Summary
マクロファージは、防御免疫およびホメオスタシスにおいて決定的な役割を果たす造血系のプラスチック細胞である。この報告では、寛容原性条件下で移植臓器に蓄積する移植片浸潤調節マクロファージの表現型および機能的特徴付けのための最適化されたインビトロ技術を記載する。
Abstract
移植臓器におけるマクロファージの蓄積は、同種移植拒絶1の特徴として長い間認識されてきた1 。免疫原性単球は、移植後早期に同種移植に浸潤し、移植された器官に対する移植片反応性反応を起こし、臓器拒絶反応を開始する2 。最近のデータは、抑制性マクロファージが長期移植の成功を促進し、移植寛容の誘導に必要であることを示唆している4 。これは、マクロファージ機能の単離および解析のための新しいロードマップを必要とする、マクロファージの個体発生、活性化、および機能の多次元概念を示唆している5 。マクロファージの可塑性のために、組織環境に応じてマクロファージを単離し、特徴づけ、異なるシナリオに従ってその機能を定義する方法論を提供することが必要である。ここでは、グラフト浸潤マクロファージの免疫学的特性決定のためのプロトコルであり、我々がCD8 + T増殖を阻害し、インビトロで CD4 + Foxp3 + Treg増殖を促進する能力を機能的に評価するために使用した方法である。
Introduction
このプロトコルは、心臓同種移植片から単離された組織浸潤マクロファージの機能を、T細胞応答を調節するそれらの能力に従って研究するためのインビトロ技術を記載する。文献に広く記載されているように、フローサイトメトリーと組み合わせた蛍光細胞追跡色素は、インビトロおよびインビボでの特定の細胞型の抑制機能を研究する強力なツールである。我々のプロトコルは、インビトロでリンパ球増殖をモニターするためのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）法に従う。
CFSE標識細胞が分裂すると、その子孫はカルボキシフルオレセイン標識分子の半分の数を獲得する6 。フローサイトメトリーによる細胞蛍光の対応する減少を用いて、T細胞免疫応答を調節するための抑制性マクロファージの能力をモニターして、細胞分裂を評価することができる。 CFSEはフルオレセインベースの色素であるため、それはbr多色フローサイトメトリーに適用できるようにする。過剰なスペクトルの重複および抗体陽性細胞、特にCFSE7のような可視タンパク質色素を認識できないことを避けるために、表現型決定のための蛍光色素の適切な選択もまた重要である。
放射性標識チミジン（TdR） 8を使用するチミジン取り込みアッセイのような、細胞増殖を測定する別の技術よりも蛍光色素を用いることの多くの利点がある。このアッセイは、有糸分裂細胞分裂中に染色体DNAの新しい鎖に組み込まれるトリチウム化チミジン（ 3 H-TdR）を利用する。細胞分裂の程度を決定するために、細胞から回収されたDNA中の放射能を測定するために、シンチレーションベータカウンターが使用されるので、このアッセイに関連する安全性の懸念は放射性同位体の使用である。方法論的には、トリチウム化チミジン尻細胞の数が少なく、染色後に分析が遅れるなど、重要な臨床検査室の制約条件を満たすほど柔軟ではありません。これとは対照的に、CFSE染色は、細胞増殖を防止し、CD69、HLA-DRおよびCD25などの重要な活性化マーカーを妨害することが示されている。したがって、それぞれの方法論の利点と限界を理解することは、特に、異なる細胞タイプを追跡するために複数の色素が使用される多色検査では、正確で再現性のある結果を得るために重要です。
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Protocol
この研究では、マウスは、米国農務省のガイドラインおよび実験動物のケアおよび使用のための公衆衛生サービスガイドの勧告に従って収容されている。動物使用を含むすべての実験的技術は、Mount Sinai School of MedicineのIACUC（Institutional Animal Care and Utilization Committee）承認プロトコールに従って実施した。
1.メディアの準備
- 2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、0.1mMの非必須アミノ酸、5mMのHEPESおよび0.05mMの2mM EDTAを用いて、10％FBSおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシン（10,000U / mL）を含む完全RPMI 1640培地を調製する。 - メルカプトエタノール。
2.同種移植および単細胞懸濁液
注：肺動脈および下大静脈の移植および吻合技術は、最初にCorryおよび共同研究者によって記述され、Liu＆Kangs = "xref"> 10,11（ 図1A ）。
