Summary
Makrofager er plastceller i det hæmatopoietiske system, der spiller en afgørende rolle i beskyttende immunitet og homeostase. I denne rapport beskriver vi optimerede in vitro teknikker til fænotypisk og funktionelt karakterisering af graft-infiltrerende regulatoriske makrofager, som akkumuleres i det transplanterede organ under tolerogene betingelser.
Abstract
Makrofagophopning i transplanterede organer er længe blevet anerkendt som et træk ved allograftafvisning 1 . Immunogene monocytter infiltrerer allograften tidligt efter transplantationen, monterer et transplantatreaktivt respons mod det transplanterede organ og initierer organafstødning 2 . Nylige data tyder på, at undertrykkende makrofager letter vellykket langtidstransplantation 3 og er nødvendige for induktion af transplantationstolerance 4 . Dette antyder et multidimensionelt koncept for makrofage ontogeni, aktivering og funktion, som kræver en ny køreplan for isolering og analyse af makrofagfunktion 5 . På grund af makrofagernes plasticitet er det nødvendigt at tilvejebringe en metode til at isolere og karakterisere makrofager afhængigt af vævsmiljøet og at definere deres funktioner i henhold til forskellige scenarier. Her beskriver viVære en protokol for immunkarakterisering af transfusionsinfiltrerende makrofager og de metoder, vi tidligere anvendte til funktionelt at evaluere deres evne til at inhibere CD8 + T proliferation og fremme CD4 + Foxp3 + Treg ekspansion in vitro .
Introduction
Denne protokol beskriver in vitro- teknikker til at studere funktionen af væv-infiltrerende makrofager isoleret fra hjerteallotografer i overensstemmelse med deres evne til at modulere T-celle responser. Bredt beskrevet i litteraturen er fluorescerende cellesporingsfarvestoffer i kombination med flowcytometri kraftige værktøjer til at studere den undertrykkende funktion af specifikke celletyper in vitro og in vivo. Vores protokol følger karboxyfluoresceinsuccinimidylester-metoden (CFSE) til overvågning af lymfocytproliferation in vitro .
Når en CFSE-mærket celle opdeles, køber sin afkom halve antallet af carboxyfluorescein-mærket molekyler 6 . Det tilsvarende fald i cellefluorescens ved hjælp af flowcytometri kan anvendes til at vurdere celledeling, overvågning af kapaciteten af undertrykkende makrofager til modulering af T-celleimmunrespons. Da CFSE er et fluoresceinbaseret farvestof, er det kompatibelt med en brOad rækkevidde af andre fluorokromer, hvilket gør den anvendelig til flervalsflowcytometri. Det passende valg af fluorochromer til fænotyping er også vigtigt for at undgå overdreven spektral overlapning og manglende evne til at genkende antistof-positive celler, især med synlige proteinfarvestoffer, såsom CFSE 7 .
Der er mange fordele ved at anvende fluorescerende farvestoffer over alternative teknikker, der måler celleproliferation, såsom tymidininkorporationsassayet, der anvender radioaktivt mærket thymidin (TdR) 8 . Dette assay udnytter tritieret thymidin (3H-TdR), som er inkorporeret i nye tråde af kromosomalt DNA under mitotisk celledeling. En sikkerhedsproblemer forbundet med dette assay er brugen af radioisotoper, da en scintillation beta-tæller anvendes til at måle radioaktiviteten i DNA, der er udvundet fra cellerne for at bestemme omfanget af celledeling. Metodisk er det tritierede thymidin-assAy er ikke fleksibel nok til at passe vigtige kliniske laboratoriebegrænsninger såsom lavt antal celler og forsinket analyse efter farvning. Tværtimod har CFSE-farvning vist sig at forhindre celleproliferation og at interferere med kritiske aktiveringsmarkører, såsom CD69, HLA-DR og CD25 9 . Derfor er forståelse fordele og begrænsninger af hver metode, især i flerfarvede undersøgelser, hvor flere farvestoffer anvendes til at spore forskellige celletyper, afgørende for at opnå præcise og reproducerbare resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne undersøgelse er musene anbragt i overensstemmelse med De Forenede Nationers Department of Agriculture retningslinjer og anbefalingerne fra Public Health Service Guide til pleje og brug af laboratoriedyr. Alle eksperimentelle teknikker, der involverer dyreanvendelse, blev udført i overensstemmelse med Inocular Animal Care and Utilization Committee (IACUC) godkendte protokoller fra Mount Sinai School of Medicine.
