Summary
Makrofager är plastceller i det hematopoietiska systemet som har en avgörande betydelse för skyddande immunitet och homeostas. I denna rapport beskriver vi optimerade in vitro- tekniker för att fenotypiskt och funktionellt karakterisera transplantatinfiltrerande regulatoriska makrofager som ackumuleras i det transplanterade organet under tolerogena förhållanden.
Abstract
Makrofagackumulering i transplanterade organ har länge erkänts som ett kännetecken för avstötning av allograft 1 . Immunogena monocyter infiltrerar allograftet tidigt efter transplantationen, monterar ett transplantatreaktivt svar mot det transplanterade organet och initierar organavstötning 2 . Nya data tyder på att undertryckande makrofager underlättar framgångsrik långsiktig transplantation 3 och är nödvändiga för induktion av transplantationstolerans 4 . Detta föreslår ett flerdimensionellt koncept av makrofag ontogeni, aktivering och funktion, vilket kräver en ny färdplan för isolering och analys av makrofagfunktion 5 . På grund av makrofas plasticitet är det nödvändigt att tillhandahålla en metod för att isolera och karaktärisera makrofager, beroende på vävnadsmiljö, och att definiera sina funktioner enligt olika scenarier. Här beskriver viVara ett protokoll för immunkarakterisering av transfigurerande makrofager och metoderna som vi använde för att funktionellt utvärdera deras förmåga att hämma CD8 + T-proliferation och för att främja CD4 + Foxp3 + Treg-expansion in vitro .
Introduction
Detta protokoll beskriver in vitro- tekniker för att studera funktionen av vävnadsinfiltrerande makrofager isolerade från hjärt-allotransplantat, i enlighet med deras förmåga att modulera T-cellreaktioner. Bredt beskrivet i litteraturen är fluorescerande cellspårningsfärger i kombination med flödescytometri kraftfulla verktyg för att studera den undertryckande funktionen hos specifika celltyper in vitro och in vivo. Vårt protokoll följer karboxifluoresceinsuccinimidylester (CFSE) -metoden för övervakning av lymfocytproliferation in vitro .
När en CFSE-märkt cell delar upp, förvärvar dess avkomma hälften av antalet karboxifluoresceinmärkta molekyler 6 . Den motsvarande minskningen av cellfluorescens med flödescytometri kan användas för att bedöma celldelning, övervakning av kapaciteten hos undertryckande makrofager för modulering av T-cellimmunresponser. Eftersom CFSE är en fluoresceinbaserad färgämne är den kompatibel med en brOad-intervallet av andra fluorkromer, vilket gör den tillämplig på flervalsflödescytometri. Det lämpliga valet av fluorokrom för fenotypning är också viktigt för att undvika överdriven spektralöverlappning och oförmågan att känna igen antikropps-positiva celler, särskilt med synliga proteinfärger såsom CFSE 7 .
Det finns många fördelar med att använda fluorescerande färgämnen över alternativa tekniker som mäter cellproliferation, såsom tymidininkorporationsanalysen, som använder radiomärkt tymidin (TdR) 8 . Denna analys utnyttjar tritierad tymidin (3H-TdR) som införlivas i nya strängar av kromosomalt DNA under mitotisk celldelning. Ett säkerhetsproblem i samband med denna analys är användningen av radioisotoper, eftersom en scintillations beta-räknare används för att mäta radioaktiviteten i DNA som återvinns från cellerna för att bestämma graden av celldelning. Metodiskt är den tritierade tymidin-rövenAy är inte tillräckligt flexibel för att passa viktiga kliniska laboratoriebegränsningar såsom lågt antal celler och fördröjd analys efter färgning. Tvärtom har CFSE-färgning visat sig förhindra cellproliferation och att störa kritiska aktiveringsmarkörer, såsom CD69, HLA-DR och CD25 9 . Därför är det viktigt att förstå fördelar och begränsningar för varje metod, särskilt i flerfärgade studier där flera färgämnen används för att spåra olika celltyper, för att få exakta och reproducerbara resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denna studie är möss inrymda i enlighet med Förenta staternas avdelning för jordbruksriktlinjer och rekommendationerna från folkhälsovårdsguiden för vård och användning av laboratoriedjur. Alla försöksmetoder som inbegriper djuranvändning utfördes i enlighet med protokollet för institutionell djurvård och användningskommitté (IACUC) från Mount Sinai School of Medicine.