- 誘導チャンバー内で4-5％イソフルランで移植マウスを麻酔する。頚椎脱臼によってそれを犠牲にする。
- 標準的なはさみで正中線の腹部切開を行い、大動脈を局所化するために腹部の内容物を取り除く。
注：移植された心臓は、レシピエントの腹部大動脈の右側にあります（ 図1B ）。 - 微細な鋭い鉗子を使用してグラフトを静かに引き出し、すぐに氷冷RPMI培地に入れる。
注：手術用ハサミを使用して大動脈から移植片を分離すると、移植片に損傷を与え、一部の組織が被移植者に付着したままになります。 - すべての移植片が収集された後、それらを組織処理用の無菌培養フードに移す。ペトリ皿に移植片を置き、滅菌した鈍いマイクロサージェリーハサミを使用して組織を小さな片（1 mm）に刻みます。
- 鋭い歯のforcで5mLのコラゲナーゼA（滅菌1×PBS中の0.1mg / mLコラゲナーゼ）を含む50mLチューブに移す。 37℃の浴中で1時間インキュベートする。
- コラゲナーゼを中和するために5mLのRPMI培地を添加し、1mLシリンジのプランジャの助けを借りて100μmのストレーナにサンプルを移す。
- 4℃で400 xgで5分間サンプルをスピンダウンします。
- ペレットを1mLのACK溶解バッファーに再懸濁する。よく混合し、4℃で5分間インキュベートする。
- 溶解緩衝液を中和するために1mLのRPMI培地を添加し、4℃で5分間400xgでサンプルを回転させます。
- 200μLのRPMI培地に細胞ペレットを再懸濁し、5mLポリプロピレン丸底チューブに移す。
注：ポリプロピレンチューブの接着性は低く抑えられています。また、細胞を4℃などの低温で維持すると、接着性が低下する。
3.蛍光活性化細胞を用いたグラフト浸潤マクロファージの単離ing
- Fc受容体ブロッキングmAb（ラット抗マウスCD16 / 32）を用いて骨髄細胞上の望ましくない特異的結合をブロックする。表面染色の15分前に1サンプルあたり1〜2μLを加える。
- 抗マウスCD45 APC / eFluor780（0.6μg/μL）、抗マウスLy6C APC（2μg/μL）、抗マウスCD11b Percp / Cy5.5（RPMI培地中0.6μg/μL最終濃度）抗マウスLy6G Pe / Cy7（2μg/μL）を添加した。チューブをアルミホイルで覆い、蛍光抗体を光から保護し、チューブを4℃の冷蔵庫で45分間インキュベートする。
注：一重染色補正のために、ネガティブコントロールチューブ（染色なし）と各蛍光色素で単独で標識された細胞を含むチューブを準備する。ゲートのセットアップを助けるために、アイソタイプコントロールは、特にLy6C（IgG2a）およびLy6G（IgG2b）に使用することができる。 - RPMI培地で細胞を2回洗浄し、4℃で400 xgで5分間回転させます。トリパンブルーと血球計算機を使用して細胞を数える1×10 6細胞あたり1mLのRPMI培地で希釈する。選別する前に、サンプルを5 mL、70μmセルストレーナチューブキャップに移します。細胞生存マーカーとしてDAPI（1μg/ mL）を添加し、選別に進む。
- マクロファージは敏感で脆弱な細胞であるため、ソート条件を20 psiに設定し、100μmのノズルサイズを使用して4方向純度モードを使用してマクロファージを単離します。
- 5 mLのポリプロピレンチューブに1 mLのRPMI培地で採取チューブを準備する。
- ソーターソフトウェアを使用して新しい実験を開き、ブランクパネルで空白実験を選択して設定を定義します。
- 前方散乱（FSC）対（ 対 ）サイド散乱（SSC）を表示し、すべての白血球上のゲートを表示するドットプロットを設定します。この親ゲートから、SSC 対 DAPIとDAPIセルのゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。
- この新たにゲートされた人口で、広告を作成するCD11b 対 CD45を示し、二重陽性（CD11b + CD45 + ）マクロファージおよび好中球のゲートを示す。
- ここから、Ly6C 対 Ly6Gを表示し、望ましい集団：Ly6C hi Ly6G - 、Ly6C lo Ly6G - 、およびLy6C int Ly6G +を示す最終ドットプロットを作成する（ 図2 ）。
- 選別後、純度と細胞生存率（> 90％）を確認し、コレクションチューブを400 xgで5分間4℃で回転させます。トリパンブルーと血球計を用いて細胞を計数し、それらを完全RPMI培地中で所望の濃度（ 例えば、 1×10 6マクロファージ/ mL）で再懸濁する。
- 完全RPMI培地100μLの最終容量を有する96ウェル丸底プレート中のウェル当たり50×10 3個のマクロファージをプレートに添加する。 37℃、5％CO 2で 24時間以上放置する。
4. Isolatio蛍光活性化細胞選別を用いたT細胞数の測定
