry와 공동 작업자에 의해 처음 설명되었으며 Liu & Kang에서 시각화 할 수 있습니다s = "xref"> 10 , 11 ( 그림 1A ).
- 유도 챔버에서 4-5 % isoflurane으로 이식 마우스를 마취. 자궁 경관 탈구로 희생하십시오.
- 정형 가위로 정중선을 절개하고 대동맥을 국소화하기 위해 복부 내용물을 제거하십시오.
참고 : 이식 된 심장은 복부 대동맥의 오른쪽에 있습니다 ( 그림 1B ). - 미세한 날카로운 이빨 집게로 이식편을 부드럽게 당겨 즉시 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에 넣으십시오.
참고 : 수술 가위를 사용하여 대동맥에서 이식편을 분리하면 이식재가 손상되고 일부 조직이 수혜자에게 달라 붙을 수 있습니다. - 모든 이식편을 수거 한 후 조직 처리를 위해 멸균 된 문화 후드로 옮깁니다. 페트리 접시에 이식을 배치하고 무균, 무딘, microsurgery 가위를 사용하여 작은 조각 (1mm)로 조직을 주사위.
- 날카로운 이빨을 가진 forc로eps, collagenase A (멸균 1x PBS에 0.1 MG / ML collagenase) 5 ML와 50 ML 튜브에 조각을 전송. 37 ° C 조에서 1 시간 동안 배양한다.
- 콜라게나 제를 중화하기 위해 RPMI 배지 5 mL를 넣고 1 mL 주사기의 플런저를 사용하여 100 μm 스트레이너로 시료를 옮긴다.
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 샘플을 회전 시키십시오.
- 펠릿을 ACK 용해 버퍼 1 ML에 Resuspend. 잘 섞어 4 분 5 분 동안 품어 라.
- 용해 완충액을 중화하기 위해 RPMI 배지 1 ML을 추가하고 4시 5 분 400 XG에서 샘플을 회전 ° C.
- RPMI 배지 200 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 5 ML 폴리 프로필렌 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다.
참고 : 폴리 프로필렌 튜브는 접착력이 적습니다. 또한 4 ° C와 같은 저온에서 세포를 유지하면 접착력이 감소합니다.
3. 형광 활성화 된 세포를 이용한 이식편 - 침윤성 대 식세포의 분리보내는
- Fc 수용체 차단 단클론 항체 (rat ant-mouse CD16 / 32)를 사용하여 골수 세포에서 원하지 않는 특이 적 결합을 차단합니다. 표면 얼룩 15 분 전에 샘플 당 1-2 μL를 추가합니다.
- anti-mouse CD45 APC / eFluor780 (0.6 μg / μL), anti-mouse Ly6C APC (2 μg / μL), anti-mouse CD11b Percp / Cy5.5 (RPMI 배지에서 0.6 μg / μL 최종 농도) 항 마우스 Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μL). 형광등 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 45 분 동안 4 ℃에서 냉장고에 튜브를 잠복니다.
참고 : 단일 얼룩 보정의 경우 네거티브 컨트롤 튜브 (얼룩이 없음)와 각 형광 색소가있는 라벨이 붙은 튜브가있는 튜브를 준비하십시오. 문을 세우는 것을 돕기 위해 isotype 컨트롤은 특히 Ly6C (IgG2a)와 Ly6G (IgG2b)에 사용될 수 있습니다. - RPMI 매체로 세포를 두 번 씻어 4시 5 분 400 XG에서 그들을 회전 ° C. 트리 판 블루 (trypan blue) 및 혈구 세포 (hemocytomete)를 사용하여 세포를 센다.1x10 6 세포 당 RPMI 배지 1 ML에서 희석. 분류하기 전에 샘플을 5 mL, 70 μm 셀 여과기 튜브 캡으로 옮깁니다. 세포 생존률 마커로 DAPI (1 μg / ML)를 추가하고 정렬로 진행합니다.
- 대 식세포는 민감하고 깨지기 쉬운 세포이기 때문에 정렬 조건을 20 psi로 설정하고 100 μm 노즐 크기를 사용하여 4 방향 순도 모드를 사용하여 대 식세포를 분리합니다.
- 5 ML 폴리 프로필렌 튜브에서 1 ML의 RPMI 매체와 수집 튜브를 준비합니다.
- 분류기 소프트웨어를 사용하여 새 실험을 열고 빈 패널을 사용하여 빈 실험을 선택하여 설정을 정의합니다.
