Summary
Makrofager er plastceller av det hematopoietiske systemet som har en avgjørende rolle i beskyttende immunitet og homeostase. I denne rapporten beskriver vi optimaliserte in vitro teknikker for fenotypisk og funksjonell karakterisering av graft-infiltrerende regulatoriske makrofager som akkumuleres i det transplanterte organ under tolerogene forhold.
Abstract
Makrofagakkumulering i transplanterte organer har lenge blitt anerkjent som en funksjon av allograftavvisning 1 . Immunogene monocytter infiltrerer allograftet tidlig etter transplantasjonen, monterer en graftreaktiv respons mot det transplanterte organet, og initierer organavstødning 2 . Nylige data tyder på at undertrykkende makrofager letter vellykket langsiktig transplantasjon 3 og er nødvendig for induksjon av transplantasjonstoleranse 4 . Dette antyder et flerdimensjonalt konsept av makrofage ontogeni, aktivering og funksjon, som krever en ny veikart for isolering og analyse av makrofagfunksjon 5 . På grunn av makrofagens plastisitet er det nødvendig å gi en metode for å isolere og karakterisere makrofager, avhengig av vevsmiljøet, og å definere deres funksjoner i henhold til forskjellige scenarier. Her beskriver viVære en protokoll for immunkarakterisering av graft-infiltrerende makrofager og metodene vi brukte til funksjonelt å evaluere deres evne til å hemme CD8 + T-proliferasjon og for å fremme CD4 + Foxp3 + Treg ekspansjon in vitro .
Introduction
Denne protokollen beskriver in vitro teknikker for å studere funksjonen av vev-infiltrerende makrofager isolert fra hjerteallografer, i henhold til deres evne til å modulere T-celle responser. Bredt beskrevet i litteraturen er fluorescerende cellesporingsfarger i kombinasjon med flytcytometri kraftige verktøy for å studere den undertrykkende funksjonen til spesifikke celletyper in vitro og in vivo. Vår protokoll følger karboxyfluoresceinsuccinimidylester-metoden (CFSE) for overvåkning av lymfocyttproliferasjon in vitro .
Når en CFSE-merket celle deler seg, oppnår avkom halvparten av antall karbokyfluorescein-merkede molekyler 6 . Den tilsvarende reduksjonen i cellefluorescens ved hjelp av flytcytometri kan brukes til å vurdere celledeling, overvåking av kapasiteten til undertrykkende makrofager for å modulere T-celleimmunresponser. Siden CFSE er en fluoresceinbasert fargestoff, er den kompatibel med en brOad rekkevidde av andre fluorokromer, noe som gjør den anvendelig for flervalsfluidcytometri. Det riktige valget av fluorokrom for fenotyping er også viktig for å unngå overdreven spektral overlapping og manglende evne til å gjenkjenne antistoff-positive celler, spesielt med synlige proteinfarger som CFSE 7 .
Det er mange fordeler ved bruk av fluorescerende fargestoffer over alternative teknikker som måler celleproliferasjon, slik som tymidininkorporasjonsanalysen, som bruker radioaktivt merket tymidin (TdR) 8 . Denne analysen benytter tritiert tymidin ( 3 H-TdR) som er innarbeidet i nye tråder av kromosomalt DNA under mitotisk celledeling. Et sikkerhetsproblem forbundet med denne analysen er bruken av radioisotoper, siden en scintillasjon beta-teller brukes til å måle radioaktiviteten i DNA som gjenvinnes fra cellene for å bestemme omfanget av celledeling. Metodisk er det tritierte tymidin-assAy er ikke fleksibel nok til å passe viktige kliniske laboratoriebegrensninger som lavt antall celler og forsinket analyse etter farging. Tvert imot har CFSE-farging vist seg å forhindre celleproliferasjon og å forstyrre kritiske aktiveringsmarkører, slik som CD69, HLA-DR og CD25 9 . Derfor er forståelse fordeler og begrensninger av hver metode, spesielt i flerfargete studier hvor flere fargestoffer brukes til å spore forskjellige celletyper, avgjørende for å oppnå nøyaktige og reproducerbare resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne studien er musene plassert i samsvar med de amerikanske retningslinjene for avdeling for jordbruk og anbefalinger fra helsevesenets veiledning for pleie og bruk av laboratoriedyr. Alle eksperimentelle teknikker som involverer dyrebruk ble utført i samsvar med Inocular Animal Care and Utilization Committee (IACUC) godkjente protokoller fra Mount Sinai School of Medicine.