注意：C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jnは、Foxp3（フォークヘッドボックスP3）遺伝子を発現する細胞を単量体赤色蛍光タンパク質（mRFP）で同時標識するX連鎖標的化ノックインマウス株である。
- ステップ2.1で前述したように、C57BL / 6およびC57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J（H-2b）マウスを麻酔し、犠牲にする。脾臓およびリンパ節（LN：鼠径部、腰部、腋窩、上腕および頚部）を単離し、それらを氷冷RPMI培地に迅速に入れる。
- LNを単離するためには、マウスを仰臥位に置き、中線の皮膚を下から上に切開し、慎重に腹膜を切開し、穏やかに皮膚を広げる。すべての鼠径部、腰部、腋窩、上腕、および頚部のLNが収集されると（ 図1C 、赤色に着色）、腹膜を切断し、腸の左上側の脾臓を単離する。
- 100μmのフィルターを使用して脾臓およびLNを分解する50mLのチューブの上に置いた。 1 mLシリンジのプランジャーを使用して、組織を静かに押します。フィルターがきれいになるまで、必要な回数RPMI培地でフィルターをすすいでください。
注：各マウスのLNと脾臓を同じチューブに一緒にプールすることができます。 - 4℃で400 xgで5分間スピンダウンします。
- ペレットを2mLのACK溶解バッファーに再懸濁する。よく混合し、4℃で5分間インキュベートする。
- 2mLのRPMI培地を加えて溶解バッファーを中和する。 4℃で400 xgで5分間スピンダウンします。
- 200μLのRPMI培地に細胞ペレットを再懸濁し、5mLポリスチレン丸底チューブに移す。
- 抗マウスCD4 APC（0.6μg/μL）および/または抗マウスCD8 PeCy7（2μg/μL）の染色。チューブをアルミホイルで覆い、蛍光抗体を光から保護し、チューブを4℃の冷蔵庫で45分間インキュベートする。
注：一重染色補正のために、ネガティブコントロールチューブ（染色なし）を準備し、蛍光色素の各々を単独で標識した細胞を有するチューブ。 - RPMI培地で細胞を2回洗浄し、4℃で400 xgで5分間回転させます。トリパンブルーと血球計を用いて細胞を数える。
注：CFSE色素は、通常50μgのカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル粉末として提供される。最終的なストック溶液が5mMになるように18μLのDMSOをCFSEのバイアルに加え、数ヶ月間-20℃で保存する。 - CFSEラベリングのために、ストック溶液からの5μMのCFSEの最終作業濃度で、PBS中のmL当たり10 6細胞までの濃度でCD8染色細胞を再懸濁する。前述の6のように20℃の浴中で5分間インキュベートする。
注：（重大なステップ）低濃度（≦10 6 / mL）の細胞では、CFSEの毒性効果を緩衝するために、添加されたタンパク質の存在下で細胞を標識することが不可欠である。したがって、PBSは5％FBSを含むことができる。私が遊離アミノ酸はCFSEと競合することにより標識効率を低下させる可能性がある。 - 2mLのRPMI培地でCFSEを中和する。 4℃で400 xgで5分間スピンします。 1×10 6 CD8 T細胞あたり1mLのRPMI培地を加える。
- 選別する前に、サンプルを70μmセルストレーナーに5 mLチューブキャップで移します。細胞生存マーカーとして50μLの1×DAPI（1μg/ mL）を添加し、ソーティングに進みます。
注：1xは、他の構成成分に対する試薬の1：1の比率を意味する。 - 20psiおよび100μmノズルサイズでソート条件を設定して、二重陽性CD8 + CFSE + T細胞を単離する（ 図3A ）。
- 5 mLのポリプロピレンチューブにRPMI培地1 mLを含む採取チューブを準備し、分取に進んでください。
- ソーターソフトウェアを使用して新しい実験を開き、ブランクパネルで空白実験を選択して設定を定義します。
- CD4 + T細胞の分離のために、破片および樹状細胞などの大きな顆粒細胞を除くリンパ球上のFSC対SSCおよびゲートを果たす。
- この親ゲートから、SSC対DAPIとDAPIセルのゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。
- この新たにゲートされた集団で、すべてのCD4 +細胞を単離するためにSSC対CD4を示すドットプロットを作成する（ 図3B ）。あるいは、抗CD3 mAbを使用して、純粋なT細胞集団の単離を確実にすることができる。
注：すべてのCD4 + T細胞（5〜10％）のごく一部はFoxp3 + mRFP +でなければなりません。
- 選別後、純度と細胞生存率（> 90％）を確認し、コレクションチューブを400 xgで5分間4℃で回転させます。トリパンブルーと血球計を用いて細胞を数える。 2×10 6個の T細胞あたり1mLの完全RPMI培地を用いて再懸濁する。
