Summary
الضامة هي خلايا بلاستيكية من نظام المكونة للدم التي لها دور حاسم في مناعة وقائية والتوازن. في هذا التقرير، وصفنا الأمثل في تقنيات المختبر إلى ظاهريا ووظيفيا تميز الضامة التنظيمية المتسلل الكسب غير المشروع التي تتراكم في الجهاز المزروع تحت ظروف التحمل.
Abstract
وقد تم الاعتراف منذ فترة طويلة تراكم بلعم في الأعضاء المزروعة سمة من سمات الطعم المغفل الرفض 1 . الحيدات المناعية التسلل في المزروع في وقت مبكر بعد زرع، جبل استجابة الكسب غير المشروع رد الفعل ضد الجهاز المزروع، والشروع في رفض الجهاز 2 . وتشير البيانات الأخيرة أن الضامة قمعية تسهيل نجاح زرع على المدى الطويل 3 وهي مطلوبة لتحريض زرع التسامح 4 . وهذا يوحي بمفهوم متعدد الأبعاد للنسيج البلاعم، والتفعيل، والوظيفة، الأمر الذي يتطلب خارطة طريق جديدة لعزل وتحليل وظيفة البلاعم 5 . بسبب اللدونة من الضامة، فمن الضروري توفير منهجية لعزل وتوصيف الضامة، اعتمادا على بيئة الأنسجة، وتحديد وظائفهم وفقا لسيناريوهات مختلفة. هنا، نحن تصفيكون بروتوكول لتوصيف المناعة من الضامة المتسلل الكسب غير المشروع والطرق التي استخدمناها لتقييم وظيفيا قدرتها على منع انتشار CD8 + T وتعزيز CD4 + Foxp3 + تريج التوسع في المختبر .
Introduction
يصف هذا البروتوكول في تقنيات المختبر لدراسة وظيفة الضامة تسلل الأنسجة معزولة من المغايرة القلب، وفقا لقدرتها على تعديل استجابات الخلايا التائية. وصفت على نطاق واسع في الأدب، والأصباغ تتبع الخلايا الفلورسنت في تركيبة مع التدفق الخلوي، هي أدوات قوية لدراسة وظيفة قمعية من أنواع الخلايا المحددة في المختبر وفي الجسم الحي. بروتوكول لدينا يتبع طريقة إستر سوتسينيميديل كاربوكسيفلورسين (كفس) لرصد انتشار الخلايا الليمفاوية في المختبر .
عندما تنقسم خلية كفس المسمى، نسلها يكتسب نصف عدد من الجزيئات كاربوكسيفلورسين الموسومة 6 . الانخفاض المقابل في مضان الخلية عن طريق التدفق الخلوي يمكن استخدامها لتقييم انقسام الخلايا، ورصد قدرة الضامة قمعية لتعديل الاستجابات المناعية خلية T. منذ كفس هو صبغة فلوريسئين، وهو متوافق مع برمجموعة أواد من فلوروكروميس أخرى، مما يجعلها قابلة للتطبيق على متعدد الألوان التدفق الخلوي. الاختيار المناسب من فلوروكروميس ل فينوتيبينغ مهم أيضا لتجنب التداخل الطيفي المفرط وعدم القدرة على التعرف على الخلايا المضادة للأجسام المضادة، وخاصة مع مرئية الأصباغ البروتين مثل كفس 7 .
هناك العديد من المزايا من استخدام الأصباغ الفلورية على التقنيات البديلة التي تقيس تكاثر الخلايا، مثل فحص ثيميدين التأسيس، والذي يستخدم ثيميدين راديولبلد (تبر) 8 . هذا الفحص يستخدم ثيميدين تريتيتد ( 3 H-تدر) التي تم دمجها في فروع جديدة من الحمض النووي الكروموسومات خلال انقسام الخلايا الانقسامية. ومن الشواغل المتعلقة بالسلامة المرتبطة بهذا الفحص استخدام النظائر المشعة، حيث يستخدم مقياس بيتا التلألؤ لقياس النشاط الإشعاعي في الحمض النووي المسترجع من الخلايا من أجل تحديد مدى انقسام الخلايا. من الناحية المنهجية، والحمض ثيميدين تريتيتدأي ليست مرنة بما يكفي لتناسب القيود المخبرية السريرية الهامة مثل انخفاض عدد الخلايا وتأخر التحليل بعد تلطيخ. على العكس من ذلك، وقد تبين تلطيخ كفس لمنع تكاثر الخلايا والتدخل مع علامات التنشيط الحرجة، مثل CD69، هلا-در و CD25 9 . لذلك، فهم مزايا وحدود كل منهجية، وخاصة في دراسات متعددة الألوان حيث يتم استخدام الأصباغ متعددة لتتبع أنواع الخلايا المختلفة، أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في هذه الدراسة، يتم وضع الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية وزارة الزراعة في الولايات المتحدة وتوصيات دليل الخدمات الصحية العامة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم تنفيذ جميع التقنيات التجريبية التي تنطوي على استخدام الحيوان وفقا ل المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إاكوك) - البروتوكولات المعتمدة من مدرسة جبل سيناء الطب.