1. Medieforberedelse
- Forbered komplet RPMI 1640 medium med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (10.000 U / ml) ved anvendelse af 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 5 mM HEPES og 0,05 mM 2 mercaptoethanol.
2. Allograft Isolation og single-cell Suspension
BEMÆRK: Transplantation og anastomose teknik i pulmonal arterie og inferior cava ven blev oprindeligt beskrevet af Corry og collaborators og kan visualiseres i Liu & KangS = "xref"> 10 , 11 ( figur 1A ).
- Bedøve en transplanteret mus med 4-5% isofluran i et induktionskammer. Offer det ved cervikal dislokation.
- Lav et midtergående abdominal snit med standard saks og fjern abdominalindholdet for at lokalisere aorta.
BEMÆRK: Det transplanterede hjerte vil være på højre side af modtageren abdominal aorta ( figur 1B ). - Træk forsigtigt forsigtigt ud med fine skarpe tænder og læg det straks i iskoldt RPMI-medium.
BEMÆRK: Brug af kirurgisk saks til at adskille transplantatet fra aorta kan beskadige graften og forårsage, at noget væv forbliver vedhæftet modtageren. - Efter at alle transplantater er blevet samlet, skal de flyttes til en steril kulturhætte til vævsbehandling. Placer transplantatet i en petriskål og terninger vævet i små stykker (1 mm) ved hjælp af steril, stump, mikrokirurgisk saks.
- Med skarpe tænder forcEps, overfør stykkerne til et 50 ml rør med 5 ml collagenase A (0,1 mg / ml collagenase i sterilt 1x PBS). Inkubér det i 1 time i et 37 ° C bad.
- Tilsæt 5 ml RPMI-medium for at neutralisere kollagenasen og overføre prøven gennem en 100 μm filter ved hjælp af stempelet på en 1 ml sprøjte.
- Spin prøven ned ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender pelleten i 1 ml ACK lysis buffer. Bland godt og inkuber i 5 minutter ved 4 ° C.
- Tilsæt 1 ml RPMI-medium for at neutralisere lysisbufferen og centrifugere prøven ved 400 xg i 5 m ved 4 ° C.
- Resuspender cellepelleten i 200 μl RPMI-medium og overfør den til et 5 ml polypropylen rundbundet rør.
BEMÆRK: Polypropylenrør understøtter mindre vedhæftning. Ved at holde cellerne ved lav temperatur, såsom 4 ° C, reduceres adhæsionen.
3. Isolering af graft-infiltrerende makrofager ved anvendelse af fluorescensaktiveret cellesorting
- Bloker uønsket specifik binding på myeloidceller ved anvendelse af Fc-receptorblokerende mAb (rotte anti-mus CD16 / 32). Tilsæt 1-2 μL pr. Prøve, 15 minutter før overfladens farvning.
- Stain med anti-mus CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μl slutkoncentration i RPMI-mediet), anti-mus CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μl), anti-mus Ly6C APC (2 μg / μl) Og anti-mus Ly6G Pe / Cy7 (2 μg / μl). Dæk rørene med aluminiumsfolie for at beskytte de fluorescerende antistoffer mod lys og inkubér rørene i køleskabet ved 4 ° C i 45 min.
BEMÆRK: For ensfarvede kompensationer skal der laves et negativt kontrolrør (ingen plet) og rør med celler mærket enkeltvis med hver af fluorokromerne. For at hjælpe med at oprette porten kan isotype-kontroller anvendes især til Ly6C (IgG2a) og Ly6G (IgG2b). - Vask cellerne to gange med RPMI-medium og centrifuger dem ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tæl cellerne ved hjælp af trypanblåt og en hæmocytometeR og fortynd dem i 1 ml RPMI-medium pr. 1 x 106 celler. Før sorteringen overføres prøverne gennem en 5 ml, 70 μm cellefiltretubehætte. Tilsæt DAPI (1 μg / ml) som en celle-levedygtighedsmarkør og fortsæt med at sortere.