- 予め選別したマクロファージでT細胞を培養することにより抑制アッセイを設定する。プレート10 x 10 4 CD4 + Tおよび10×10 4個の CD8 + CFSE + T細胞を、完全RPMI培地100μLの最終容量で同じウェルに添加した。 37℃、5％CO 2で96時間インキュベートする。
注：マクロファージおよびT細胞は1：4の比で使用された。 - アジド含有バッファーを除去するために使用する前に、2mLのPBS中でT細胞活性化剤CD3 / CD28磁性ビーズを洗浄することによってT細胞分裂を刺激する。 1ウェルあたり5μLのマウスT細胞活性化因子CD3 / CD28ビーズを添加する。
注：磁気ビーズは、抗原提示細胞とサイズが類似しており、抗CD3および抗CD28 mAbに結合し、T細胞の活性化および増殖のための簡単な方法を提供する。
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Representative Results
代表的な結果は、上記のプロトコルで説明されているゲーティング戦略を示しています。結果はまた、移植片浸潤マクロファージとの共培養後のT細胞増殖活性の分析を示す。マクロファージサブセットのin vitro抑制能力を図4で分析した。結果は、寛容化されたレシピエントから得られたLy6C lo Ly6G -マクロファージが抑制的であることを示す。この結果はまた、Ly6C int Ly6G +細胞が適度な抑制能力を示すことを示す。 Ly6C lo Ly6G -細胞のみがin vitroで CD4 + Foxp3 + Tregの増殖を促進した 。一緒になって、このデータは、移植片浸潤CD11b + Ly6C lo Ly6G -マクロファージが、単球由来サプレッサー細胞12に関連すると報告されている多くの特性を有するという結論を支持する。CD8 T細胞増殖を阻害する能力およびCD4 + Foxp3 + Treg増殖を促進する能力を除外する14 。
図1：動物モデル。 （ A ）Balb / cハート（H2-d）を、以前に記載されたように、完全同種異系C57BL / 6（H2-b）に移植した。ドナーの肺動脈および上行大動脈をそれぞれ有するレシピエントの大静脈および腹部大動脈の吻合が示されている。本発明者らが最近報告したように、レシピエントマウスを250μgの抗CD40L mAb（クローンMR1）で0日目、2日目および4日目の寛容誘導について処置した。グラフト機能は、腹部触診によって隔日でモニターされた。拒絶は、触知可能な心拍の完全な停止と定義され、直接視覚化によって確認された開腹手術。 （ B ）代表画像および（ C ）LNおよび脾臓（赤色）および同種移植片（紫色）の解剖学的位置の図この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
図2：マクロファージ選別戦略。左上から始めて、白血球を最初にゲーティングした後、一重項細胞を破片および塊から区別する。シングレットから、死んだ細胞は、DAPI陰性画分をゲーティングすることから排除される。生存細胞から、CD45 + CD11b +を用いて骨髄細胞を同定する。 3つの骨髄細胞集団は、Ly6CおよびLy6G発現に基づいてさらに同定される。= "_ blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：リンパ球選別戦略。リンパ球選別戦略の代表的なフローサイトメトリーが得られます。左上から順方向および側方散乱に従ってリンパ球集団上のゲート。破片や塊を除外する。シングレットから、死んだ細胞は、DAPI陰性画分をゲーティングすることによって除外される。生きた細胞から、（ A ）CD8 + CFSE +二重陽性細胞および（ B ）Foxp3 +陽性細胞の画分を含むすべてのCD4 + T細胞がゲートされる。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
![図4]("/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg")
