Summary
I macrofagi sono cellule plastiche del sistema ematopoietico che hanno un ruolo fondamentale nell'immunità protettiva e nell'omeostasi. In questa relazione, descriviamo tecniche ottimizzate in vitro per caratterizzare fenotipicamente e funzionalmente macrofagi regolatori infiltranti che si accumulano nell'organo trapiantato in condizioni tolerogene.
Abstract
L'accumulo di macrofagi negli organi trapiantati è da tempo riconosciuto come una caratteristica del rifiuto di allograft 1 . I monociti immunogenici infiltrano l'allograft presto dopo il trapianto, montano una risposta reattiva dell'innesto contro l'organo trapiantato e iniziano il rigetto dell'organo 2 . Recenti dati suggeriscono che i macrofagi soppressivi facilitano il successo del trapianto a lungo termine 3 e sono necessari per l'induzione della tolleranza al trapianto 4 . Ciò suggerisce un concetto multidimensionale di ontogenesi, attivazione e funzione dei macrofagi, che richiede una nuova tabella di marcia per l'isolamento e l'analisi della funzione macrofagi 5 . A causa della plasticità dei macrofagi, è necessario fornire una metodologia per isolare e caratterizzare i macrofagi, a seconda dell'ambiente tissutale, e per definire le loro funzioni secondo diversi scenari. Qui, abbiamo descriEssere un protocollo per la caratterizzazione immunitaria dei macrofagi infiltranti innestati e dei metodi che abbiamo usato per valutare funzionalmente la loro capacità di inibire la proliferazione CD8 + T e promuovere l'espansione di CD4 + Foxp3 + Treg in vitro .
Introduction
Questo protocollo descrive tecniche in vitro per studiare la funzione dei macrofagi infiltranti del tessuto isolati da allograft cardiaci, in base alla loro capacità di modulare le risposte delle cellule T. Ampiamente descritti in letteratura, i coloranti fluorescenti di monitoraggio delle cellule in combinazione con la citometria a flusso sono strumenti potenti per studiare la funzione soppressiva di specifici tipi di cellule in vitro e in vivo. Il nostro protocollo segue il metodo estere carbossfluoresceina succinimidile (CFSE) per il monitoraggio della proliferazione linfocitaria in vitro .
Quando una cellula etichettata con CFSE si divide, la sua progenie acquisisce la metà del numero di molecole taggate con carbossiofluoresceina 6 . La corrispondente diminuzione della fluorescenza cellulare mediante citometria a flusso può essere utilizzata per valutare la divisione cellulare, monitorando la capacità dei macrofagi soppressivi di modulare le risposte immunitarie delle cellule T. Dal momento che CFSE è un colorante a base fluoresceina, è compatibile con un brLa gamma di altri fluorochromi, rendendola applicabile alla citometria a flusso multi-colore. La scelta appropriata dei fluorochromi per la fenotipizzazione è altrettanto importante per evitare sovrapposizioni spettrali eccessive e l'incapacità di riconoscere cellule positive di anticorpi, in particolare con coloranti proteici visibili come CFSE 7 .
Ci sono molti vantaggi dell'uso di coloranti fluorescenti sulle tecniche alternative che misurano la proliferazione cellulare, come il test di incorporazione della timidina, che utilizza la timidina radiotestata (TdR) 8 . Questo saggio utilizza la timidina tritiata ( 3 H-TdR) che è incorporata in nuovi fili di DNA cromosomico durante la divisione cellulare mitotica. Una preoccupazione di sicurezza associata a questo test è l'uso di radioisotopi, in quanto viene utilizzato un beta-contatore di scintillazione per misurare la radioattività del DNA recuperato dalle cellule al fine di determinare l'entità della divisione cellulare. Metodologicamente, il culo timidina tritiatoAy non è abbastanza flessibile per soddisfare importanti vincoli di laboratorio clinico come il numero ridotto di celle e l'analisi ritardata dopo la colorazione. Al contrario, la colorazione CFSE ha dimostrato di prevenire la proliferazione cellulare e di interferire con marcatori di attivazione critici, come CD69, HLA-DR e CD25 9 . Pertanto, la comprensione dei vantaggi e delle limitazioni di ciascuna metodologia, in particolare negli studi multicolori in cui vengono utilizzati diversi coloranti per tenere traccia di tipi diversi di cellule, è fondamentale per ottenere risultati accurati e riproducibili.