1. Media Preparation
- Förbered fullständigt RPMI 1640 medium med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin (10 000 U / ml) med användning av 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 5 mM HEPES och 0,05 mM 2 merkaptoetanol.
2. Allograftisolering och enkelcellsupphängning
OBS: Transplantationen och anastomoseteknik av lungartären och sämre cava venen beskrivs initialt av Corry och medarbetare och kan visualiseras i Liu & KangS = "xref"> 10 , 11 ( Figur 1A ).
- Bedöva en transplanterad mus med 4-5% isofluran i en induktionskammare. Offra det genom cervikal dislokation.
- Gör en mittlinje i magen med standard sax och ta bort bukhalten för att lokalisera aortan.
OBS: Det transplanterade hjärtat kommer att finnas på höger sida av mottagaren av buken aorta ( Figur 1B ). - Dra försiktigt ut transplantatet med fina vassa tänder och placera det omedelbart i iskallt RPMI-medium.
ANMÄRKNING: Användning av kirurgisk sax för att separera transplantatet från aortan kan skada ytan och orsaka att en del vävnader hålls fast vid mottagaren. - När alla transplantat har samlats, flytta dem till en steril kuvert för vävnadsbehandling. Placera transplantatet i en petriskål och tärna vävnaden i små bitar (1 mm) med steril, trubbig, mikrokirurgisk sax.
- Med skarpa tänder förcEps, överför bitarna till ett 50 ml rör med 5 ml kollagenas A (0,1 mg / ml kollagenas i steril 1x PBS). Inkubera det i 1 h i ett 37 ° C bad.
- Tillsätt 5 ml RPMI-medium för att neutralisera kollagenaset och överföra provet genom en 100 μm sil med hjälp av kolven på en 1 ml spruta.
- Snurra provet ned vid 400 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera pelleten i 1 ml ACK-lysbuffert. Blanda väl och inkubera i 5 minuter vid 4 ° C.
- Tillsätt 1 ml RPMI-medium för att neutralisera lysbufferten och centrifugera provet vid 400 xg i 5 m vid 4 ° C.
- Resuspendera cellpelleten i 200 pl RPMI-medium och överför den till ett 5 ml polypropenrundrör.
OBS: Polypropylenrör stöder mindre vidhäftning. Även vidmakthållande av cellerna vid låg temperatur, såsom 4 ° C, minskar adhesionen.
3. Isolering av graftinfiltrerande makrofager med användning av fluorescensaktiverad cellsorteringing
- Blockera oönskad specifik bindning på myeloidceller med hjälp av Fc-receptorblockerande mAb (rått-anti-mus CD16 / 32). Tillsätt 1-2 μL per prov, 15 min före ytfärgning.
- Stänk med anti-mus CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μl slutkoncentration i RPMI-mediet), anti-mus CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μl), anti-mus Ly6C APC (2 μg / Och anti-mus Ly6G Pe / Cy7 (2 | ig / | il). Täck rören med aluminiumfolie för att skydda de fluorescerande antikropparna från ljus och inkubera rören i kylskåp vid 4 ° C i 45 min.
ANMÄRKNING: För enfärgskompensationer, förbereda ett negativt kontrollrör (ingen fläck) och rör med celler märkta ensamma med var och en av fluorokromerna. För att hjälpa till med att ställa in porten kan isotypkontroller användas speciellt för Ly6C (IgG2a) och Ly6G (IgG2b). - Tvätta cellerna två gånger med RPMI-medium och centrifugera dem vid 400 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Räkna cellerna med hjälp av trypanblått och en hemocytometeR och späd dem i 1 ml RPMI-medium per 1 x 106 celler. Innan sortering överförs provet genom en 5 ml, 70 μm cellfiltretörslock. Tillsätt DAPI (1 μg / ml) som en celllevelighetsmarkör och fortsätt att sortera.
