Summary
Makrophagen sind Plastikzellen des hämatopoetischen Systems, die eine entscheidende Rolle bei der schützenden Immunität und Homöostase haben. In diesem Bericht beschreiben wir optimierte in vitro- Techniken zur phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von pfropf-infiltrierenden regulatorischen Makrophagen, die sich im transplantierten Organ unter toleranten Bedingungen ansammeln.
Abstract
Makrophagenakkumulation in transplantierten Organen ist seit langem als ein Merkmal der Allotransplantatabstoßung erkannt worden 1 . Immunogene Monozyten infiltrieren das Allotransplantat früh nach der Transplantation, pflegen eine pfropfreaktive Reaktion gegen das transplantierte Organ und initiieren die Organabstoßung 2 . Jüngste Daten deuten darauf hin, dass unterdrückende Makrophagen eine erfolgreiche Langzeit-Transplantation 3 ermöglichen und für die Induktion der Transplantationstoleranz erforderlich sind 4 . Dies deutet auf ein multidimensionales Konzept der Makrophagen-Ontogenese, Aktivierung und Funktion hin, das eine neue Roadmap für die Isolierung und Analyse der Makrophagen-Funktion erfordert. Aufgrund der Plastizität von Makrophagen ist es notwendig, eine Methodik zur Isolierung und Charakterisierung von Makrophagen in Abhängigkeit von der Gewebeumgebung vorzusehen und ihre Funktionen nach verschiedenen Szenarien zu definieren. Hier beschreiben wirEin Protokoll für die Immuncharakterisierung von Transplantat-infiltrierenden Makrophagen und die Methoden, mit denen wir ihre Fähigkeit, die CD8 + T-Proliferation zu hemmen, funktionell zu bewerten und die CD4 + Foxp3 + Treg-Expansion in vitro zu fördern.
Introduction
Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die Funktion von Gewebe-infiltrierenden Makrophagen, die aus kardialen Allotransplantaten isoliert wurden, nach ihrer Fähigkeit, T-Zell-Antworten zu modulieren, zu untersuchen. In der Literatur weithin beschrieben, sind fluoreszierende Zellverfolgungsfarbstoffe in Kombination mit Durchflusszytometrie mächtige Werkzeuge, um die suppressive Funktion spezifischer Zelltypen in vitro und in vivo zu untersuchen . Unser Protokoll folgt dem Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) -Verfahren zur Überwachung der Lymphozytenproliferation in vitro .
Wenn eine CFSE-markierte Zelle sich teilt, erhält ihre Nachkommenschaft die Hälfte der Anzahl der Carboxyfluorescein-markierten Moleküle 6 . Die entsprechende Abnahme der Zellfluoreszenz durch Durchflusszytometrie kann verwendet werden, um die Zellteilung zu beurteilen, wobei die Kapazität der suppressiven Makrophagen überwacht wird, um T-Zell-Immunantworten zu modulieren. Da CFSE ein Fluorescein-basierter Farbstoff ist, ist er mit einem brOad Bereich der anderen Fluorochrome, so dass es für Multi-Farb-Durchflusszytometrie. Die geeignete Wahl der Fluorochrome für die Phänotypisierung ist auch wichtig, um eine übermäßige spektrale Überlappung zu vermeiden und die Unfähigkeit, Antikörper-positive Zellen zu erkennen, insbesondere mit sichtbaren Proteinfarbstoffen wie CFSE 7 .
Es gibt viele Vorteile der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen gegenüber alternativen Techniken, die die Zellproliferation messen, wie der Thymidin-Inkorporationstest, der radioaktiv markiertes Thymidin (TdR) 8 verwendet. Dieser Assay verwendet tritiiertes Thymidin ( 3 H-TdR), das während der Mitosezellteilung in neue Stränge chromosomaler DNA eingebaut wird. Eine Sicherheitsbedeutung, die mit diesem Assay verbunden ist, ist die Verwendung von Radioisotopen, da ein Szintillationsbeta-Zähler verwendet wird, um die Radioaktivität in der aus den Zellen gewonnenen DNA zu messen, um das Ausmaß der Zellteilung zu bestimmen. Methodisch ist der tritiierte Thymidin assAy ist nicht flexibel genug, um wichtige klinische Laborbeschränkungen wie z. B. niedrige Anzahl von Zellen und verzögerte Analyse nach der Färbung anzupassen. Im Gegenteil wurde gezeigt, dass die CFSE-Färbung die Zellproliferation verhindert und kritische Aktivierungsmarker wie CD69, HLA-DR und CD25 9 stört. Daher ist das Verständnis von Vorteilen und Einschränkungen jeder Methodik, insbesondere bei mehrfarbigen Studien, bei denen mehrere Farbstoffe verwendet werden, um verschiedene Zelltypen zu verfolgen, entscheidend für die Erzielung genauer und reproduzierbarer Ergebnisse.