1. Medieforberedelse
- Klargjør fullstendig RPMI 1640 medium med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (10.000 U / ml) ved bruk av 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 5 mM HEPES og 0,05 mM 2 merkaptoetanol.
2. Allograft-isolasjon og en-cellesuspensjon
MERK: Transplantasjons- og anastomoseteknikken til lungearterien og inferior cava venen ble først beskrevet av Corry og samarbeidspartnere og kan visualiseres i Liu & KangS = "xref"> 10 , 11 ( figur 1A ).
- Bedøve en transplantert mus med 4-5% isofluran i et induksjonskammer. Offer det ved cervikal dislokasjon.
- Gjør et midtlinje abdominal snitt med standard saks og fjern abdominal innhold for å lokalisere aorta.
MERK: Det transplanterte hjertet vil være på høyre side av mottakeren abdominal aorta ( Figur 1B ). - Trekk forsiktig ut graftet med fine skarpe tenner og plasser det umiddelbart i iskaldt RPMI-medium.
MERK: Ved å bruke en kirurgisk saks for å separere transplantatet fra aorta kan det skade graft og føre til at noen vev forblir festet til mottakeren. - Etter at alle transplantatene er blitt samlet, flytt dem til en steril kultur hette for behandling av vev. Plasser transplantatet i en petriskål og terninger vevet i små stykker (1 mm) ved hjelp av steril, stump, mikrokirurgisk saks.
- Med skarpe tenner forcEps, overfør bitene til et 50 ml rør med 5 ml kollagenase A (0,1 mg / ml kollagenase i steril 1x PBS). Inkubér det i 1 time i et 37 ° C bad.
- Tilsett 5 ml RPMI-medium for å nøytralisere kollagenasen og overføre prøven gjennom en 100 μm sil med hjelp av stempelet på en 1 ml sprøyte.
- Spinn prøven ned ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender pelleten i 1 ml ACK lysis buffer. Bland godt og inkuber i 5 minutter ved 4 ° C.
- Tilsett 1 ml RPMI medium for å nøytralisere lysisbufferen og spinn prøven ned ved 400 xg i 5 m ved 4 ° C.
- Resuspender cellepelletet i 200 μl RPMI-medium og overfør det til en 5 ml polypropylenrundbunnsrør.
MERK: Polypropylenrør støtter mindre adhesjon. Vedlikehold av cellene ved lav temperatur, slik som 4 ° C, reduserer også adhesjonen.
3. Isolering av graft-infiltrerende makrofager ved bruk av fluorescensaktivert cellesorting
- Blokker uønsket spesifikk binding på myeloidceller ved bruk av Fc-reseptorblokkerende mAb (rotte anti-mus CD16 / 32). Tilsett 1-2 μL per prøve, 15 min før overflatefarging.
- Flekk med anti-mus CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μl sluttkonsentrasjon i RPMI-medium), anti-mus CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μl), anti-mus Ly6C APC (2 μg / μl) Og anti-mus Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μl). Dekk rørene med aluminiumsfolie for å beskytte de fluorescerende antistoffene fra lys og inkuber rørene i kjøleskapet ved 4 ° C i 45 minutter.
MERK: For enkelt-flekk kompensasjoner, lag et negativt kontrollrør (ingen flekk) og rør med celler merket enkeltvis med hver av fluorokromene. For å bidra til å sette opp porten, kan isotype kontroller brukes spesielt for Ly6C (IgG2a) og Ly6G (IgG2b). - Vask cellene to ganger med RPMI-medium og spinn dem ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Telle cellene ved hjelp av trypanblått og et hemocytometeR og fortynn dem i 1 ml RPMI medium per 1 x 106 celler. Før sortering, overfør prøvene gjennom en 5 ml, 70 μm cellefilterrørdeksel. Legg til DAPI (1 μg / mL) som en celle-levedyktighetsmarkør og fortsett å sortere.