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Protocol
In questo studio, i topi sono alloggiati in conformità con gli orientamenti degli Stati Uniti Dipartimento per l'Agricoltura e le raccomandazioni della Guida Sanitaria Pubblica Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutte le tecniche sperimentali che coinvolgono l'uso degli animali sono state eseguite in conformità con i protocolli approvati dal Comitato per la cura degli animali e di utilizzazione (IACUC) della Scuola di Medicina Monte Sinai.
1. Preparazione dei supporti
- Preparare il mezzo completo RPMI 1640 con 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina (10.000 U / mL) utilizzando 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato di sodio, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 5 mM HEPES e 0,05 mM 2 -mercaptoetanolo.
2. Isolamento di allograft e sospensione a cellule singole
NOTA: La tecnica di trapianto e anastomosi dell'arteria polmonare e della vena cava inferiore è stata descritta inizialmente da Corry e collaboratori e può essere visualizzata in Liu & KangS = "xref"> 10 , 11 ( Figura 1A ).
- Anestetizza un topo trapiantato con 4-5% di isoflurano in una camera di induzione. Sacrificarlo per dislocazione cervicale.
- Effettuare una incisione addominale mediana con forbici standard e rimuovere i contenuti addominali per localizzare l'aorta.
NOTA: Il cuore trapiantato sarà sul lato destro dell'adorto addominale ricevente ( Figura 1B ). - Estrarre l'innesto dolcemente con delle pinze fine-taglienti e metterlo immediatamente in un mezzo RPMI ghiacciato.
NOTA: Usando una forbice da chirurgia per separare l'innesto dall'aorta può danneggiare l'innesto e causare un certo tessuto a rimanere aderito al destinatario. - Dopo che tutti gli innesti sono stati raccolti, spostarli in una cappa di cultura sterile per l'elaborazione dei tessuti. Posizionare l'innesto in un piatto di Petri e tagliare il tessuto in piccoli pezzi (1 mm) utilizzando forbici sterili, scure e microchirurgiche.
- Con forc-sharp dentiEps, trasferire i pezzi in un tubo da 50 mL con 5 ml di collagenasi A (0,1 mg / mL collagenasi in sterile 1x PBS). Incubare per 1 h in un bagno di 37 ° C.
- Aggiungere 5 ml di mezzo RPMI per neutralizzare la collagenasi e trasferire il campione attraverso un filtro da 100 μm con l'aiuto dello stantuffo di una siringa da 1 ml.
- Spingere il campione a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Resuspendere il pellet in 1 mL di tampone di lisi ACK. Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 4 ° C.
- Aggiungere 1 mL di mezzo RPMI per neutralizzare il tampone di lisi e spinare il campione a 400 xg per 5 m a 4 ° C.
- Resuspendere il pellet di cellule in 200 μl di mezzo RPMI e trasferirlo in un tubo rotondo di 5 ml di polipropilene.
NOTA: I tubi in polipropilene supportano meno aderenza. Inoltre, mantenere le celle a bassa temperatura, ad esempio 4 ° C, riduce l'adesione.
3. Isolamento dei Macrofagi infiltranti mediante innesto mediante ordinamento delle cellule attivate mediante fluorescenzaing
- Bloccare il legame specifico indesiderato sulle cellule mieloide usando il bloccaggio del recettore Fc mAb (topo anti-mouse CD16 / 32). Aggiungere 1-2 μL per campione, 15 minuti prima della colorazione superficiale.
- Macellare con anti-mouse CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μL di concentrazione finale nel mezzo RPMI), anti-mouse CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μL), anti-mouse Ly6C APC (2 μg / E anti-mouse Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μL). Coprire i tubi con foglio di alluminio per proteggere gli anticorpi fluorescenti dalla luce e incubare i tubi in frigorifero a 4 ° C per 45 minuti.
NOTA: Per le compensazioni a singola macchia, preparare un tubo di controllo negativo (senza macchia) e tubi con celle etichettate singolarmente con ciascuno dei fluorochromi. Per facilitare l'installazione del cancello, i controlli isotipici possono essere utilizzati soprattutto per Ly6C (IgG2a) e Ly6G (IgG2b). - Lavare le cellule due volte con il mezzo RPMI e spingerle a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Conte le cellule usando tripan blu e un emocitometeR e diluirli in 1 mL di mezzo RPMI per 1 x 10 6 cellule. Prima di ordinare, trasferire i campioni attraverso un tappo di tubo da 5 ml e 70 μm. Aggiungere DAPI (1 μg / mL) come marcatore di vitalità cellulare e procedere per ordinare.