1. إعداد وسائل الإعلام
- إعداد كامل رمي 1640 المتوسطة مع 10٪ فبس و 1٪ البنسلين ستربتومايسين (10000 U / مل) باستخدام 2 ملي L- الجلوتامين، 1 ملي بايروفات الصوديوم، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الضرورية، 5 ملي هيبيس، و 0.05 ملي 2 -mercaptoethanol.
2. مزروع العزلة وحيدة الخلية تعليق
ملاحظة: تم وصف تقنية زرع ومفاغرة الشريان الرئوي والوريد الأجوف السفلي في البداية من قبل كوري والمتعاونين ويمكن تصور في ليو وكانغs = "كريف"> 10 ، 11 ( الشكل 1A ).
- تخدير ماوس مزروع مع 4-5٪ إيسوفلوران في غرفة الاستقراء. التضحية به عن طريق خلع عنق الرحم.
- جعل شق البطن خط الوسط مع مقص القياسية وإزالة محتويات البطن لتوطين الأبهر.
ملاحظة: سوف يكون القلب المزروع على الجانب الأيمن من المتلقي الشريان الأورطي البطني ( الشكل 1B ). - سحب الكسب غير المشروع بلطف باستخدام غرامة ملقط حادة الأسنان ووضعه على الفور في المتوسطة رمي الجليد الباردة.
ملاحظة: استخدام مقص جراحة لفصل الكسب غير المشروع من الشريان الأورطي يمكن أن تتلف الكسب غير المشروع وتسبب بعض الأنسجة أن تبقى التمسك المستلم. - بعد جمع جميع الطعوم، نقلها إلى غطاء العقيمة ثقافة لمعالجة الأنسجة. وضع الكسب غير المشروع في طبق بتري والزهر الأنسجة إلى قطع صغيرة (1 ملم) باستخدام العقيمة، حادة، مقص المجهرية.
- مع شوكة الأسنان الحادةإبس، ونقل القطع إلى أنبوب 50 مل مع 5 مل من كولاجيناز A (0.1 ملغ / مل كولاجيناز في برنامج تلفزيوني العقيمة 1X). احتضان لمدة 1 ساعة في حمام 37 درجة مئوية.
- إضافة 5 مل من رمي المتوسطة لتحييد كولاجيناز ونقل العينة من خلال مصفاة 100 ميكرون مع مساعدة من المكبس من حقنة 1 مل.
- تدور العينة أسفل في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الكرية في 1 مل من العازلة تحلل أك. مزيج جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إضافة 1 مل من رمي المتوسطة لتحييد العازلة تحلل وتدور العينة أسفل في 400 x ج لمدة 5 م في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند خلية بيليه في 200 ميكرولتر من رمي المتوسطة ونقله إلى 5 مل البولي بروبيلين أنبوب القاع.
ملاحظة: أنابيب البولي بروبلين دعم أقل الالتزام. أيضا، والحفاظ على الخلايا في درجة حرارة منخفضة، مثل 4 درجات مئوية، ويقلل من التصاق.
3. عزل الضامة تسلل الكسب غير المشروع باستخدام خلية مضان تنشيط فرزجي
- كتلة ملزمة غير المرغوب فيها محددة على خلايا الدم النخاعي باستخدام مستقبلات فك حجب ماب (الفئران المضادة للماوس CD16 / 32). إضافة 1-2 ميكرولتر لكل عينة، 15 دقيقة قبل تلطيخ السطح.