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Protocol
In dieser Studie sind Mäuse in Übereinstimmung mit den Vereinigten Staaten Department of Agriculture Leitlinien und die Empfehlungen der Public Health Service Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren untergebracht. Alle experimentellen Techniken, die den tierischen Gebrauch beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Utilization Committee (IACUC) -approved Protokolle der Mount Sinai School of Medicine durchgeführt.
1. Medienvorbereitung
- Vorbereiten des vollständigen RPMI 1640-Mediums mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (10.000 U / ml) unter Verwendung von 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht essentiellen Aminosäuren, 5 mM HEPES und 0,05 mM 2 -captoethanol
2. Allograft-Isolierung und Einzelzell-Suspension
ANMERKUNG: Die Transplantations- und Anastomosetechnik der Pulmonalarterie und der minderwertigen Cava-Vene wurde zunächst von Corry und Mitarbeitern beschrieben und kann in Liu & Kang visualisiert werdenS = "xref"> 10 , 11 ( Abbildung 1A ).
- Anästhesieren einer transplantierten Maus mit 4-5% Isofluran in einer Induktionskammer. Opfer es durch zervikale Versetzung.
- Machen Sie eine Mittellinie Bauch-Inzision mit Standard-Schere und entfernen Sie die Bauch-Inhalte, um die Aorta zu lokalisieren.
ANMERKUNG: Das transplantierte Herz wird auf der rechten Seite der Empfangsabdominalaorta sein (Abbildung 1B ). - Ziehen Sie das Transplantat vorsichtig mit feiner Zigarettenzange heraus und legen Sie es sofort in eiskaltes RPMI-Medium.
HINWEIS: Mit einer Chirurgie Schere, um das Transplantat von der Aorta zu trennen, kann das Transplantat beschädigen und dazu führen, dass etwas Gewebe an den Empfänger haften bleibt. - Nachdem alle Transplantate gesammelt wurden, verschieben Sie sie in eine sterile Kulturhaube für die Gewebeverarbeitung. Legen Sie das Transplantat in eine Petrischale und würfeln Sie das Gewebe in kleine Stücke (1 mm) mit sterilen, stumpfen, mikrochirurgischen Scheren.
- Mit scharfzähnenEps, transferieren die Stücke in ein 50 ml-Röhrchen mit 5 ml Kollagenase A (0,1 mg / ml Kollagenase in sterilem 1x PBS). Inkubieren Sie es für 1 h in einem 37 ° C Bad.
- Füge 5 ml RPMI-Medium hinzu, um die Kollagenase zu neutralisieren und die Probe durch ein 100 μm Sieb mit Hilfe des Kolbens einer 1 ml-Spritze zu transferieren.
- Die Probe bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C abtropfen lassen.
- Das Pellet wird in 1 ml ACK-Lysepuffer resuspendiert. Gut mischen und 5 min bei 4 ° C inkubieren.
- Füge 1 ml RPMI-Medium hinzu, um den Lysepuffer zu neutralisieren und die Probe bei 400 xg für 5 m bei 4 ° C zu spinnen.
- Das Zellpellet wird in 200 μl RPMI-Medium resuspendiert und auf ein 5-ml-Polypropylen-Rundbodenrohr überführt.
HINWEIS: Polypropylenrohre unterstützen weniger Haftung. Auch die Aufrechterhaltung der Zellen bei niedriger Temperatur, wie 4 ° C, verringert die Haftung.