- Poiché i macrofagi sono cellule sensibili e fragili, impostare le condizioni di ordinamento a 20 psi e utilizzare una dimensione dell'ugello da 100 μm per isolare i macrofagi utilizzando una modalità di purezza a 4 vie.
- Preparare i tubi di raccolta con 1 mL di supporto RPMI in un tubo di 5 mL di polipropilene.
- Utilizzando il software di selezione, apri un nuovo esperimento e seleziona un esperimento vuoto con un pannello vuoto per definire le impostazioni.
- Impostare un tracciato a punti che visualizza il dispersione laterale (FSC) in avanti (contro) e la porta su tutti i leucociti, escludendo i detriti e le griglie con il più basso spostamento in avanti e laterali. Da questa porta padre, crea una nuova linea di punti che visualizza SSC vs DAPI e gate sulle celle DAPI.
- Su questa popolazione recente, creare annuncioOt che visualizza CD11b vs CD45 e gate su macrofagi e neutrofili doppio-positivi (CD11b + CD45 + ).
- Da qui crea un tracciato puntale finale che mostra Ly6C vs Ly6G e porta le popolazioni desiderabili: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - e Ly6C int Ly6G + ( Figura 2 ).
- Dopo l'ordinamento, controllare la purezza e la vitalità delle cellule (> 90%) e spinare i tubi di raccolta a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Conte le cellule utilizzando il blu di trypan ed un emocitometro e li resuscitano alla concentrazione desiderata ( ad esempio 1 x 10 6 macrofagi / mL) nel mezzo RPMI completo.
- Piastra 50 x 10 3 macrofagi per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti con un volume finale di 100 μL di mezzo RPMI completo. Lasciare le cellule indisturbate per almeno 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2 .
4. IsolationN delle cellule T usando la selezione delle cellule attivate con fluorescenza
NOTA: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn è un ceppo di topo bersaglio a bersaglio X che coinvolge le cellule che esprimono il gene Foxp3 (scatola a forchetta P3) con proteina fluorescente rossa monomerica (mRFP).
- Anestetizzare e sacrificare i topi C57BL / 6 e C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) come precedentemente descritto nel punto 2.1. Isolare la milza e linfonodi (LN: inguinale, lombare, ascellare, brachiale e cervicale) e posizionarli rapidamente in mezzo RPMI ghiacciato.
- Per isolare il LN, posizionare il mouse in posizione supina, effettuare una incisione cutanea da fondo a cima, tagliando con cura il peritoneo e spalmandola delicatamente. Una volta raccolti tutti i LN inguinali, lombari, ascellari, brachiali e cervicali ( figura 1C , colorati in rosso), tagliare il peritoneo e isolare la milza nella parte superiore sinistra dell'intestino.
- Disaggregare la milza e LN usando un filtro da 100 μm postoSopra un tubo da 50 ml. Usando lo stantuffo di una siringa da 1 ml, premere delicatamente il tessuto. Sciacquare il filtro con il supporto RPMI il più volte necessario fino a che non sia pulito.
NOTA: LN e milza di ciascun mouse possono essere raggruppati nello stesso tubo. - Spin giù a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Resuspendere il pellet in 2 mL di tampone di lisi ACK. Mescolare bene e incubare per 5 minuti a 4 ° C.
- Aggiungere 2 mL di mezzo RPMI per neutralizzare il tampone di lisi. Spin giù a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Resuspendere il pellet di cellule in 200 μl di mezzo RPMI e trasferirlo in un tubo rotondo da 5 ml di polistirolo.
- Carteggiare per anti-mouse CD4 APC (0,6 μg / μL) e / o anti-mouse CD8 PeCy7 (2 μg / μL). Coprire i tubi con foglio di alluminio per proteggere gli anticorpi fluorescenti dalla luce e incubare i tubi in frigorifero a 4 ° C per 45 minuti.
NOTA: Per compensazioni a singola macchia, preparare un tubo di controllo negativo (senza macchia) eTubi con cellule etichettate singolarmente con ciascuno dei fluorochromi. - Lavare le cellule due volte con il mezzo RPMI e spingerle a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Contare le cellule usando il blu di trypan ed un emocitometro.