- وصمة عار مع المضادة للماوس CD11b بيركب / Cy5.5 (0.6 ميكروغرام / ميكرولتر التركيز النهائي في وسط رمي)، ومكافحة الماوس CD45 أبك / eFluor780 (0.6 ميكروغرام / ميكرولتر)، ومكافحة الفأر Ly6C أبك (2 ميكروغرام / ميكرولتر) ومكافحة الفأر Ly6G بي / Cy7 (2 ميكروغرام / ميكرولتر). تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لحماية الأجسام المضادة الفلورسنت من الضوء واحتضان الأنابيب في الثلاجة عند 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
ملاحظة: للحصول على تعويضات وصمة عار واحدة، وإعداد أنبوب السيطرة السلبية (لا وصمة عار) والأنابيب مع الخلايا المسمى منفردة مع كل من فلوروكروميس. للمساعدة في إعداد البوابة، وضوابط إيزوتيب يمكن استخدامها خاصة ل Ly6C (IgG2a) و Ly6G (IgG2b). - غسل الخلايا مرتين مع رمي المتوسطة وتدور لهم في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق و هيموسيتوميتr وتمييع لهم في 1 مل من رمي المتوسطة في 1 × 10 6 خلايا. قبل الفرز، ونقل العينات من خلال 5 مل، 70 ميكرون كاب غطاء أنبوب مصفاة. إضافة دابي (1 ميكروغرام / مل) كعلامة بقاء الخلية والمضي قدما في الفرز.
- لأن الضامة هي خلايا حساسة وهشة، تعيين ظروف الفرز إلى 20 رطل واستخدام 100 ميكرون حجم فوهة لعزل الضامة باستخدام وضع نقاء 4 في اتجاه.
- إعداد أنابيب جمع مع 1 مل من رمي المتوسطة في أنبوب البولي بروبلين 5 مل.
- باستخدام برنامج فارز فتح تجربة جديدة وحدد تجربة فارغة مع لوحة فارغة لتحديد الإعدادات.
- إعداد مؤامرة نقطة الذي يعرض إلى الأمام (فسك) مقابل ( مقابل ) مبعثر الجانب (سك) وبوابة على جميع الكريات البيض، باستثناء الحطام والتكتلات مع أدنى تشتت إلى الأمام والجانب. من هذه البوابة الأم، إنشاء مؤامرة نقطة جديدة تعرض سك مقابل دابي والبوابة على خلايا دابي.
- على هذا العدد الجديد من البوابات، أنشئ إعلاناالمؤامرة التي يعرض CD11b مقابل CD45 والبوابة على ضعف إيجابي (CD11b + CD45 + ) الضامة والعدلات.
- من هنا، إنشاء مؤامرة نقطة النهائية عرض Ly6C مقابل Ly6G وبوابة السكان المرغوبة: Ly6C مرحبا Ly6G - ، Ly6C لو Ly6G - ، و Ly6C إنت Ly6G + ( الشكل 2 ).
- بعد الفرز، تحقق من النقاء وقابلية الخلية (> 90٪) وتدور أنابيب جمع في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام الأزرق التريبان وكريات الدم و ريسوسبيند لهم في التركيز المطلوب (على سبيل المثال، 1 × 10 6 الضامة / مل) في المتوسطة رمي كاملة.
- لوحة 50 × 10 3 الضامة لكل بئر في لوحة 96-جيدا جولة القاع مع الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من المتوسطة رمي كاملة. ترك الخلايا دون عائق لمدة 24 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
4 - إيسولاتيوn من الخلايا T باستخدام الفرز خلية تنشيط مضان
ملاحظة: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / جن هو مرتبط X- تدق سلالة الماوس التي تشارك علامات الخلايا معربا عن الجين Foxp3 (فوركهيد مربع P3) مع بروتين فلوري أحمر أحادي (مرفب).
- تخدير والتضحية C57BL / 6 و C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2B) الفئران كما هو موضح سابقا في الخطوة 2.1. عزل الطحال والغدد الليمفاوية (لن: الأربية، قطني، أكسيلار، العضدية، وعنق الرحم) ووضعها بسرعة في المتوسطة رمي الجليد الباردة.