- Eftersom makrofager är känsliga och bräckliga celler ställer du sorteringsförhållandena på 20 psi och använder en 100 μm munstycksstorlek för att isolera makrofager med ett 4-vägs renhetsläge.
- Förbered insamlingsrör med 1 ml RPMI-medium i ett 5 ml polypropenrör.
- Använd sorteringsprogramvaran genom att öppna nytt experiment och välj ett tomt experiment med en tom panel för att definiera inställningar.
- Ställ in en punktdiagram som visar framåtriktad (FSC) versus ( vs. ) sidospridning (SSC) och grind på alla leukocyter, exklusive skräp och klumpar med lägsta fram- och sidospridning. Från den här moderporten skapar du en ny punktdiagram som visar SSC vs DAPI och gate på DAPI-celler.
- På den här nybyggda befolkningen skapar du annonsOt plot som visar CD11b vs CD45 och grind på dubbelpositiva (CD11b + CD45 + ) makrofager och neutrofiler.
- Härifrån skapar du en slutpunktspot som visar Ly6C vs Ly6G och grindar de önskvärda populationerna: Ly6C Hi Ly6G-, Ly6C Lo Ly6G- och Ly6C int Ly6G + ( Figur 2 ).
- Efter sortering, kontrollera renhet och celllevnad (> 90%) och snurra uppsamlingsrören vid 400 xg i 5 minuter vid 4 ° C. Räkna cellerna med hjälp av trypanblått och en hemocytometer och resuspendera dem vid önskad koncentration ( t ex 1 x 10 6 makrofager / ml) i komplett RPMI-medium.
- Plattor 50 x 10 3 makrofager per brunn i en 96-brunns rundbottnad platta med en slutvolym av 100 pl fullständigt RPMI-medium. Låt cellerna vara ostörda i minst 24 timmar vid 37 ° C och 5% CO2.
4. IsolatioN av T-celler med användning av fluorescensaktiverad cellsortering
ANMÄRKNING: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn är en X-länkad målinriktad inslagsmusstam som medför celler som uttrycker Foxp3-genen (forkopslåda P3) med monomeriskt rött fluorescerande protein (mRFP).
- Bedöva och offra C57BL / 6 och C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) möss som tidigare beskrivits i steg 2.1. Isolera mjälten och lymfkörtlarna (LN: inguinal, ländrygg, axillar, brachial och cervikal) och placera dem snabbt i iskallt RPMI-medium.
- För att isolera LN, placera musen i ett bakre läge, gör ett mittlinjehår snitt från botten till toppen, skar försiktigt bukhinnan och försiktigt sprida huden från varandra. När alla injektions-, ländryggs-, axillär-, brachial- och livmoderhalskretsen samlas upp ( Figur 1C , färgad i rött), skära bukhinnan och isolera mjälten i övre vänstra sidan av tarmen.
- Disaggreger mjälten och LN med ett 100 μm filter placeratOvanpå ett 50 ml rör. Använd kolven på en 1 ml spruta och tryck försiktigt på vävnaden. Skölj filtret med RPMI-medium så många gånger som det behövs tills det är rent.
OBS: LN och mjälte från varje mus kan sammanfogas i samma rör. - Snurra ner vid 400 xg i 5 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera pelleten i 2 ml ACK-lysbuffert. Blanda väl och inkubera i 5 minuter vid 4 ° C.
- Tillsätt 2 ml RPMI-medium för att neutralisera lysbufferten. Snurra ner vid 400 xg i 5 minuter vid 4 ° C.
- Resuspendera cellpelleten i 200 pl RPMI-medium och överför den till ett 5 ml polystyrenrundrör.
- Stain för anti-mouse CD4 APC (0,6 μg / μl) och / eller anti-mus CD8 PeCy7 (2 μg / μl). Täck rören med aluminiumfolie för att skydda de fluorescerande antikropparna från ljus och inkubera rören i kylskåp vid 4 ° C i 45 min.