NOTA: il colorante CFSE è fornito come polvere di carbossiofluoresceina diacetato succinimidil estere in genere a 50 μg. Aggiungere 18 μl di DMSO in una fiala di CFSE per una soluzione di riserva finale di 5 mM e conservare a -20 ° C per diversi mesi. - Per l'etichettatura CFSE, risospendere le cellule macchiate CD8 ad una concentrazione fino a 10 6 cellule per ml in PBS a una concentrazione di lavoro finale di 5 μM CFSE dalla soluzione di riserva. Incubare in un bagno a 20 ° C per 5 minuti come descritto in precedenza 6 .
NOTA: (STEP CRITICO) Per le cellule a bassa concentrazione (≤10 6 per ml), è essenziale che le cellule siano etichettate in presenza di proteine aggiunte per buffer degli effetti tossici di CFSE. Pertanto PBS può contenere il 5% di FBS. Notate che se meDium è usato, gli amminoacidi liberi possono abbassare l'efficacia di etichettatura competendo per CFSE. - Neutralizzare il CFSE con 2 mL di mezzo RPMI. Spin a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aggiungere 1 mL di mezzo RPMI per 1 x 10 6 cellule T CD8.
- Prima di ordinare, trasferire il campione attraverso un filtro cellulare da 70 μm su un tappo da 5 ml. Aggiungere 50 μl di 1x DAPI (1 μg / mL) come marcatore di vitalità cellulare e procedere alla selezione.
NOTA: 1x significa 1: 1 rapporto del reagente rispetto ad altri costituenti. - Impostare le condizioni di ordinamento a 20 psi e 100 μm di ugello per isolare le cellule CD8 + CFSE + T a doppio positivo ( Figura 3A ).
- Preparare i tubi di raccolta con 1 ml di supporto RPMI in un tubo di 5 ml di polipropilene e procedere alla loro ordinazione.
- Utilizzando il software di selezione, apri un nuovo esperimento e seleziona un esperimento vuoto con un pannello vuoto per definire le impostazioni.
- Per l'isolamento delle cellule CD4 + T, impostare un grafico a punti che disGioca il FSC vs SSC e la porta sui linfociti, escludendo i detriti e le grandi cellule granulari, come le cellule dendritiche.
- Da questa porta padre, crea una nuova linea di punti che visualizza SSC vs DAPI e gate sulle celle DAPI.
- Su questa popolazione recente, creare un plot di punti che visualizza SSC vs CD4 per isolare tutte le cellule CD4 + ( Figura 3B ). In alternativa, un mAb anti-CD3 può essere utilizzato per assicurare l'isolamento delle popolazioni di cellule T puro.
NOTA: Una piccola frazione di tutte le cellule CD4 + T (5-10%) dovrebbe essere Foxp3 + mRFP + .
- Dopo l'ordinamento, controllare la purezza e la vitalità delle cellule (> 90%) e spinare i tubi di raccolta a 400 xg per 5 minuti a 4 ° C. Contare le cellule usando il blu di trypan ed un emocitometro. Resuspendere usando 1 mL di mezzo RPMI completo per 2x106 T cellule.
- Impostare il saggio di soppressione coltivando le cellule T con macrofagi precedentemente ordinati. Piatto 10 x 10 4 CD4 + T e 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T cellule nello stesso pozzetto in un volume finale di 100 μL di mezzo RPMI completo. Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 96 h.
NOTA: Macrofagi e cellule T sono stati utilizzati in un rapporto 1: 4. - Stimolare la divisione delle cellule T mediante lavaggio di branelli magnetici CD3 / CD28 dell'attivatore cellulare T in 2 ml di PBS prima di utilizzarli per eliminare il tampone contenente azide. Aggiungere 5 μl di mouse CD3 / CD28 per cellula-attivazione T cellula per pozzetto.
NOTA: Le perle magnetiche sono di dimensioni simili alle celle presentanti antigene e sono accoppiate a mAb anti-CD3 e anti-CD28, offrendo un metodo semplice per l'attivazione e l'espansione delle cellule T.