- من أجل عزل لن، ضع الماوس في موقف ضعيف، وجعل شق الجلد خط الوسط من أسفل إلى أعلى، وقطع بعناية البريتوني ونشر بلطف الجلد بعيدا. مرة واحدة يتم جمع كل الإربية، قطني، إبطي، العضدية، وعنق الرحم لن ( الشكل 1C ، الملونة باللون الأحمر)، وقطع الصفاق وعزل الطحال في الجانب الأيسر العلوي من القناة الهضمية.
- تصنيف الطحال و لن باستخدام مرشح 100 ميكرون وضعتعلى رأس أنبوب 50 مل. باستخدام المكبس من حقنة 1 مل، اضغط بلطف على الأنسجة. شطف مرشح مع المتوسطة رمي عدة مرات حسب الضرورة حتى أنها نظيفة.
ملاحظة: لن والطحال من كل الماوس يمكن تجميعها معا في نفس أنبوب. - تدور باستمرار في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الكرية في 2 مل من العازلة تحلل أك. مزيج جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إضافة 2 مل من رمي المتوسطة لتحييد العازلة تحلل. تدور باستمرار في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الخلية بيليه في 200 ميكرولتر من رمي المتوسطة ونقله إلى 5 مل البوليسترين أنبوب جولة القاع.
- وصمة عار لمكافحة الماوس CD4 أبك (0.6 ميكروغرام / ميكرولتر) و / أو المضادة للماوس CD8 PeCy7 (2 ميكروغرام / ميكرولتر). تغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم لحماية الأجسام المضادة الفلورسنت من الضوء، واحتضان الأنابيب في الثلاجة في 4 درجات مئوية لمدة 45 دقيقة.
ملاحظة: للحصول على تعويضات وصمة عار واحدة، وإعداد أنبوب التحكم السلبي (لا وصمة عار) وأنابيب مع خلايا المسمى منفردة مع كل من فلوروكروميس. - غسل الخلايا مرتين مع رمي المتوسطة وتدور لهم في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام الأزرق التريبان وكريات الدم.
ملاحظة: يتم توفير صبغ كفس كما كاربوكسيفلورسين دياسيتات سوتسينيميديل استر مسحوق عادة في 50 ميكروغرام. إضافة 18 ميكرولتر دمسو إلى قارورة من كفس لحل المخزون النهائي من 5 ملي وتخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. - ل كفس وضع العلامات، ريسوسبيند CD8 الملون الخلايا في تركيز تصل إلى 10 6 خلايا لكل مل في برنامج تلفزيوني في تركيز العمل النهائي من 5 ميكرومتر كفس من الحل الأسهم. احتضان لهم في حمام في 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق كما هو موضح سابقا 6 .
ملاحظة: (الخطوة الحرجة) للخلايا في تركيز منخفض (≤10 6 لكل مل)، فمن الضروري أن يتم وصف الخلايا في وجود البروتين وأضاف إلى العازلة الآثار السامة لل كفس. لذلك، يمكن أن تحتوي على بس 5٪ فبس. لاحظ أنه إذا كان لييستخدم ديوم، الأحماض الأمينية الحرة قد يقلل من كفاءة وضع العلامات من خلال التنافس على كفس. - تحييد كفس مع 2 مل من رمي المتوسطة. تدور في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إضافة 1 مل من رمي المتوسطة لكل 1 × 10 6 خلايا T8 CD8.
- قبل الفرز، ونقل العينة من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرون على غطاء أنبوب 5 مل. إضافة 50 ميكرولتر من 1X دابي (1 ميكروغرام / مل) كعلامة بقاء الخلية والمضي قدما في الفرز.
ملاحظة: 1x يعني 1: 1 نسبة الكاشف مع احترام المكونات الأخرى. - تعيين ظروف الفرز في 20 رطل و 100 ميكرون حجم فوهة لعزل مزدوج إيجابي CD8 + كفس + T الخلايا ( الشكل 3A ).
- إعداد أنابيب جمع مع 1 مل من رمي المتوسطة في أنبوب 5 مل البولي بروبيلين والمضي قدما في الفرز.
- باستخدام برنامج فارز فتح تجربة جديدة وحدد تجربة فارغة مع لوحة فارغة لتحديد الإعدادات.