ANMÄRKNING: För enfärgskompensationer, förbered ett negativt kontrollrör (ingen fläck) ochRör med celler märkta singel med var och en av fluorokromerna. - Tvätta cellerna två gånger med RPMI-medium och centrifugera dem vid 400 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Räkna cellerna med hjälp av trypanblått och en hemocytometer.
OBS: CFSE-färgämne tillhandahålls som karboxifluoresceindiacetatsuccinimidylesterpulver vanligtvis vid 50 | ig. Tillsätt 18 μL DMSO till en ampull med CFSE för en slutlig stamlösning av 5 mM och förvara vid -20 ° C i flera månader. - För CFSE-märkning, resuspendera CD8-färgade celler i en koncentration av upp till 10 6 celler per ml i PBS vid en slutlig arbetskoncentration av 5 | iM CFSE från stamlösningen. Inkubera dem i ett bad vid 20 ° C under 5 minuter som tidigare beskrivits 6 .
OBS: (CRITICAL STEP) För celler med låg koncentration (≤10 6 per ml) är det viktigt att cellerna märks i närvaro av tillsatt protein för att buffra de toxiska effekterna av CFSE. Därför kan PBS innehålla 5% FBS. Observera att om jagDium används, kan fria aminosyror sänka märkningseffektiviteten genom att konkurrera om CFSE. - Neutralisera CFSE med 2 ml RPMI-medium. Spinn vid 400 xg i 5 min vid 4 ° C. Tillsätt 1 ml RPMI-medium per 1 x 106 CD8-T-celler.
- Innan sortering överförs provet genom en 70 μm cellfilm på ett 5 ml rörlock. Tillsätt 50 μl 1x DAPI (1 μg / ml) som en cellivarabilitetsmarkör och fortsätt till sortering.
OBS: 1x betyder 1: 1 förhållande av reagenset med hänsyn till annan beståndsdel. - Ange sorteringsförhållandena vid 20 psi och 100 μm munstyckstorlek för att isolera dubbelpositiva CD8 + CFSE + T-celler ( Figur 3A ).
- Förbered insamlingsrör med 1 ml RPMI-medium i ett 5 ml polypropenrör och fortsätt att sortera.
- Använd sorteringsprogramvaran genom att öppna nytt experiment och välj ett tomt experiment med en tom panel för att definiera inställningar.
- För CD4 + T-cellisolering, sätt upp en punktdiagram som disSpelar FSC vs SSC och grind på lymfocyter, exklusive skräp samt stora granulära celler, såsom dendritiska celler.
- Från den här moderporten skapar du en ny punktdiagram som visar SSC vs DAPI och gate på DAPI-celler.
- På den här nybyggda befolkningen skapar du en punktdiagram som visar SSC vs CD4 för att isolera alla CD4 + -celler ( Figur 3B ). Alternativt kan en anti-CD3 mAb användas för att säkerställa isolering av rena T-cellpopulationer.
OBS! En liten del av alla CD4 + T-celler (5-10%) ska vara Foxp3 + mRFP + .
- Efter sortering, kontrollera renhet och celllevnad (> 90%) och snurra uppsamlingsrören vid 400 xg i 5 minuter vid 4 ° C. Räkna cellerna med hjälp av trypanblått och en hemocytometer. Resuspenderas med användning av 1 ml fullständigt RPMI-medium per 2x10 6 T-celler.
- Ställ in undertryckningsassay genom odling av T-celler med tidigare sorterade makrofager. Plåt 10 x 10 4 CD4 + T och 10 x 10 ^ CD8 + CFSE + T-celler i samma brunn i en slutlig volym av 100 | il av fullständigt RPMI-medium. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 96 timmar.
OBS: Makrofager och T-celler användes i ett förhållande 1: 4. - Stimulera T-celldelning genom att tvätta T-cellaktivator CD3 / CD28 magnetiska pärlor i 2 ml PBS innan de används för att rensa den azidhaltiga bufferten. Tillsätt 5 μL mus T-cell-aktivator CD3 / CD28 pärlor per brunn.