- Fordi makrofager er følsomme og skjøre celler, stiller du sorteringsbetingelsene til 20 psi og bruker en 100 μm dysestørrelse for å isolere makrofager ved hjelp av en 4-veis renhetsmodus.
- Klargjør oppsamlingsrør med 1 ml RPMI-medium i et 5 ml polypropylenrør.
- Bruk sorteringsprogramvaren til å åpne nytt eksperiment og velg tomt eksperiment med et tomt panel for å definere innstillinger.
- Sett opp et punktpunkt som viser fremad (FSC) versus ( vs. ) sidestrømning (SSC) og gate på alle leukocytter, unntatt rusk og klumper med lavest frem- og sidestrøm. Fra denne foreldreporten lager du en ny prikkplott som viser SSC vs. DAPI og gate på DAPI-celler.
- På denne nylig gatede befolkningen lager du annonseOt plot som viser CD11b vs CD45 og port på dobbelt positive (CD11b + CD45 + ) makrofager og nøytrofiler.
- Deretter lager du en endelig punktplot som viser Ly6C vs Ly6G og gir de ønskelige populasjonene: Ly6C hi Ly6G-, Ly6C lo Ly6G- og Ly6C int Ly6G + ( Figur 2 ).
- Etter sortering, kontroller for renhet og celleevennlighet (> 90%) og spinn oppsamlingsrørene ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Telle cellene ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer og resuspendere dem ved ønsket konsentrasjon ( f.eks. 1 x 10 6 makrofager / ml) i komplett RPMI-medium.
- Plate 50 x 10 3 makrofager per brønn i en 96-brønn rundbunnplate med et sluttvolum på 100 ul komplett RPMI-medium. La cellene være uforstyrret i minst 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
4. IsolatioN av T-celler ved bruk av fluorescensaktivert cellesortering
MERK: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn er en X-koblet målrettet inntasting av musestamme som markerer celler som uttrykker Foxp3 (forkodet-boksen P3) -genet med monomer rødt fluorescerende protein (mRFP).
- Bedøve og ofre C57BL / 6 og C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) mus som tidligere beskrevet i trinn 2.1. Isoler milt og lymfeknuter (LN: inguinal, lumbal, axillar, brachial og cervical) og plasser dem raskt i iskaldt RPMI-medium.
- For å isolere LN, plasser musen i en liggende stilling, gjør et midtlinjeskinn fra bunnen til toppen, skar forsiktig bukhinnen og forsiktig spre huden i hverandre. Når alle inguinal, lumbal, axillary, brachial og cervical LN er samlet ( figur 1C , farget i rødt), kutt bukhinnen og isoler milten i øvre venstre side av tarmen.
- Disaggregere milten og LN ved å bruke et 100 μm filter plassertPå toppen av et 50 ml rør. Bruk stempelet på en 1 ml sprøyte, trykk forsiktig på vevet. Skyll filteret med RPMI-medium så mange ganger som nødvendig før det er rent.
MERK: LN og milt fra hver mus kan samles i samme rør. - Spinn ned ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender pelleten i 2 ml ACK lysis buffer. Bland godt og inkuber i 5 minutter ved 4 ° C.
- Tilsett 2 ml RPMI medium for å nøytralisere lysisbufferen. Spinn ned ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender cellepellet i 200 μl RPMI-medium og overfør det til et 5 ml polystyrenrørrør.
- Flekk for anti-mus CD4 APC (0,6 μg / μl) og / eller anti-mus CD8 PeCy7 (2 μg / μl). Dekk rørene med aluminiumsfolie for å beskytte de fluorescerende antistoffene fra lys og inkuber rørene i kjøleskapet ved 4 ° C i 45 minutter.
MERK: For enkeltflettskompensasjoner, lag et negativt kontrollrør (ingen flekk) ogRør med celler merket enkeltvis med hver av fluorokromene. - Vask cellene to ganger med RPMI-medium og spinn dem ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Telle cellene ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer.