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Representative Results
I risultati rappresentativi mostrano la strategia di gating descritta nel precedente protocollo. I risultati mostrano anche l'analisi dell'attività di proliferazione delle cellule T dopo la co-cultura con macrofagi infiltranti innestati. La capacità suppressiva in vitro dei sottoinsiemi macrofagi è stata analizzata in Figura 4 . I risultati indicano che i macrofagi Ly6C lo Ly6G ottenuti da riceventi tollerati sono soppressivi. I risultati indicano inoltre che le cellule Ly6C int Ly6G + presentano una modesta capacità di soppressione. Solo le cellule Ly6C lo Ly6G hanno promosso l'espansione di CD4 + Foxp3 + Treg in vitro . Insieme, i dati supportano la conclusione che i macrofagi CD11b + Ly6C lo Ly6G infiltranti innestati posseggono molte delle proprietà riportate per essere associate a cellule soppressori derivate da monociti 12 , inComprendente la loro capacità di inibire la proliferazione delle cellule T CD8 e di promuovere l'espansione CD4 + Foxp3 + Treg 14 .
Figura 1: modello animale. ( A ) I cuori di Balb / c (H2-d) sono stati trapiantati in C57BL / 6 completamente allogenico (H2-b) come descritto in precedenza 10 . Viene mostrata l'anastomosi, la vena di cava del destinatario e l'aorta addominale con l'arteria polmonare del donatore e l'aorta ascendente. I topi riceventi sono stati trattati con 250 μg di anti-CD40L mAb (clone MR1) per l'induzione di tolleranza nei giorni 0, 2 e 4, come abbiamo recentemente riportato 4 . La funzione di innesto veniva controllata ogni giorno con la palpazione addominale. Il rifiuto è stato definito come cessazione completa di un battito cardiaco palpabile ed è stato confermato dalla visualizzazione diretta a laparotomia. ( B ) Immagine rappresentativa e ( C ) illustrazione della posizione anatomica di LN e milza (colorata in rosso) e allograft (colorato in viola) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di selezione dei macrofagi. Partendo dalla sinistra superiore, i leucociti vengono prima gated per dimensione e quindi le singole cellule sono discriminate da detriti e grumi. Dalle singole, le cellule morte sono escluse dalla gating sulla frazione negativa DAPI. Dalle cellule vive, CD45 + CD11b + viene usato per identificare le cellule mieloide. Le tre popolazioni di cellule mieloide sono ulteriormente identificate sulla base di Ly6C e Ly6G espressione.= "_ Blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Strategia di classificazione dei linfociti. Risultati della citometria a flusso rappresentativo per la strategia di classificazione dei linfociti. Dalla sinistra in alto, porta sulla popolazione linfocitaria in base allo spargimento in avanti e laterale. Escludere detriti e grumi. Dalle singole, le cellule morte sono escluse dal gating sulla frazione negativa DAPI. Dalle cellule vive, ( A ) le cellule CD8 + CFSE + doppi positive e ( B ) tutte le cellule CD4 + T, che contengono una frazione di cellule Foxp3 + positive, sono gated. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
![Figura 4]("/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg")
Figura 4: Saggio di soppressione. ( A ) Capacità suppressiva in vitro di ogni sottoinsieme mieloide. La proliferazione delle cellule T CD8 + è stata monitorata dalla diluizione CFSE dopo 96 ore di co-coltura con sottosistemi myeloidi. ( B ) Espansione in vitro di Treg di ogni sottoinsieme mieloide. Analisi della citometria di flusso dell'espressione di Foxp3 sulle cellule CD4 + T dopo 96 ore di co-coltura con sottoinsiemi mieloidi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo descrive i metodi che abbiamo usato per immunocharacterizzare le sottostazioni di cellule mieloide infiltrando l'innesto in un modello sperimentale murino del trapianto di cuore, che è applicabile anche ad altri tessuti in diversi modelli sperimentali murini. La selezione di celle a bassa pressione a 20 psi è il metodo preferito per isolare una buona resa di sottogruppi di cellule pura. Il mantenimento della purezza di ogni sottoinsieme mieloide è fondamentale per stabilire risultati concreti della capacità soppressiva tra le diverse popolazioni mieloide. Tuttavia, altri metodi possono essere utilizzati per l'isolamento di varie popolazioni di leucociti, come i kit di arricchimento commerciale. Indipendentemente dalla popolazione cellulare interessata, è necessario ottenere soluzioni sperimentali singole cellule dal tessuto trapiantato per ottenere una ottimale colorazione delle superfici e risultati della citometria a flusso. La manipolazione non corretta del tessuto può causare la perdita di cellule e quindi una scarsa resa di sottoinsiemi mieloidi. Per aumentare la resa, assicurati di elaborare il campione uCantare i tamponi freddi e mantenere le celle in contenitori con aderenza a bassa cella (tubi in polipropilene). In questo protocollo abbiamo usato la collagenasi A da C. histolyticum , ampiamente utilizzata per la disaggregazione di molti tipi di tessuti ( es . Polmone, cuore, muscolo, osso, adiposo, fegato, rene, cartilagine, ghiandola mammaria, placenta, sangue Vaso, cervello e tumore). Per evitare la perdita di cellule durante l'ordinamento, è altamente raccomandato ottimizzare gli anticorpi e generare una strategia di gating efficiente. In questo protocollo abbiamo caratterizzato i macrofagi murini utilizzando anticorpi fluorescenti concomitati con CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, Ly6C / APC e Ly6G Pe / Cy7 e citometria a flusso. Poiché gli epitopi Ly6C / G non esistono nell'uomo, è necessario utilizzare CD14 / CD15 / CD16 per l'ordinamento delle cellule mieloide umane 15 .