- لعزلة الخلايا CD4 + T، إعداد نقطة مؤامرة التي ديسيلعب فسك مقابل سك والبوابة على الخلايا الليمفاوية، باستثناء الحطام وكذلك الخلايا الحبيبية الكبيرة، مثل الخلايا الجذعية.
- من هذه البوابة الأم، إنشاء مؤامرة نقطة جديدة تعرض سك مقابل دابي والبوابة على خلايا دابي.
- على هذا السكان بوابات حديثا، وخلق مؤامرة نقطة الذي يعرض سك مقابل CD4 لعزل جميع خلايا CD4 + ( الشكل 3B ). بدلا من ذلك، يمكن استخدام مضادة لمكافحة CD3 ماب لضمان عزل الخلايا خلية T النقي.
ملاحظة: يجب أن يكون جزء صغير من جميع خلايا CD4 + T (5-10٪) Foxp3 + مرفب + .
- بعد الفرز، تحقق من النقاء وقابلية الخلية (> 90٪) وتدور أنابيب جمع في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. عد الخلايا باستخدام الأزرق التريبان وكريات الدم. ريسوسبيند باستخدام 1 مل من متوسط رمي المتوسطة لكل 2X10 6 خلايا T.
- إعداد فحص قمع عن طريق زراعة الخلايا التائية مع الضامة فرزها سابقا. لوحة 10 × 10 4 سد4 + T و 10 × 10 4 CD8 + كفس + T الخلايا في نفس جيدا في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من المتوسطة رمي كاملة. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 لمدة 96 ساعة.
ملاحظة: تم استخدام الضامة والخلايا التائية في نسبة 1: 4. - تحفيز انقسام الخلايا T عن طريق غسل T خلية المنشط CD3 / CD28 الخرز المغناطيسي في 2 مل من برنامج تلفزيوني قبل استخدامها من أجل مسح العازلة التي تحتوي على أزيد. إضافة 5 ميكرولتر من الفئران T خلية المنشط CD3 / CD28 الخرز لكل بئر.
ملاحظة: الخرز المغناطيسية متشابهة في الحجم لخلايا تقديم مستضد ويقترن لمكافحة CD3 ومكافحة CD28 ماب، وتقدم طريقة بسيطة لتفعيل وتوسيع الخلايا التائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تظهر النتائج التمثيلية استراتيجية التبييض الموصوفة في البروتوكول أعلاه. النتائج أيضا عرض تحليل نشاط تكاثر الخلايا التائية بعد الثقافة المشتركة مع البلاعم التسلل الكسب غير المشروع. تم تحليل القدرة القمعية في المختبر من مجموعات فرعية بلعم في الشكل 4 . وتشير النتائج إلى أن Ly6C لو Ly6G - الضامة التي تم الحصول عليها من المتلقين المتسامحة هي قمعية. وتشير النتائج أيضا أن Ly6C إنت Ly6G + خلايا عرض قدرة قمعية متواضعة. فقط Ly6C لو Ly6G - تعزيز الخلايا توسيع CD4 + Foxp3 + تريغ في المختبر . معا، تدعم البيانات الاستنتاج أن الكسب غير المشروع التسلل CD11b + Ly6C لو Ly6G - الضامة تمتلك العديد من الخصائص ذكرت أن تترافق مع الخلايا الكابتة المستمدة الوحيدات 12 ، فيمما يدل على قدرتها على تثبيط CD8 T- تكاثر الخلايا 13 وتعزيز CD4 + Foxp3 + توسع تريغ 14 .