- 전방 및 측면 산란이 가장 적은 부스러기와 덩어리를 제외한 모든 백혈구의 전방 (FSC) 대 측면 (side) 산란 (SSC) 및 게이트를 표시하는 도트 플롯을 설정합니다. 이 상위 게이트에서 SSC 대 DAPI 및 DAPI 셀의 게이트를 표시하는 새로운 점 플롯을 만듭니다.
- 새롭게 문을 열 인구에 광고 작성CD11b 대 CD45 및 이중 양성 (CD11b + CD45 + ) 대 식세포 및 호중구의 게이트를 나타내는 플롯.
- 여기에서 Ly6C 대 Ly6G를 표시하는 최종 도트 플롯을 만들고 Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - , Ly6C int Ly6G + 와 같은 바람직한 개체군을 게이트하십시오 ( 그림 2 ).
- 분류 후, 순도와 세포 생존률 (> 90 %)을 확인하고 4 ℃에서 5 분 동안 400 xg에서 수집 튜브를 회전시킨다. trypan 블루와 hemocytometer를 사용하여 세포를 세고 완전한 RPMI 매체에서 원하는 농도 ( 예 : 1 × 10 6 macrophages / ML)에 그들을 resuspend.
- 완전한 RPMI 배지 100 μL의 최종 부피가있는 96- 웰 둥근 바닥 플레이트에서 웰당 플레이트 50 x 10 3 개의 대 식세포. 37 ° C와 5 % CO 2 에서 적어도 24 시간 동안 세포를 방해하지 마십시오.
4. Isolatio형광 활성화 된 셀 정렬을 이용한 T 세포의 수
참고 : C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn은 Foxp3 (포크 헤드 박스 P3) 유전자를 표현하는 세포를 단량체 적색 형광 단백질 (mRFP)과 공동 표지하는 X- 연결된 표적 노크 - 인 마우스입니다.
- 전에 2.1 단계에서 설명한대로 C57BL / 6 및 C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H - 2b) 마우스를 마취하고 희생. 비장과 림프절 (LN : 사타구니, 요추, 축삭, 상완, 자궁 경부)을 분리하고 신속하게 얼음처럼 차가운 RPMI 배지에 넣으십시오.
- LN을 분리하기 위해 마우스를 앙와위에 놓고 정중선 피부를 아래에서 위로 절개하고주의 깊게 복막을 잘라 부드럽게 피부를 벌리십시오. 모든 사타구니, 요추, 겨드랑, 상완, 그리고 자궁 경부 LN ( 그림 1C , 붉은 색)가 수집되면, 복막을 자르고 창자의 왼쪽 상단에서 비장을 분리.
- 배치 된 100 μm 필터를 사용하여 비장 및 LN 분리50 mL 튜브 위에 올려 놓습니다. 1mL 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 조심스럽게 누릅니다. 필요할 때까지 RPMI 배지로 필터를 깨끗이 헹굽니다.
참고 : 각 마우스의 LN과 비장은 동일한 튜브에 모아 둘 수 있습니다. - 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 스핀 다운.
- 펠릿을 ACK 용해 버퍼 2 ML에 Resuspend. 잘 섞어 4 분 5 분 동안 품어 라.
- 용해 버퍼를 중화하기 위해 2 ML RPMI 매체를 추가합니다. 4 ° C에서 5 분 동안 400 xg에서 스핀 다운.
- RPMI 매체 200 μL에 세포 펠렛을 Resuspend하고 5 ML 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 항 마우스 CD4 APC (0.6 μg / μL) 및 / 또는 항 마우스 CD8 PeCy7 (2 μg / μL)에 대한 염색. 빛으로부터 형광 항체를 보호하기 위해 알루미늄 호일로 튜브를 덮고 45 분 동안 4 ° C에서 냉장고에 튜브를 품어 라.
참고 : 단일 얼룩 보정의 경우, 음성 대조 튜브 (얼룩 없음)를 준비하고튜브는 형광 염료의 각각으로 단독으로 라벨이 붙어있다. - RPMI 매체로 세포를 두 번 씻어 4시 5 분 400 XG에서 그들을 회전 ° C. trypan blue와 hemocytometer를 사용하여 세포를 센다.
참고 : CFSE 염료는 일반적으로 50 μg에서 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester powder로 제공됩니다. CFSE의 유리 병에 18 μL DMSO를 넣어 최종 보관 용액 5 mM에 저장하고 -20 ° C에 보관하십시오. - CFSE 라벨을 위해, 주식 솔루션에서 5 μm의 CFSE의 최종 작업 농도에서 PBS에 ML 당 10 6 세포의 농도로 resuspend CD8 염색 세포. 앞서 설명한대로 20 ° C에서 5 분간 배양하십시오.