図4：抑制アッセイ。 （ A ）各骨髄性サブセットのin vitro抑制能力。 CD8 + T細胞増殖を、骨髄性サブセットとの共培養の96時間後のCFSE希釈によってモニターした。 （ B ）各骨髄サブセットのインビトロ Treg拡大。ミエロイドサブセットとの共培養の96時間後のCD4 + T細胞におけるFoxp3発現のフローサイトメトリー分析。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、異なるネズミ実験モデルの他の組織にも適用可能な、実験的なネズミ移植モデルの移植片浸潤骨髄細胞サブセットを免疫学的に特性化するために使用した方法を記載している。純粋な細胞サブセットの良好な収率を単離するためには、20psiでの低圧細胞ソーティングが好ましい方法でした。異なる骨髄集団間の抑制能力の決定的な結果を確立するためには、各骨髄サブセットの純度を維持することが重要である。しかし、市販の濃縮キットのような様々な白血球集団の単離のために、他の方法を使用することができる。関心のある細胞集団にかかわらず、最適な表面染色およびフローサイトメトリー結果のために、移植組織から生存可能な単一細胞懸濁液を得ることが必要である。不正確な組織操作は、細胞喪失を引き起こし、したがって、骨髄サブセットの収率が低い可能性がある。収量を増やすには、サンプルuを処理してください冷たいバッファーを歌い、低い細胞接着性を有する容器（ポリプロピレンチューブ）に細胞を維持することである。このプロトコルでは、多くのタイプの組織（ 例えば 、肺、心臓、筋肉、骨、脂肪、肝臓、腎臓、軟骨、乳腺、胎盤、血液）の解離に広く使用されているC.ヒストリチカムの Collagenase Aを使用した血管、脳、および腫瘍）。ソーティング中に細胞が失われないようにするには、抗体の最適化と効率的なゲーティング戦略の作成を強くお勧めします。このプロトコールでは、CD11b-Percp / Cy5.5、CD45-APC / eFluor780、Ly6C / APC、およびLy6G Pe / Cy7蛍光結合抗体およびフローサイトメトリーを用いてネズミマクロファージを特徴付けた。エピトープLy6C / Gはヒトには存在しないので、ヒト骨髄細胞を選別するためにはCD14 / CD15 / CD16の使用が必要である15 。
多色フローサイトメトリー分析では、選択された蛍光色素の可能なスペクトル重複が起こり得る。したがって、befoと同様に重複した問題を避けるために、一重染色補償が非常に役立ちます。さらに、バックグラウンドの蛍光を減少させ、最適な結果を得るために抗体滴定を強く推奨します。非特異的結合を減少させるための別の重要な考慮事項は、生存性色素の使用である。このプロトコールでは、DAPIを生存性色素として使用する。 DAPI（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）は、DNAのATリッチ領域に強く結合する青色蛍光染色剤です。 DNAに結合したDAPIの励起極大は358nmであり、発光極大は461nmである。プロトコールに従って使用する場合、DAPIは、フロー分析において死細胞を除いて、細胞質標識がほとんどまたは全くなく、核を特異的に染色する。しかしながら、選択された抗体のパネルに依存して、7-アミノラクチノマイシンD（7-AAD）およびヨウ化プロピジウム（PI）などの他の生存性色素を使用することができる。正確な死細胞排除および生細胞同定は、 インビトロ T細胞を首尾良くモニタリングするための前提条件であるリンパ球の増殖に続いて、細胞の生存能力および機能の破壊を最小限に抑えることができる手順を有することを望む。
上記のように、CFSEなどの細胞追跡色素を用いた細胞標識および増殖分析のための重要なステップが存在する。文献に記載されている例のように、CFSE 16を使用する場合、均一な分布と識別可能な娘ピークを得るために、死んだ/瀕死の細胞の除外に注意を払わなければならない。染色パネルに応じて、多くの市販の細胞追跡色素を選択することができる。細胞追跡色素の代替として、チミジン滴定アッセイを実施して、癌研究におけるリンパ球および他の細胞の増殖を評価する13,14。チミジン取込みプロトコルは、放射性標識された3 Hまたは14 Cチミジンの測定によって細胞分裂中のDNAの複製を評価する。この方法i非常に感度が高く確立されているが、チミジン滴定法の主な欠点は、放射能を伴い、単一細胞レベルで情報を提供しないことである。一方、CFSEフローサイトメトリー分析は、応答するリンパ球サブセットについての明確な情報を提供し、内部および血管内変動がより少ない。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
我々は、フローサイトメトリー、顕微手術、およびシナイ山での研究優秀な生物リポジトリ/病理学のセンターの技術的貢献を認めています。この研究は、COST Action BM1305：細胞致死療法（A FACTT）、Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Instituteの開発基金、Ciencia e Innovacion Minister SAF2013-48834-RおよびSAF2016-80031-Rに焦点を当てて加速するアクションJO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
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