- Fordi makrofager er følsomme og skrøbelige celler, skal du indstille sorteringsbetingelserne til 20 psi og bruge en 100 μm dysestørrelse til at isolere makrofager ved hjælp af en 4-vejs renhedstilstand.
- Klargør opsamlingsrør med 1 ml RPMI-medium i et 5 ml polypropylenrør.
- Brug sorteringssoftwaren til at åbne nyt eksperiment og vælg blank eksperiment med et tomt panel for at definere indstillinger.
- Opsæt en prikplot, der viser fremad (FSC) versus ( vs. ) sidespredning (SSC) og port på alle leukocytter, eksklusive rusk og klumper med den laveste fremad- og sidestrøm. Fra denne modersport skal du oprette et nyt punktplade, der viser SSC vs. DAPI og port på DAPI-celler.
- På denne nybevægede befolkning opretter du en annonceOt plot, der viser CD11b vs CD45 og port på dobbeltpositive (CD11b + CD45 + ) makrofager og neutrofiler.
- Herfra opretter du en endelig prikplot, der viser Ly6C vs. Ly6G og indgår de ønskelige populationer: Ly6C hi Ly6G-, Ly6C lo Ly6G- og Ly6C int Ly6G + ( Figur 2 ).
- Efter sortering skal du kontrollere renhed og celle levedygtighed (> 90%) og centrifuger rørene ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tæl cellerne ved hjælp af trypanblåt og et hæmocytometer og resuspender dem med den ønskede koncentration ( fx 1 x 10 6 makrofager / ml) i komplet RPMI-medium.
- Plad 50 x 10 3 makrofager pr. Brønd i en 96-brønds rundbundet plade med et slutvolumen på 100 μl komplet RPMI-medium. Lad cellerne være uforstyrrede i mindst 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
4. IsolatioN af T-celler ved anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering
BEMÆRK: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn er en X-linket målrettet muskelstamme, der markerer celler, der udtrykker Foxp3 (forkodet box P3) genet med monomer rødt fluorescerende protein (mRFP).
- Bedøve og ofre C57BL / 6 og C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) mus som tidligere beskrevet i trin 2.1. Isolér milt og lymfeknuder (LN: inguinal, lumbal, axillar, brachial og cervical) og hurtigt placere dem i iskoldt RPMI medium.
- For at isolere LN skal du placere musen i en liggende stilling, lav et midterhudssnit indsnit fra bund til top, skære forsigtigt bughulen og forsigtigt sprede huden fra hinanden. Når alle indinale, lumbal, axillære, brachiale og livmoderhalske LN er samlet ( Figur 1C , farvet i rødt), skær peritoneum og isoler milten i øverste venstre side af tarmen.
- Disaggreger milten og LN ved hjælp af et 100 μm filter placeretOven på et 50 ml rør. Brug stemplet på en 1 ml sprøjte og tryk forsigtigt på vævet. Skyl filteret med RPMI-medium så mange gange som nødvendigt, indtil det er rent.
BEMÆRK: LN og milt fra hver mus kan samles i samme rør. - Spin ned ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender pelleten i 2 ml ACK lysis buffer. Bland godt og inkuber i 5 minutter ved 4 ° C.
- Tilsæt 2 ml RPMI-medium for at neutralisere lysisbufferen. Spin ned ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
- Resuspender cellepelleten i 200 μl RPMI-medium og overfør den til et 5 ml polystyren rundbundet rør.
- Stain for anti-mouse CD4 APC (0,6 μg / μl) og / eller anti-mus CD8 PeCy7 (2 μg / μl). Dæk rørene med aluminiumsfolie for at beskytte de fluorescerende antistoffer mod lys og inkubér rørene i køleskabet ved 4 ° C i 45 min.
BEMÆRK: For ensfarvede kompensationer skal du forberede et negativt kontrolrør (ingen plet) ogRør med celler mærket enkeltvis med hver af fluorochromerne. - Vask cellerne to gange med RPMI-medium og centrifuger dem ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tæl cellerne ved hjælp af trypanblåt og et hæmocytometer.