주의 사항 : (CRITICAL STEP) 저농도 (㎖ 당 ≤10 6 ) 인 세포의 경우 CFSE의 독성 효과를 완충시키기 위해 단백질이 첨가 된 상태에서 세포를 표지해야한다. 따라서, PBS는 5 % FBS를 함유 할 수있다. 나에게dium이 사용되면 유리 아미노산은 CFSE와 경쟁하여 표지 효율을 낮출 수 있습니다. - 2 mL의 RPMI 배지로 CFSE를 중성화하십시오. 4 ° C에서 5 분간 400 xg에서 스핀. 1 x 106 CD8 T 세포 당 1 mL의 RPMI 배지를 첨가한다.
- 분류하기 전에 샘플을 5 μm 튜브 캡에서 70 μm 셀 여과기로 옮깁니다. 세포 생존 마커로 1xDAPI (1 μg / ML) 50 μL를 추가하고 정렬로 진행합니다.
참고 : 1x는 다른 구성 요소에 대한 시약의 1 : 1 비율을 의미합니다. - 정렬 조건을 20 psi 및 100 μm 노즐 크기로 설정하여 이중 양성 CD8 + CFSE + T 세포를 분리합니다 ( 그림 3A ).
- 5 ML 폴리 프로필렌 튜브에 1 ML의 RPMI 매체와 수집 튜브를 준비하고 정렬로 진행합니다.
- 분류기 소프트웨어를 사용하여 새 실험을 열고 빈 패널을 사용하여 빈 실험을 선택하여 설정을 정의합니다.
- CD4 + T 세포 분리의 경우,수지상 세포와 같은 큰 과립 세포뿐만 아니라 잔해물을 제외한 FSC 대 SSC 및 림프구 게이트를 재생합니다.
- 이 상위 게이트에서 SSC 대 DAPI 및 DAPI 셀의 게이트를 표시하는 새로운 점 플롯을 만듭니다.
- 새롭게 문이 열어 진 인구에서 모든 CD4 + 세포를 분리하기 위해 SSC 대 CD4를 나타내는 도트 플롯을 만듭니다 ( 그림 3B ). 대안으로, 항 -CD3 단클론 항체를 사용하여 순수한 T 세포 집단의 분리를 보장 할 수있다.
참고 : 모든 CD4 + T 세포의 작은 부분 (5-10 %)은 Foxp3 + mRFP + 이어야합니다.
- 분류 후, 순도와 세포 생존률 (> 90 %)을 확인하고 4 ℃에서 5 분 동안 400 xg에서 수집 튜브를 회전시킨다. trypan blue와 hemocytometer를 사용하여 세포를 센다. 2x10 6 T 세포 당 1 ML의 완전한 RPMI 매체를 사용하여 Resuspend.
- 이전에 정렬 된 macrophages와 T 세포를 배양하여 억제 분석을 설정합니다. 플레이트 10 x 10 4 CD4 + T 및 10 × 10 4 CD8 + CFSE + T 세포를 100 μl의 최종 RPMI 배지에 넣었다. 96 시간 동안 37 ° C 및 5 % CO 2 에서 배양하십시오.
참고 : 대 식세포와 T 세포는 1 : 4 비율로 사용되었습니다. - 아 지드 함유 완충액을 제거하기 전에 T 세포 활성제 CD3 / CD28 자석 구슬을 PBS 2mL로 세척하여 T 세포 분열을 자극합니다. 우물 당 마우스 T 세포 - 활성화 CD3 / CD28 비즈 5 μL를 추가합니다.
참고 : Magnetics beads는 항원 제시 세포와 크기면에서 유사하며 T 세포의 활성화와 확장을위한 간단한 방법을 제공하는 항 -CD3 및 항 -CD28 mAb에 결합됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
대표적인 결과는 위의 프로토콜에 설명 된 게이팅 전략을 보여줍니다. 결과는 또한 이식편 - 침투 대 식세포와의 공 - 배양 후 T- 세포 증식 활성의 분석을 나타낸다. 그림 4 에서 대 식세포 하위 집합의 체외 억제 능력을 분석했습니다. 결과는 용인 된 수용자로부터 얻은 Ly6C lo Ly6G - 대 식세포가 억압 적이라는 것을 나타낸다. 결과는 또한 Ly6C int Ly6G + 세포가 완만 한 억제 능력을 나타낸다는 것을 나타낸다. Ly6C lo Ly6G - 세포 만이 체외에서 CD4 + Foxp3 + Treg의 확장을 촉진했다. 함께, 이식편 - 침투 CD11b + Ly6C lo Ly6G - macrophages는 단핵구 유래 억 제기 세포와 관련된 것으로보고 된 많은 특성을 가지고 있다는 결론을 뒷받침한다.CD8 T 세포 증식을 억제하고 CD4 + Foxp3 + Treg의 증식을 촉진시키는 능력을 보였다.