MERK: CFSE-fargestoff er tilveiebrakt som karbokfluoresceindiacetatsuccinimidylesterpulver vanligvis ved 50 ug. Tilsett 18 μl DMSO til et hetteglass med CFSE for en endelig stamløsning på 5 mM og lagre ved -20 ° C i flere måneder. - For CFSE-merking resuspenderer CD8-farvede celler ved en konsentrasjon på opptil 10 6 celler per ml i PBS ved en endelig arbeidskonsentrasjon av 5 uM CFSE fra stamløsningen. Inkuber dem i et bad ved 20 ° C i 5 minutter som tidligere beskrevet 6 .
MERK: (CRITICAL STEP) For celler med lav konsentrasjon (≤10 6 per mL) er det viktig at cellene merkes i nærvær av tilsatt protein for å buffere de toksiske effektene av CFSE. Derfor kan PBS inneholde 5% FBS. Legg merke til at hvis jegDium brukes, kan gratis aminosyrer redusere merkingseffektiviteten ved å konkurrere om CFSE. - Nøytraliser CFSE med 2 ml RPMI medium. Spinn ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tilsett 1 ml RPMI medium per 1 x 106 CD8 T-celler.
- Før sortering, overfør prøven gjennom en 70 μm cellesylinder på en 5 ml rørhett. Tilsett 50 μl 1x DAPI (1 μg / mL) som en celle-levedyktighetsmarkør og fortsett å sortere.
MERK: 1x betyr 1: 1-forholdet av reagenset med respekt for annen bestanddel. - Sett sorteringsbetingelsene ved 20 psi og 100 μm dysestørrelse for å isolere dobbelt positive CD8 + CFSE + T-celler ( Figur 3A ).
- Forbered oppsamlingsrørene med 1 ml RPMI-medium i et 5 ml polypropylenrør og fortsett å sortere.
- Bruk sorteringsprogramvaren til å åpne nytt eksperiment og velg tomt eksperiment med et tomt panel for å definere innstillinger.
- For CD4 + T-celleisolasjon, sett opp en punktplot som er disSpiller FSC vs SSC og gate på lymfocytter, unntatt rusk samt store granulære celler, som dendritiske celler.
- Fra denne foreldreporten lager du en ny prikkplott som viser SSC vs. DAPI og gate på DAPI-celler.
- På denne nylig gatede befolkningen lager du en prikkplott som viser SSC vs CD4 for å isolere alle CD4 + -celler ( Figur 3B ). Alternativt kan et anti-CD3 mAb brukes for å sikre isolering av rene T-cellepopulasjoner.
MERK: En liten del av alle CD4 + T-celler (5-10%) skal være Foxp3 + mRFP + .
- Etter sortering, kontroller for renhet og celleevennlighet (> 90%) og spinn oppsamlingsrørene ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Telle cellene ved hjelp av trypanblått og et hemocytometer. Resuspenderes ved bruk av 1 ml komplett RPMI medium per 2 x 10 6 T-celler.
- Oppsett suppresjonsanalyse ved å dyrke T-celler med tidligere sorterte makrofager. Plate 10 x 10 4 CD4 + T og 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T-celler i samme brønn i et sluttvolum på 100 ul komplett RPMI-medium. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 96 timer.
MERK: Makrofager og T-celler ble brukt i et forhold på 1: 4. - Stimuler T-celledeling ved å vaske T-celleaktivator CD3 / CD28 magnetiske perler i 2 ml PBS før du bruker dem for å fjerne den azidholdige buffer. Tilsett 5 μL mus T-celler-aktivator CD3 / CD28 perler per brønn.