3. Isolierung von Graft-infiltrierenden Makrophagen mit Fluoreszenz-aktivierter Zell-SortierungIng
- Blockieren Sie unerwünschte spezifische Bindung an myeloiden Zellen unter Verwendung von Fc-Rezeptor-blockierenden mAb (Ratten-anti-Maus CD16 / 32). Füge 1-2 μl pro Probe hinzu, 15 min vor der Oberflächenfärbung.
- Flecken mit anti-Maus CD11b Percp / Cy5.5 (0,6 μg / μL Endkonzentration im RPMI-Medium), anti-Maus CD45 APC / eFluor780 (0,6 μg / μL), anti-Maus Ly6C APC (2 μg / μL) Und anti-Maus Ly6G Pe / Cy7 (2 & mgr; g / & mgr; l). Decken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie ab, um die fluoreszierenden Antikörper vor Licht zu schützen und die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 ° C für 45 min zu inkubieren.
HINWEIS: Für Einmal-Kompensationen, bereiten Sie ein negatives Kontrollrohr (kein Fleck) und Röhrchen mit Zellen, die einzeln mit jedem der Fluorochrome markiert sind. Um das Tor einzurichten, können Isotyp-Kontrollen besonders für Ly6C (IgG2a) und Ly6G (IgG2b) verwendet werden. - Die Zellen zweimal mit RPMI-Medium waschen und bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zähle die Zellen mit Trypanblau und einem HämocytometeR und verdünnen sie in 1 ml RPMI-Medium pro 1 x 10 6 Zellen. Vor der Sortierung die Proben durch eine 5 ml, 70 μm Zelle Siebschlauchkappe überführen. Füge DAPI (1 μg / mL) als Zell-Lebensfähigkeitsmarker hinzu und gehe weiter.
- Weil Makrophagen empfindliche und zerbrechliche Zellen sind, setzen Sie die Sortierbedingungen auf 20 psi und verwenden eine 100 μm Düsengröße, um Makrophagen mit einem 4-Wege-Reinheitsmodus zu isolieren.
- Bereiten Sie Sammelröhrchen mit 1 ml RPMI-Medium in einem 5-ml-Polypropylen-Rohr vor.
- Mit der Sortierersoftware öffnen Sie das neue Experiment und wählen das Leer-Experiment mit einem leeren Panel aus, um Einstellungen zu definieren.
- Richten Sie einen Punkt-Plot ein, der die Vorwärts- (FSC) versus ( vs. ) Seitenstreuung (SSC) anzeigt und auf alle Leukozyten, ohne Schutt und Klumpen mit der niedrigsten Vorwärts- und Seitenstreuung, Von diesem übergeordneten Gate, erstellen Sie eine neue Punkt-Diagramm, das SSC vs. DAPI und Gate auf DAPI-Zellen zeigt.
- Auf dieser neu geschalteten Bevölkerung erstellen Sie adOt-Plot, das CD11b gegen CD45 und Gate auf doppelt-positiven (CD11b + CD45 + ) Makrophagen und Neutrophilen zeigt.
- Von hier aus schaffen Sie ein endgültiges Punktdiagramm, das Ly6C vs. Ly6G anzeigt und die wünschenswerten Populationen lügt: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - und Ly6C int Ly6G + (Abbildung 2 ).
- Nach der Sortierung auf Reinheit und Zelllebensfähigkeit (> 90%) prüfen und die Sammelröhrchen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau und einem Hämocytometer und resuspendieren sie in der gewünschten Konzentration ( z. B. 1 x 10 6 Makrophagen / ml) in komplettem RPMI-Medium.
- Platte 50 x 10 3 Makrophagen pro Vertiefung in einer 96-Well-Rundbodenplatte mit einem Endvolumen von 100 & mgr; l vollständigem RPMI-Medium. Lassen Sie die Zellen für mindestens 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2 ungestört.
4. isolatioN von T-Zellen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung
HINWEIS: C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / Jn ist ein X-verknüpfter, gezielter Knock-in-Maus-Stamm, der Zellen markiert, die das Foxp3 (Gabelkopf-Kasten-P3) -Gen mit monomerem rotem fluoreszierendem Protein (mRFP) exprimieren.