BEMÆRK: CFSE farvestof leveres som carboxyfluoresceindiacetatsuccinimidylesterpulver, sædvanligvis ved 50 μg. Tilsæt 18 μL DMSO til et hætteglas med CFSE til en endelig stamopløsning på 5 mM og opbevar ved -20 ° C i flere måneder. - Til CFSE-mærkning resuspenderes CD8-farvede celler ved en koncentration på op til 10 6 celler pr. Ml i PBS ved en endelig arbejdskoncentration på 5 μM CFSE fra stamopløsningen. Inkuber dem i et bad ved 20 ° C i 5 minutter som tidligere beskrevet 6 .
BEMÆRK: (CRITICAL STEP) For celler med lav koncentration (≤10 6 pr. ML) er det vigtigt, at cellerne mærkes i nærværelse af tilsat protein for at bremse de toksiske virkninger af CFSE. Derfor kan PBS indeholde 5% FBS. Bemærk at hvis jegDium anvendes, kan fri aminosyrer sænke mærkningseffektiviteten ved at konkurrere om CFSE. - Neutraliser CFSE med 2 ml RPMI-medium. Spin ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tilsæt 1 ml RPMI-medium pr. 1 x 106 CD8-T-celler.
- Før sorteringen overføres prøven gennem en 70 μm cellefilter på en 5 ml rørhætte. Tilsæt 50 μl 1x DAPI (1 μg / ml) som en celle-levedygtighedsmarkør og fortsæt til sortering.
BEMÆRK: 1x betyder 1: 1 forholdet af reagenset med respekt for anden bestanddel. - Indstil sorteringsbetingelserne ved 20 psi og 100 μm dysestørrelse for at isolere dobbeltpositive CD8 + CFSE + T-celler ( Figur 3A ).
- Klargør opsamlingsrør med 1 ml RPMI-medium i et 5 ml polypropylenrør og fortsæt til sortering.
- Brug sorteringssoftwaren til at åbne nyt eksperiment og vælg blank eksperiment med et tomt panel for at definere indstillinger.
- Til CD4 + T-celleisolering skal du oprette et punktum, der er disSpiller FSC vs SSC og port på lymfocytter, eksklusive rusk samt store granulære celler, såsom dendritiske celler.
- Fra denne modersport skal du oprette et nyt punktplade, der viser SSC vs. DAPI og port på DAPI-celler.
- På denne nybevægede befolkning opretter du en prikplot, der viser SSC vs. CD4 for at isolere alle CD4 + -celler ( figur 3B ). Alternativt kan et anti-CD3 mAb anvendes til at sikre isolering af rene T-cellepopulationer.
BEMÆRK: En lille del af alle CD4 + T-celler (5-10%) skal være Foxp3 + mRFP + .
- Efter sortering skal du kontrollere renhed og celle levedygtighed (> 90%) og centrifuger rørene ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Tæl cellerne ved hjælp af trypanblåt og et hæmocytometer. Resuspenderes ved anvendelse af 1 ml komplet RPMI-medium pr. 2x10 6 T-celler.
- Opsæt suppression assay ved at dyrke T-celler med tidligere sorteret makrofager. Plade 10 x 10 4 cd4 + T og 10 x 104 CD8 + CFSE + T-celler i den samme brønd i et slutvolumen på 100 μl komplet RPMI-medium. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO2 i 96 timer.
BEMÆRK: Makrofager og T-celler blev anvendt i et 1: 4-forhold. - Stimulere T-celledeling ved at vaske T-celleaktivator CD3 / CD28 magnetiske perler i 2 ml PBS, før de anvendes for at fjerne den azidholdige buffer. Tilsæt 5 μL mus T-celle-aktivator CD3 / CD28 perler pr. Brønd.