الشكل 1: نموذج الحيوان. ( A ) تم زرع البرق / ج قلوب (H2-د) في C57BL / 6 (H2-B) تماما خيفي كما هو موضح سابقا 10 . مفاغرة، من الوريد الأجوف المستلم والشريان الأورطي البطني مع الشريان الرئوي المانحة والشريان الأورطي الصاعد على التوالي، ويظهر. تم التعامل مع الفئران المتلقي مع 250 ميكروغرام من مضادة CD40L ماب (استنساخ MR1) لتحريض التسامح في أيام 0 و 2 و 4، كما ذكرنا مؤخرا 4 . ورصدت وظيفة الكسب غير المشروع كل يوم من قبل البطن الجس. تم تعريف الرفض على أنه وقف كامل لضربات القلب الواضحة، وتم التأكيد عليه من خلال التصور المباشر في فتح البطن. ( B ) صورة ممثل و ( C ) التوضيح من الموقع التشريحي لل لن والطحال (الملونة باللون الأحمر) والمزروع (الملونة باللون الأرجواني) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استراتيجية فرز بلعم. بدءا من الجزء العلوي الأيسر، الكريات البيض هي الأولى بوابات من حيث الحجم، ثم يتم تمييز الخلايا القميص من الحطام والتكتلات. من سينغليتس، يتم استبعاد الخلايا الميتة المباعدة على الجزء السلبي دابي. من الخلايا الحية، يستخدم CD45 + CD11b + لتحديد خلايا النخاعي. يتم تحديد ثلاثة خلايا النخاعي السكان أيضا على أساس Ly6C و Ly6G التعبير.= "_ بلانك"> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اللمفاويات استراتيجية الفرز. ممثل التدفق الخلوي النتائج لاستراتيجية اللمفاويات الفرز. من اليسار العلوي، بوابة على السكان اللمفاويات وفقا لالمبعثر إلى الأمام والجانب. استبعاد الحطام والكتل. من سينغليتس، يتم استبعاد الخلايا الميتة عن طريق النابضة على الجزء السلبي دابي. من الخلايا الحية، ( A ) CD8 + كفس + خلايا مزدوجة إيجابية و ( B ) جميع الخلايا CD4 + T، التي تحتوي على جزء من خلايا إيجابية + Foxp3 + . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
![الشكل 4]("/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg")
الشكل 4: فحص قمع. ( A ) في المختبر قدرة قمعية من كل مجموعة فرعية النخاعية. تم رصد CD8 + T- تكاثر الخلايا من قبل كفس التخفيف بعد 96 ساعة من الثقافة المشتركة مع مجموعات فرعية النخاعي. ( ب ) في المختبر توسع تريج من كل مجموعة فرعية النخاعي. تحليل التدفق الخلوي للتعبير Foxp3 على خلايا CD4 + T بعد 96 ساعة من شارك في الثقافة مع مجموعات فرعية النخاعي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يصف هذا البروتوكول الطرق المستخدمة في إمونوشاراكتيريز الكسب غير المشروع التسلل مجموعات فرعية النخاعي في نموذج الفئران التجريبية لزرع القلب، والذي ينطبق أيضا على الأنسجة الأخرى في نماذج تجريبية الفئران مختلفة. وكان الفرز المنخفض الضغط الخلية في 20 رطل لكل بوصة مربعة الطريقة المفضلة لعزل محصول جيد من مجموعات فرعية خلية نقية. الحفاظ على نقاء كل مجموعة فرعية النخاعي أمر حاسم لتحديد نتائج قاطعة من القدرة القمعية بين السكان النخاعي مختلفة. ومع ذلك، يمكن استخدام طرق أخرى لعزل السكان الكريات البيض المختلفة، مثل مجموعات الإثراء التجاري. بغض النظر عن السكان الخلية من الفائدة، مطلوب الحصول على تعليق خلية واحدة قابلة للحياة من الأنسجة المزروعة للحصول على أفضل تلطيخ السطح وتدفق الخلوي النتائج. قد يسبب التلاعب الأنسجة غير صحيح فقدان الخلايا، وبالتالي انخفاض العائد من مجموعات فرعية النخاعية. لزيادة العائد، تأكد من معالجة العينة شوالغناء المخازن المؤقتة الباردة والحفاظ على الخلايا في حاويات مع انخفاض الالتزام الخلايا (أنابيب البولي بروبلين). في هذا البروتوكول، استخدمنا كولاجيناز A من C. هستوليتيكوم ، والذي يستخدم على نطاق واسع لتصنيف أنواع كثيرة من الأنسجة (على سبيل المثال ، الرئة والقلب والعضلات والعظام والأدوية والكبد والكلى والغضروف والغدة الثديية والمشيمة والدم السفن، الدماغ، والورم). لمنع فقدان الخلايا أثناء الفرز، ينصح بشدة تحسين الأجسام المضادة وتوليد استراتيجية فعالة للابحار. في هذا البروتوكول، وصفنا الضامة الفئران باستخدام CD11b-بيركب / Cy5.5، CD45-أبك / eFluor780، Ly6C / أبك، و Ly6G بي / Cy7 الفلورسنت مترافق الأجسام المضادة والتدفق الخلوي. منذ إبيتوبيس Ly6c / g غير موجودة في الإنسان، مطلوب استخدام CD14 / CD15 / CD16 لفرز خلايا النخاع البشري 15 .