- Anästhesieren und Opfern von C57BL / 6 und C57BL / 6-Foxp3tm1Flv / J (H-2b) Mäusen, wie zuvor in Schritt 2.1 beschrieben. Isoliere die Milz und Lymphknoten (LN: Leisten-, Lenden-, Axillar-, Brachial- und Gebärmutterhalskrebs) und platziere sie schnell in eiskaltes RPMI-Medium.
- Um das LN zu isolieren, platziere die Maus in eine Rückenlage, mache einen Mittellinie Hautschnitt von unten nach oben, sorgfältig schneiden das Bauchfell und sanft Ausbreitung der Haut auseinander. Sobald alle Leisten-, Lenden-, Achsel-, Brachial- und Zervix-LN gesammelt werden (Abbildung 1C , in Rot gefärbt), schneiden Sie das Peritoneum und isolieren die Milz an der oberen linken Seite des Darms.
- Dispergieren der Milz und LN mit einem 100 μm Filter platziertOben auf einem 50 mL Rohr. Mit dem Kolben einer 1-ml-Spritze das Gewebe vorsichtig drücken. Spülen Sie den Filter mit RPMI-Medium so oft wie nötig, bis es sauber ist.
ANMERKUNG: LN und Milz von jeder Maus können zusammen in der gleichen Tube zusammengefasst werden. - Bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C abreiben.
- Das Pellet wird in 2 ml ACK-Lysepuffer resuspendiert. Gut mischen und 5 min bei 4 ° C inkubieren.
- Füge 2 ml RPMI-Medium hinzu, um den Lysepuffer zu neutralisieren. Bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C abreiben.
- Das Zellpellet wird in 200 & mgr; l RPMI-Medium resuspendiert und auf ein 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr gegeben.
- Fleck für anti-Maus CD4 APC (0,6 μg / μL) und / oder anti-Maus CD8 PeCy7 (2 μg / μL). Bedecken Sie die Rohre mit Aluminiumfolie, um die fluoreszierenden Antikörper vor Licht zu schützen, und inkubieren Sie die Röhrchen im Kühlschrank bei 4 ° C für 45 min.
HINWEIS: Für Einmal-Kompensationen, bereite ein Negativ-Kontrollrohr (kein Fleck) undRöhrchen mit einzeln markierten Zellen mit jedem der Fluorochrome. - Die Zellen zweimal mit RPMI-Medium waschen und bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zähle die Zellen mit Trypanblau und einem Hämocytometer.
ANMERKUNG: CFSE-Farbstoff wird als Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester-Pulver gewöhnlich bei 50 & mgr; g bereitgestellt. Füge 18 μL DMSO zu einer Ampulle von CFSE für eine endgültige Stammlösung von 5 mM hinzu und lag bei -20 ° C für mehrere Monate. - Für die CFSE-Markierung werden CD8-gefärbte Zellen in einer Konzentration von bis zu 10 6 Zellen pro ml in PBS bei einer Endarbeitskonzentration von 5 μM CFSE aus der Stammlösung resuspendiert. Inkubieren sie in einem Bad bei 20 ° C für 5 min wie zuvor beschrieben 6 .
HINWEIS: (CRITICAL STEP) Für Zellen mit einer niedrigen Konzentration (≤10 6 pro ml) ist es wesentlich, dass die Zellen in Gegenwart von Protein markiert werden, um die toxischen Effekte von CFSE zu puffern. Daher kann PBS 5% FBS enthalten. Beachten Sie, dass wenn ichDium verwendet wird, können freie Aminosäuren die Markierungseffizienz durch Konkurrenz für CFSE senken. - Neutralisieren des CFSE mit 2 ml RPMI-Medium. Spin bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C. Füge 1 ml RPMI-Medium pro 1 x 10 6 CD8 T-Zellen hinzu.
- Vor der Sortierung die Probe durch ein 70 μm Zellsieb auf eine 5 mL Röhrchenkappe überführen. Füge 50 μl 1x DAPI (1 μg / mL) als Zelllebensfähigkeitsmarker hinzu und gehe zur Sortierung vor.
HINWEIS: 1x bedeutet 1: 1 Verhältnis des Reagenzes gegenüber anderen Bestandteilen. - Stellen Sie die Sortierbedingungen auf 20 psi und 100 μm Düsengröße ein, um doppelt-positive CD8 + CFSE + T-Zellen zu isolieren (Abbildung 3A ).