BEMÆRK: Magnetiske perler har samme størrelse som antigenpræsenterende celler og er koblet til anti-CD3 og anti-CD28 mAb, hvilket giver en simpel metode til aktivering og udvidelse af T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De repræsentative resultater viser gatingstrategien beskrevet i ovennævnte protokol. Resultaterne viser også analysen af T-celleproliferationsaktiviteten efter co-kulturen med transplantat-infiltrerende makrofager. Den in vitro- undertrykkende kapacitet af makrofagundergrupper blev analyseret i figur 4 . Resultaterne indikerer, at Ly6C lo Ly6G - makrofagerne opnået fra tolererede modtagere er undertrykkende. Resultaterne viser også, at Ly6C int Ly6G + -celler viser en beskeden undertrykkende kapacitet. Kun Ly6C lo Ly6G - celler fremmer ekspansion af CD4 + Foxp3 + Treg in vitro . Sammen støtter dataene konklusionen om, at graftinfiltrerende CD11b + Ly6C lo Ly6G - makrofager besidder mange af egenskaberne, der rapporteres at være forbundet med monocyt-afledte suppressorceller 12 , iCluding deres evne til at inhibere CD8 T-celleproliferation 13 og for at fremme CD4 + Foxp3 + Treg ekspansion 14 .
Figur 1: Dyremodel. ( A ) Balb / c-hjerter (H2-d) blev transplanteret til fuldt allogen C57BL / 6 (H2-b) som tidligere beskrevet 10 . Anastomose, af recipientens cava ven og abdominal aorta med donorens lungearterie og stigende aorta, er vist. Modtagermus blev behandlet med 250 μg anti-CD40L mAb (klon MR1) til toleranceinduktion på dag 0, 2 og 4, som vi for nylig rapporterede 4 . Graftfunktionen blev overvåget hver anden dag ved abdominal palpation. Afvisning blev defineret som fuldstændig ophør af et pålideligt hjerteslag og blev bekræftet ved direkte visualisering hos laparotomi. ( B ) Repræsentativ billede og ( C ) illustration af anatomisk placering af LN og milt (farvet i rødt) og allograft (farvet i lilla) Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Makrofag sorteringsstrategi. Begyndende fra øverst til venstre er leukocytter først gated efter størrelse, hvorefter singletceller diskrimineres fra rusk og klumper. Fra singlets er døde celler udelukket gating på DAPI negative fraktion. Fra levende celler bruges CD45 + CD11b + til at identificere myeloidceller. Tre myeloidcellepopulationer identificeres yderligere baseret på Ly6C- og Ly6G-ekspression.= "_ Blank"> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Lymfocyt sorteringsstrategi. Repræsentativ flowcytometri resulterer i lymfocyt sorteringsstrategien. Fra øverst til venstre går porten på lymfocytpopulationen i henhold til fremad og side spredt. Undgå snavs og klumper. Fra singlets er døde celler udelukket ved gating på DAPI negative fraktion. Fra levende celler, ( A ) CD8 + CFSE + dobbelt positive celler og ( B ) er alle CD4 + T-celler, som indeholder en brøkdel af Foxp3 + positive celler, gated. Klik her for at se en større version af denne figur.
![Figur 4]("/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg")
Figur 4: Suppression assay. ( A ) In vitro- undertrykkende kapacitet af hver myeloid delmængde. CD8 + T-celleproliferation blev overvåget ved CFSE-fortynding efter 96 timer medkultur med myelide undergrupper. ( B ) In vitro Treg ekspansion af hver myeloid delmængde. Flowcytometrianalyse af Foxp3-ekspression på CD4 + T-celler efter 96 timers medkultur med myelide delgrupper. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver de metoder, vi anvendte til immunokarakterisering af graft-infiltrerende myeloidcelleundergrupper i en eksperimentel murint model af hjerte-transplantation, som også er anvendelig for andre væv i forskellige murine eksperimentelle modeller. Lavtrykscelle sortering ved 20 psi var den foretrukne metode til at isolere et godt udbytte af rene celle undergrupper. Opretholdelse af renheden af hver myeloid delmængde er kritisk til at fastslå afgørende resultater af den undertrykkende kapacitet mellem de forskellige myeloidpopulationer. Andre metoder kan imidlertid anvendes til isolering af forskellige leukocytpopulationer, såsom kommercielle berigelsespakker. Uanset den cellepopulation, der er af interesse, er det nødvendigt at opnå levedygtige enkeltcellesuspensioner fra det transplanterede væv til optimale overfladefarvning og flowcytometri-resultater. Forkert vævsmanipulation kan forårsage celletab og dermed et lavt udbytte af myelide undergrupper. For at øge udbyttet skal du sørge for at behandle prøven uSyge kolde buffere og at opretholde cellerne i beholdere med lav cellehæftning (polypropylenrør). I denne protokol anvendte vi Collagenase A fra C. histolyticum , som i vid udstrækning anvendes til opdeling af mange typer væv ( fx lunge, hjerte, muskel, knogle, fedt, lever, nyre, brusk, brystkirtel, placenta, blod Fartøj, hjerne og tumor). For at forhindre tab af celler under sortering, anbefales optimering af antistofferne og generering af en effektiv gatingstrategi. I denne protokol karakteriserede vi murine makrofager ved anvendelse af CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, Ly6C / APC og Ly6G Pe / Cy7 fluorescerende konjugerede antistoffer og flowcytometri. Da epitoperne Ly6C / G ikke eksisterer hos mennesker, er brug af CD14 / CD15 / CD16 nødvendig til sortering af humane myeloidceller 15 .