그림 1 : 동물 모델. ( A ) Balb / c 심혼 (H2-d)는 이전에 기술 된 것과 같이 완전히 동종이의 C57BL / 6 (H2-b)로 이식되었다. 수혈부의 대동맥과 복부 대동맥의 기증자의 폐동맥과 상행 대동맥을 각각 가진 문합이 표시됩니다. 수용체 마우스를 우리가 최근에보고 한 바와 같이, 0, 2 및 4 일째에 내성 유도를 위해 250 ㎍의 항 -CD40L 단클론 항체 (클론 MR1)로 처리 하였다. 이식 기능은 복부 촉진에 의해 격일로 모니터링되었습니다. 거부 반응은 만져진 심장 박동의 완전 중단으로 정의되었으며, 직접 시각화를 통해 확인되었다. 개복술. ( B ) 대표 이미지 및 ( C ) LN과 비장 (빨간색으로 표시) 및 동종 이식 (보라색으로 표시)의 해부학 적 위치를 보여주는 그림입니다.이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 대 식세포 분류 전략. 왼쪽 위부터 시작하여, 백혈구는 처음에는 크기에 의해 문이 열리고, 그 다음에 단일 세포가 파편과 덩어리로부터 차별됩니다. singlets에서, 죽은 세포는 DAPI 음성 분율에 게이팅되지 않습니다. 살아있는 세포에서 CD45 + CD11b + 는 골수 양 세포를 확인하는 데 사용됩니다. Ly6C 및 Ly6G 발현에 기초하여 3 개의 골수 세포 집단이 추가로 동정된다.= "_ blank">이 그림의 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오.
도표 3 : 림프구 분류 전략. 림프구 정렬 전략에 대한 대표적인 유동 세포 계측 결과. 왼쪽 위부터, 전방 및 옆방 산란에 따라 림프구 집단의 문. 잔해 및 덩어리를 제외하십시오. 싱글 렛으로부터, 죽은 세포는 DAPI 음성 분율을 게이팅함으로써 배제된다. 살아있는 세포에서, ( A ) CD8 + CFSE + 이중 양성 세포와 ( B ) Foxp3 + 양성 세포의 분획을 포함하는 모든 CD4 + T 세포는 문이 열립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
![그림 4]("/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg"/>)
그림 4 : 억제 분석. ( A ) 체외 에서 각 골수 하위 집합의 억제 능력. CD8 + T 세포 증식은 골수량 하위 세트와의 공동 배양 96 시간 후 CFSE 희석에 의해 모니터링되었다. ( B ) 체외 Treg 각 골수 하위 집합의 확장. 골수량 하위 집합과 공동 배양 96 시간 후 CD4 + T 세포에서 Foxp3 발현의 유동 세포 계측법 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 프로토콜은 심장 이식의 실험 쥐 모델에서 이식편 - 침윤 골수 세포 서브 세트를 면역화하는 데 사용한 방법을 기술하며, 이는 다른 쥐 실험 모델의 다른 조직에도 적용 가능합니다. 20 psi에서의 저압 셀 분류는 순수한 셀 하위 집합의 좋은 수율을 격리하는 데 선호되는 방법이었습니다. 각 골수 하위 집합의 순도를 유지하는 것은 다른 골수 집단 사이의 억제 능력의 결정적인 결과를 확립하는 데 중요합니다. 그러나, 상업적 농축 키트와 같은 다양한 백혈구 집단의 분리를 위해 다른 방법이 사용될 수있다. 관심있는 세포 집단과 관계없이 최적의 표면 염색 및 유동 세포 계측 결과를 얻기 위해서는 이식 조직에서 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻는 것이 필요합니다. 부정확 한 조직 조작은 세포 손실을 초래할 수 있으며 따라서 골수량 하위 집합의 낮은 수율을 초래할 수 있습니다. 수율을 높이려면 샘플을 처리해야합니다.차가운 버퍼를 노래하고 낮은 세포 부착 (폴리 프로필렌 튜브)과 용기에 세포를 유지합니다. 이 프로토콜에서 우리는 C. histolyticum의 Collagenase A를 사용하여 여러 유형의 조직 ( 예 : 폐, 심장, 근육, 뼈, 지방, 간, 신장, 연골, 유선, 태반, 혈액)의 분리에 널리 사용됩니다. 혈관, 뇌, 종양). 정렬하는 동안 세포의 손실을 방지하기 위해 항체를 최적화하고 효율적인 게이팅 전략을 생성하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에서 우리는 CD11b - Percp / Cy5.5, CD45 - APC / eFluor780, Ly6C / APC 및 Ly6G Pe / Cy7 형광 결합 항체 및 유동 세포 계측법을 사용하여 마우스 macrophages 특징. 에피토프 Ly6C / G는 사람에게 존재하지 않기 때문에 CD14 / CD15 / CD16의 사용은 인간 골수 세포를 분류하는데 필요합니다 15 .