MERK: Magnetiske perler er like i størrelse som antigen-presenterende celler og kobles til anti-CD3 og anti-CD28 mAb, og tilbyr en enkel metode for aktivering og utvidelse av T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representative resultatene viser gatingstrategien beskrevet i ovennevnte protokoll. Resultatene viser også analysen av T-celleproliferasjonsaktiviteten etter samkulturen med graft-infiltrerende makrofager. In vitro- undertrykkende kapasitet av makrofagundergrupper ble analysert i figur 4 . Resultatene indikerer at Ly6C lo Ly6G - makrofager oppnådd fra tolererte mottakere er undertrykkende. Resultatene indikerer også at Ly6C int Ly6G + -celler viser en beskjeden undertrykkende kapasitet. Kun Ly6C lo Ly6G - celler fremmet utvidelsen av CD4 + Foxp3 + Treg in vitro . Sammen støtter dataene konklusjonen om at graftinfiltrerende CD11b + Ly6C lo Ly6G - makrofager har mange av egenskapene som rapporteres å være assosiert med monocytt-avledede suppressorceller 12 , iCluding deres evne til å hemme CD8 T-celle proliferation 13 og for å fremme CD4 + Foxp3 + Treg ekspansjon 14 .
Figur 1: Dyremodell. ( A ) Balb / c hjerter (H2-d) ble transplantert til fullt allogen C57BL / 6 (H2-b) som tidligere beskrevet 10 . Anastomose, mottakerens cava ven og abdominal aorta med donorens lungearteri og stigende aorta henholdsvis, vises. Mottaksmus ble behandlet med 250 ug anti-CD40L mAb (klon MR1) for toleranseinduksjon på dagene 0, 2 og 4, som vi nylig rapporterte 4 . Graftfunksjon ble overvåket annenhver dag ved abdominal palpasjon. Avvisning ble definert som fullstendig opphør av et palpabelt hjerteslag og ble bekreftet ved direkte visualisering ved laparotomi. ( B ) Representativt bilde og ( C ) illustrasjon av anatomisk lokalisering av LN og milt (farget i rødt) og allograft (farget i lilla) Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Makrofag sorteringsstrategi. Fra øverst til venstre, er leukocytter først gated av størrelse, og deretter singlet celler diskrimineres fra rusk og klumper. Fra singlets, er døde celler ekskludert gating på DAPI negative fraksjon. Fra levende celler brukes CD45 + CD11b + til å identifisere myeloidceller. Tre myeloidcellepopulasjoner identifiseres videre basert på Ly6C og Ly6G-ekspresjon.= "_ Blank"> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lymfocytt sorteringsstrategi. Representativ flytcytometri resulterer i lymfocytt sorteringsstrategien. Fra øverst til venstre, gate på lymfocyttpopulasjonen i henhold til fremad og side spredning. Unngå rusk og klumper. Fra singlets, døde celler er ekskludert ved å gating på DAPI negative fraksjon. Fra levende celler, ( A ) CD8 + CFSE + dobbelt positive celler og ( B ) alle CD4 + T-celler, som inneholder en brøkdel av Foxp3 + positive celler, er inngjerdet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
![Figur 4]("/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg")
Figur 4: Suppresjonsanalyse. ( A ) In vitro- undertrykkende kapasitet av hver myeloid delmengde. CD8 + T-celleproliferasjon ble overvåket ved CFSE-fortynning etter 96 timer medkultur med myelide delgrupper. ( B ) In vitro Treg utvidelse av hver myeloid delmengde. Flowcytometrianalyse av Foxp3-ekspresjon på CD4 + T-celler etter 96 timers samkultur med myelide delgrupper. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver metodene vi brukte til immunokarakterisering av graftinfiltrerende myeloidcelle-undergrupper i en eksperimentell murint modell for hjerte-transplantasjon, som også gjelder for andre vev i forskjellige murine eksperimentelle modeller. Lavtrykkscellesortering ved 20 psi var den foretrukne fremgangsmåten for å isolere et godt utbytte av rene celleundergrupper. Opprettholde renheten av hver myeloid delmengde er kritisk for å etablere avgjørende resultater av den undertrykkende kapasiteten mellom de forskjellige myeloidpopulasjonene. Imidlertid kan andre metoder anvendes for isolering av forskjellige leukocyttpopulasjoner, slik som kommersielle anrikningssett. Uavhengig av cellepopulasjonen av interesse, er det nødvendig å oppnå levedyktige encellesuspensjoner fra det transplanterte vev for optimal overflatefarging og strømningscytometri-resultater. Feil vevsmanipulering kan forårsake cellefeil og derfor et lavt utbytte av myelide undergrupper. For å øke utbyttet må du sørge for å behandle prøven uSynge kalde buffere og å opprettholde cellene i beholdere med lav celleadhesjon (polypropylenrør). I denne protokollen brukte vi Collagenase A fra C. histolyticum , som er mye brukt for oppdeling av mange typer vev ( f.eks . Lunge, hjerte, muskel, bein, fett, lever, nyre, brusk, brystkjertel, placenta, blod Fartøy, hjerne og svulst). For å forhindre tap av celler mens sortering, optimalisering av antistoffene og generering av en effektiv gating strategi er sterkt anbefalt. I denne protokollen karakteriserte vi murine makrofager ved bruk av CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, Ly6C / APC og Ly6G Pe / Cy7 fluorescerende konjugerte antistoffer og flytcytometri. Siden epitoperne Ly6C / G ikke eksisterer hos mennesker, er bruk av CD14 / CD15 / CD16 nødvendig for sortering av humane myeloidceller 15 .