في تحليل التدفق الخلوي متعدد الألوان، قد تحدث تداخلات طيفية ممكنة من فلوروكروميس المختار. لذلك، كما لوحظ بفوإعادة، تعويضات وصمة عار واحدة هي مفيدة جدا لتجنب القضايا المتداخلة. وبالإضافة إلى ذلك، ينصح بشدة المعايرة الأجسام المضادة من أجل الحد من مضان الخلفية والحصول على أفضل النتائج. وهناك اعتبار هام آخر للحد من الربط غير المحدد هو استخدام الأصباغ البقاء. في هذا البروتوكول، يستخدم دابي كما صباغة البقاء. دابي (4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول) هو وصمة عار الفلورسنت الأزرق الذي يربط بقوة إلى المناطق الغنية بتكنولوجيا أت في الحمض النووي. الحد الأقصى الإثارة ل دابي ملزمة إلى الحمض النووي هو 358 نانومتر، والحد الأقصى الانبعاثات هو 461 نانومتر. عندما تستخدم وفقا للبروتوكول، دابي البقع نواة على وجه التحديد، مع القليل أو عدم وجود العلامات السيتوبلازمية، باستثناء الخلايا الميتة في تحليل التدفق. ومع ذلك، اعتمادا على لوحة من الأجسام المضادة المختارة، يمكن استخدام الأصباغ الجدوى الأخرى، مثل 7-أمينواكتينوميسين D (7-آد) و يوديد بروبيديوم (بي). الاستبعاد الدقيق للخلية الميتة وتحديد الخلية الحية هو شرط أساسي لنجاح رصد الخلايا التائية في المختبر ، كما هو إمبورتانت أن يكون الإجراءات التي يمكن أن تتبع انتشار الخلايا الليمفاوية مع الحد الأدنى من تعطيل لخلية الخلية وظيفة.
كما ذكر أعلاه، هناك خطوات حاسمة لتصنيف الخلايا وتحليلات الانتشار مع الأصباغ تتبع الخلية مثل كفس. وكمثال على ذلك وصف في الأدب، يجب إيلاء اهتمام دقيق لاستبعاد الخلايا الميتة / الموت من أجل الحصول على توزيعات موحدة وقمم ابنة مميزة عند استخدام كفس 16 . هناك العديد من الأصباغ تتبع الخلايا المتاحة تجاريا للاختيار من بينها، اعتمادا على لوحات تلطيخ. كبديل لأصباغ تتبع الخلية، يتم تنفيذ فحص ثيميدين تيتريتد لتقييم انتشار الخلايا الليمفاوية وغيرها من الخلايا في الدراسات السرطان 13 ، 14 . ثيميدين بروتوكولات التأسيس تقييم تكرار الحمض النووي خلال انقسام الخلايا عن طريق قياس راديولبلد 3H- أو 14C- ثيميدين. على الرغم من أن هذه الطريقة طs حساسة جدا وثابتة، وعيوب رئيسية لتقنية ثيميدين المعايرة هو أنه ينطوي على النشاط الإشعاعي ولا توفر المعلومات على مستوى الخلية واحدة. من ناحية أخرى، كفس تحليل التدفق الخلوي يوفر معلومات واضحة حول الاستجابة لمجموعات فرعية اللمفاويات ولها أقل التباين بين إنترالابوراتوري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
ونحن نعترف بالمساهمات التقنية من التدفق الخلوي، الجراحة المجهرية، والمستودع الحيوي / مراكز علم الأمراض التميز البحثي في جبل سيناء. وقد تم دعم هذا العمل من قبل العمل كوست BM1305: العمل على التركيز وتسريع العلاجات المسببة للحساسية الخلية (A فاكت)، وصندوق سيناي ريكاناتي / ميلر زرع النمو صناديق التنمية، وزيرة التنمية سي إنوفاسيون SAF2013-48834-R و SAF2016-80031-R JO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V.
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