다색 유문 사이토 메 트리 분석에서, 선택된 형광 크로마토 그래피의 가능한 스펙트럼 중첩이 발생할 수 있습니다. 따라서 befo다시, 단일 얼룩 보상은 겹치는 문제를 피하기 위해 매우 유용합니다. 또한, 배경 형광을 줄이고 최적의 결과를 얻으려면 항체 적정을 적극 권장합니다. 비특이적 결합을 줄이기위한 또 다른 중요한 고려 사항은 생존력 염료의 사용이다. 이 프로토콜에서 DAPI는 생존 염료로 사용됩니다. DAPI (4 ', 6- diamidino-2-phenylindole)는 DNA의 AT가 풍부한 영역에 강력하게 결합하는 청색 형광 염료입니다. DNA에 결합 된 DAPI의 여기 최대 값은 358 nm이며 최대 방출 값은 461 nm이다. 프로토콜에 따라 사용하면 DAPI는 유동 분석에서 죽은 세포를 제외한 세포질 표지가 거의 없거나 전혀없는 상태로 핵을 특이하게 얼룩지게합니다. 그러나, 선택된 항체 패널에 따라 7-Amadactinomycin D (7-AAD) 및 propidium iodide (PI)와 같은 다른 생존 성 염료가 사용될 수 있습니다. 정확한 사체 세포 배제와 생존 세포 식별은 in vitro T 세포를 성공적으로 모니터하기위한 전제 조건입니다.세포 생존 능력과 기능에 미치는 영향을 최소화하면서 림프구 증식을 추적 할 수있는 절차를 원하고 있습니다.
위에서 언급했듯이 CFSE와 같은 세포 추적 염료를 이용한 세포 표지 및 증식 분석을위한 중요한 단계가 있습니다. 문헌에 기술 된 예로서, CFSE 16을 사용할 때 균일 한 분포와 구별 가능한 딸 첨점을 얻기 위해 죽은 / 죽어가는 세포를 배제하는 것에주의를 기울여야한다. 염색 패널에 따라 선택할 수있는 많은 상업적으로 이용 가능한 세포 추적 염료가 있습니다. 세포 추적 염료의 대안으로 thymidine titriated assay를 수행하여 암 연구 13,14 에서 림프구 및 기타 세포의 증식을 평가합니다. Thymidine incorporation 프로토콜은 방사성 표지 된 3H 또는 14C- 티미 딘의 측정에 의한 세포 분열 동안 DNA의 복제를 평가합니다. 이 방법은매우 민감하고 잘 확립 된 경우, 티미 딘 적정 기법의 주요 단점은 방사능을 포함하고 단일 세포 수준에서 정보를 제공하지 않는다는 것입니다. 반면에, CFSE 유동 세포 계측법 분석은 반응하는 림프구 부분 집합에 대한 명확한 정보를 제공하고 내부 및 병원 내 변동성이 적습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Sinai 산에서의 연구 우수성의 Flow Cytometry, Microsurgery 및 Bio-repository / Pathology Centres의 기술적 인 공헌을 인정합니다. 이 연구는 COST Action BM1305의 지원을 받았다. Salli Mount Recanati / Miller Transplantation Institute 발달 기금, Ciencia e Innovacion Minister SAF2013-48834-R 및 SAF2016-80031-R에 초점을 맞추고 세포 독감 치료법 (A FACTT)을 가속화하는 활동 조
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V.
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