Nell'analisi della citometria a flusso multicolore si possono verificare sovrapposizioni spettrali dei fluorochromi scelti. Pertanto, come notato befoLe compensazioni a singolo macchia sono molto utili per evitare problemi di sovrapposizione. Inoltre, è altamente raccomandata la titolazione degli anticorpi al fine di ridurre la fluorescenza di fondo e ottenere risultati ottimali. Un'altra considerazione importante per ridurre il legame non specifico è l'uso di coloranti di vitalità. In questo protocollo, DAPI viene utilizzato come colorante di vitalità. DAPI (4 ', 6-diammino-2-fenilindolo) è una macchia blu fluorescente che si lega fortemente alle regioni ricche di AT nel DNA. Il massimo di eccitazione per DAPI legato al DNA è di 358 nm e il massimo di emissione è di 461 nm. Se usato secondo il protocollo, DAPI macchia i nuclei in modo specifico, con poco o nessun etichettatura citoplasmatica, escludendo le cellule morte nell'analisi di flusso. Tuttavia, a seconda del pannello di anticorpi scelti, possono essere utilizzati altri coloranti di vitalità, quali 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) e propidium ioduro (PI). L'esclusione precisa delle cellule staminali e l'identificazione delle cellule staminali è un presupposto per monitorare con successo le cellule T in vitro , in quanto è importanteTante per avere procedure che possano seguire la proliferazione linfocitaria con una minima interruzione della vitalità e della funzionalità delle cellule.
Come accennato in precedenza, ci sono fasi critiche per l'analisi delle cellule e le analisi di proliferazione con coloranti di monitoraggio delle cellule come CFSE. Come esempio descritto in letteratura, un'attenta attenzione deve essere prestata all'esclusione di cellule morte / morire al fine di ottenere distribuzioni uniformi e picchi figlia distinti quando si utilizza CFSE 16 . Ci sono molti coloranti di tracciamento delle celle disponibili in commercio, tra cui scegliere, a seconda dei pannelli di colorazione. In alternativa alle coloranti di monitoraggio delle cellule, vengono effettuati saggi titolati in timidina per valutare la proliferazione dei linfociti e altre cellule negli studi sul cancro 13 , 14 . I protocolli di incorporazione della timidina valutano la replicazione del DNA durante la divisione cellulare mediante la misura della timidina 3H- o 14C. Anche se questo metodo iI più gravi svantaggi per la tecnica titolata titolata è che coinvolge la radioattività e non fornisce informazioni a livello di singola cellula. D'altra parte, l'analisi della citometria a flusso CFSE fornisce informazioni chiare sul rispondere ai sottogruppi di linfociti e ha meno variabilità inter-e intralaboratoria.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
Riconosciamo i contributi tecnici dei centri di flusso, della microchirurgia e dei centri di bio-repository / patologia dell'esperienza di ricerca sul Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto dalla COST Action BM1305: Azione per focalizzare e accelerare le terapie tollerogeniche delle cellule (A FACTT), i fondi per lo sviluppo dello Istituto di trapianto di Mount Sinai Recanati / Miller, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R e SAF2016-80031-R JO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
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