I flerfarget strømningscytometrianalyse kan mulige spektrale overlapper av de valgte fluorokromer forekomme. Derfor, som nevnt befoRe, single-flekk kompensasjoner er svært nyttig for å unngå overlappende problemer. I tillegg er antistofftitrering sterkt anbefalt for å redusere bakgrunnsfluorescensen og for å få optimale resultater. Et annet viktig hensyn for å redusere ikke-spesifikk binding er bruken av livskraftige fargestoffer. I denne protokollen brukes DAPI som levedyktighetsfargestoff. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) er en blå fluorescerende flekk som binder sterkt til AT-rike regioner i DNA. Excitasjons maksimumet for DAPI bundet til DNA er 358 nm, og utslipps maksimumet er 461 nm. Når det brukes i henhold til protokollen, spretter DAPI kjerner spesifikt, med liten eller ingen cytoplasmatisk merking, unntatt døde celler i strømningsanalysen. Imidlertid, avhengig av panelet av antistoffer valgt, kan andre levedyktige fargestoffer, så som 7-aminoaktinomycin D (7-AAD) og propidiumjodid (PI), anvendes. Nøyaktig utelukkelse av dødceller og identitet av levende celler er en forutsetning for å kunne overvåke in vitro- T-celler, da det er imporHar en tendens til å ha prosedyrer som kan følge lymfocytproliferasjon med minimal forstyrrelse av celle-levedyktighet og funksjon.
Som nevnt ovenfor er det kritiske trinn for cellemerking og proliferasjonsanalyser med cellesporingsfarger som CFSE. Som et eksempel beskrevet i litteraturen, må det tas hensyn til utelukkelsen av døde / døende celler for å oppnå jevne utbredelser og utmerkelige dattertopp når man bruker CFSE 16 . Det er mange kommersielt tilgjengelige cellesporingsfarger å velge mellom, avhengig av fargepanelene. Som et alternativ til cellesporingsfarger utføres tymidin-titrert assay for å evaluere proliferasjonen av lymfocytter og andre celler i kreftstudier 13 , 14 . Thymidin-inkorporeringsprotokoller vurderer replikasjonen av DNA under celledeling ved måling av radioaktivt merket 3H- eller 14C-tymidin. Selv om denne metoden jegEr ganske følsomme og veletablerte, er de største ulempene for tymidintitrert teknikk at den innebærer radioaktivitet og ikke gir informasjon på enkeltcellens nivå. På den annen side gir CFSE-flowcytometrianalyse tydelig informasjon om å reagere lymfocyttundergrupper og har mindre inter- og intralaboratorisk variabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi anerkjenner de tekniske bidragene til Flow Cytometry, Microsurgery, og Bio-repository / Patologi Centers of Excellence for forskning på Mount Sinai. Dette arbeidet ble støttet av COST Action BM1305: Tiltak for å fokusere og fremskynde Cell Tolerogenic Therapies (A Fact), Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute utviklingsfond, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R og SAF2016-80031-R JO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V.
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