I multicolor flowcytometrianalyse kan mulige spektrale overlapninger af de valgte fluorokrom forekomme. Derfor, som anført ovenforRe single compensations kompensationer er meget nyttige for at undgå overlappende problemer. Desuden anbefales antistoftitrering stærkt for at reducere baggrundsfluorescensen og for at opnå optimale resultater. En anden vigtig overvejelse for at reducere ikke-specifik binding er brugen af levedygtig farvestoffer. I denne protokol anvendes DAPI som levedygtig farve. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) er en blå fluorescerende farve, der binder stærkt til AT-rige regioner i DNA. Excitationsmaksimumet for DAPI bundet til DNA er 358 nm, og emissionsmaksimet er 461 nm. Når det anvendes ifølge protokollen, sprænger DAPI kerner specifikt, med ringe eller ingen cytoplasmatisk mærkning, undtagen døde celler i flowanalysen. Afhængigt af det valgte panel af antistoffer kan imidlertid andre levedygtighedsfarvestoffer, såsom 7-aminoactinomycin D (7-AAD) og propidiumiodid (PI) anvendes. Præcis udluftning af dødceller og identifikation af levende celler er en forudsætning for at kunne overvåge in vitro- T-celler, da det er imporTilbøjelige til at have procedurer, der kan følge lymfocytproliferation med minimal forstyrrelse af celle levedygtighed og funktion.
Som nævnt ovenfor er der kritiske trin til celle-mærkning og proliferationsanalyser med cellesporingsfarvestoffer, såsom CFSE. Som et eksempel beskrevet i litteraturen skal man være opmærksom på udelukkelsen af døde / døende celler for at opnå ensartede udbredelser og skelnelige dattertoppe, når de bruger CFSE 16 . Der er mange kommercielt tilgængelige cellesporingfarver at vælge imellem afhængigt af farveskiltene. Som et alternativ til cellesporingsfarvestoffer udføres tymidin-titreret assay for at evaluere proliferationen af lymfocytter og andre celler i cancerstudierne 13 , 14 . Thymidin-inkorporeringsprotokoller vurderer replikationen af DNA under celledeling ved måling af radioaktivt mærket 3H- eller 14C-thymidin. Selvom denne metode jegS meget følsomme og veletablerede, er de væsentligste ulemper ved tymidintitreret teknik, at den involverer radioaktivitet og ikke giver information på enkeltcellens niveau. På den anden side giver CFSE-flowcytometrianalyse klare oplysninger om at reagere lymfocytundergrupper og har mindre inter- og intralaboratorisk variabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender de tekniske bidrag fra Flow Cytometry, Microsurgery og Bio-repository / Patologi Centers of Excellence for Forskning på Mount Sinai. Dette arbejde blev understøttet af COST Action BM1305: Handling til at fokusere og fremskynde celletolerogen terapi (A Fact), Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute udviklingsfondene, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R og SAF2016-80031-R JO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V.
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