OBS: Magnetiska pärlor har samma storlek som antigenpresenterande celler och är kopplade till anti-CD3 och anti-CD28 mAb, vilket erbjuder en enkel metod för aktivering och expansion av T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De representativa resultaten visar gatingstrategin som beskrivs i ovanstående protokoll. Resultaten visar också analysen av T-cellproliferationsaktiviteten efter samkulturen med transplantatinfiltrerande makrofager. Den in vitro- undertryckande kapaciteten hos makrofagundergrupper analyserades i figur 4 . Resultaten indikerar att Ly6C lo Ly6G - makrofagerna erhållna från tolererade mottagare är undertryckande. Resultaten visar också att Ly6C int Ly6G + -celler uppvisar en blygsam undertryckskapacitet. Endast Ly6C lo Ly6G - celler befordrade expansion av CD4 + Foxp3 + Treg in vitro . Tillsammans stöder dataen slutsatsen att transplantat-infiltrerande CD11b + Ly6C lo Ly6G - makrofager har många av de egenskaper som rapporterats vara associerade med monocyt-härledda suppressorceller 12 , iCluding deras förmåga att hämma CD8 T-cell proliferation 13 och för att främja CD4 + Foxp3 + Treg expansion 14 .
Figur 1: Djurmodell. ( A ) Balb / c-hjärtan (H2-d) transplanterades till fullständigt allogen C57BL / 6 (H2-b) som tidigare beskrivits 10 . Anastomos, av mottagarens cava ven och abdominal aorta med givarens lungartär och uppåtgående aorta visas. Mottagande möss behandlades med 250 | ig anti-CD40L mAb (klon MR1) för toleransinduktion på dagarna 0, 2 och 4, som vi nyligen rapporterade 4 . Graftfunktionen övervakades varannan dag genom bukpalpation. Avslag definierades som fullständigt upphörande av ett palpabelt hjärtslag och bekräftades genom direkt visualisering vid laparotomi. ( B ) Representativ bild och ( C ) illustration av anatomisk lokalisering av LN och mjälte (färgad i rött) och allograft (färgad i lila) Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Makrofagssorteringsstrategi. Från övre vänstra hörs leukocyter först genom storlek, och sedan diskuteras singelceller från skräp och klumpar. Från singlets, döda celler är uteslutna gating på DAPI negativa fraktionen. Från levande celler används CD45 + CD11b + för att identifiera myeloidceller. Tre myeloidcellerpopulationer identifieras vidare baserat på Ly6C- och Ly6G-uttryck.= "_ Blank"> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Lymfocytsorteringsstrategi. Representativt flödescytometri resulterar i lymfocytsorteringsstrategin. Från vänster övre grinden på lymfocytpopulationen enligt framåt och sidospridning. Utesluta skräp och klumpar. Från singlets är döda celler uteslutna genom att gata på DAPI-negativa fraktionen. Från levande celler, ( A ) CD8 + CFSE + dubbelpositiva celler och ( B ) alla CD4 + T-celler, som innehåller en fraktion av Foxp3 + positiva celler, är gated. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
![Figur 4]("/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg")
Figur 4: Suppressionsanalys. ( A ) In vitro- undertryckande kapacitet hos varje myeloid delmängd. CD8 + T-cellproliferation övervakades genom CFSE-utspädning efter 96 timmars samkultur med myelida delmängder. ( B ) In vitro Treg expansion av varje myeloid delmängd. Flödescytometrianalys av Foxp3-uttryck på CD4 + T-celler efter 96 timmars samkultur med myeloid delmängder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver de metoder som vi använde för immunokarakterisering av graftinfiltrerande myeloidcellsubset i en experimentell murinmodell av hjärttransplantation, vilken också är tillämplig på andra vävnader i olika murint experimentella modeller. Lågtryckscellsortering vid 20 psi var den föredragna metoden för att isolera ett bra utbyte av rencellsundergrupper. Att upprätthålla renheten hos varje myeloid delmängd är kritisk för att fastställa avgörande resultat av den undertryckande kapaciteten mellan de olika myeloidpopulationerna. Andra förfaranden kan emellertid användas för isolering av olika leukocytpopulationer, såsom kommersiella anrikningspaket. Oberoende av cellpopulationen av intresse är det nödvändigt att erhålla livskraftiga encellsuspensioner från den transplanterade vävnaden för optimala ytfärgnings- och flödescytometri-resultat. Felaktig vävnadsmanipulation kan orsaka cellförlust och därmed ett lågt utbyte av myeloid delmängder. För att öka avkastningen, se till att bearbeta provet uSjunga kalla buffertar och för att behålla cellerna i behållare med låg cellhäftning (polypropenrör). I detta protokoll använde vi Collagenase A från C. histolyticum , som används i stor utsträckning för uppdelning av många typer av vävnader ( t ex lunga, hjärta, muskel, ben, fett, lever, njure, brosk, bröstkörtel, placenta, blod Kärl, hjärna och tumör). För att förhindra förlust av celler vid sortering, rekommenderas starkt att optimera antikropparna och generera en effektiv gatingstrategi. I detta protokoll karakteriserade vi murina makrofager med användning av CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, Ly6C / APC och Ly6G Pe / Cy7 fluorescerande konjugerade antikroppar och flödescytometri. Eftersom epitoperna Ly6C / G inte existerar i människa krävs användningen av CD14 / CD15 / CD16 för sortering av humana myeloidceller 15 .
I multicolor flödescytometrianalys kan möjliga spektralöverlappningar av de valda fluokromerna uppträda. Därför, som noteratRe, kompensationer med en enda fläck är mycket användbara för att undvika överlappande problem. Dessutom rekommenderas antikropptitrering starkt för att minska bakgrundsfluorescensen och för att få optimala resultat. Ett annat viktigt övervägande att minska icke-specifik bindning är användningen av livskraftiga färgämnen. I detta protokoll används DAPI som bärbarhetsfärg. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) är en blå fluorescerande fläck som binder starkt till AT-rika regioner i DNA. Excitationsmängden för DAPI bunden till DNA är 358 nm och emissionsmängden är 461 nm. När det används enligt protokollet fläckar DAPI kärnor specifikt, med liten eller ingen cytoplasmatisk märkning, med undantag av döda celler i flödesanalysen. Beroende på vilken panel antikroppar som valts kan emellertid andra livsdugliga färgämnen, såsom 7-aminoaktinomycin D (7-AAD) och propidiumjodid (PI) användas. Noggrann dödcellsutslagning och levande cellidentifikation är en förutsättning för att framgångsrikt övervaka in vitro- T-celler, eftersom det är imporTenderar att ha förfaranden som kan följa lymfocytproliferation med minimal störning av cellens livskraft och funktion.
Såsom nämnts ovan finns det kritiska steg för cellmärkning och proliferationsanalyser med cellspårningsfärger såsom CFSE. Som ett exempel som beskrivs i litteraturen måste noggrann uppmärksamhet ägnas åt uteslutning av döda / döende celler för att uppnå jämn fördelning och särskiljbara dottertoppar vid användning av CFSE 16 . Det finns många kommersiellt tillgängliga cellspårningsfärger att välja mellan, beroende på färgpaneler. Som ett alternativ till cellspårningsfärger utförs tymidintitrerade analyser för att utvärdera proliferationen av lymfocyter och andra celler i cancerstudier 13 , 14 . Tymidininkorporationsprotokoll utvärderar replikationen av DNA under celldelning genom mätningen av radioaktivt märkt 3H- eller 14C-tymidin. Även om denna metod iS ganska känsliga och väl etablerade, är de stora nackdelarna med tymidintitrerad teknik att den involverar radioaktivitet och inte tillhandahåller information på encellsnivå. Å andra sidan ger CFSE-flödescytometrianalys tydlig information om att reagera lymfocytundergrupper och har mindre inter- och intralaboratorisk variabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi bekräftar de tekniska bidrag från flödescytometri, mikrokirurgi och biologiska / patologiska centra av forskningsexpertis på Mount Sinai. Detta arbete stöddes av COST Action BM1305: Åtgärder för att fokusera och accelerera celltolerogen terapi (FACTT), utvecklingsfonderna Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Institute, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R och SAF2016-80031-R JO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V.
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