- Bereiten Sie Sammelröhrchen mit 1 ml RPMI-Medium in einem 5-ml-Polypropylen-Röhrchen vor und gehen Sie weiter.
- Mit der Sortierersoftware öffnen Sie das neue Experiment und wählen das Leer-Experiment mit einem leeren Panel aus, um Einstellungen zu definieren.
- Für CD4 + T-Zell-Isolation, richten Sie ein Punkt-Diagramm, dass disSpielt den FSC gegen SSC und Gate auf Lymphozyten, ohne Schutt sowie große körnige Zellen, wie dendritische Zellen.
- Von diesem übergeordneten Gate, erstellen Sie eine neue Punkt-Diagramm, das SSC vs. DAPI und Gate auf DAPI-Zellen zeigt.
- Auf dieser neu geschalteten Population erstellen Sie ein Punktdiagramm, das SSC vs. CD4 anzeigt, um alle CD4 + Zellen zu isolieren (Abbildung 3B ). Alternativ kann ein anti-CD3-mAb verwendet werden, um die Isolierung von reinen T-Zellpopulationen zu gewährleisten.
HINWEIS: Ein kleiner Bruchteil aller CD4 + T-Zellen (5-10%) sollte Foxp3 + mRFP + sein .
- Nach der Sortierung auf Reinheit und Zelllebensfähigkeit (> 90%) prüfen und die Sammelröhrchen bei 400 xg für 5 min bei 4 ° C drehen. Zähle die Zellen mit Trypanblau und einem Hämocytometer. Resuspend unter Verwendung von 1 ml vollständigem RPMI-Medium pro 2 × 10 6 T-Zellen.
- Einstellen des Suppressionstests durch Kultivierung von T-Zellen mit zuvor sortierten Makrophagen. Teller 10 x 10 4 CD4 + T und 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T-Zellen in der gleichen Vertiefung in einem Endvolumen von 100 & mgr; l vollständigem RPMI-Medium. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO 2 für 96 h.
HINWEIS: Makrophagen und T-Zellen wurden im Verhältnis 1: 4 verwendet. - Stimulieren der T-Zellteilung durch Waschen von T-Zell-Aktivator CD3 / CD28-Magnetperlen in 2 ml PBS, bevor sie verwendet werden, um den Azid-haltigen Puffer zu entfernen. Füge 5 μl Maus-T-Zell-Aktivator CD3 / CD28 Perlen pro Vertiefung hinzu.
HINWEIS: Magnetperlen sind ähnlich wie Antigen-präsentierende Zellen und sind mit anti-CD3 und anti-CD28 mAb gekoppelt und bieten ein einfaches Verfahren zur Aktivierung und Erweiterung von T-Zellen.
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Representative Results
Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die im obigen Protokoll beschriebene Gating-Strategie. Die Ergebnisse zeigen auch die Analyse der T-Zell-Proliferationsaktivität nach der Co-Kultur mit pfropf-infiltrierenden Makrophagen. Die in vitro- suppressive Kapazität von Makrophagen-Teilmengen wurde in Abbildung 4 analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die aus tolerierten Empfängern gewonnenen Ly6C lo Ly6G - Makrophagen unterdrückend sind. Die Ergebnisse zeigen auch, dass Ly6C int Ly6G + Zellen eine bescheidene Unterdrückungskapazität aufweisen. Nur Ly6C lo Ly6G - Zellen förderten die Erweiterung von CD4 + Foxp3 + Treg in vitro . Zusammen die Daten stützen zusammen, dass die Transplantat-infiltrierenden CD11b + Ly6C lo Ly6G - Makrophagen viele der Eigenschaften besitzen, von denen berichtet wird, dass sie mit den Monozyten-abgeleiteten Suppressorzellen 12 assoziiert sindUm ihre CD8-T-Zell-Proliferation 13 zu hemmen und die CD4 + Foxp3 + Treg-Expansion zu fördern.
Abbildung 1: Tiermodell ( A ) Balb / c-Herzen (H2-d) wurden wie oben beschrieben in vollständig allogenes C57BL / 6 (H2-b) transplantiert. Anastomose, der Cava-Vene des Empfängers und der Bauchaorta mit der Pulmonalarterie des Spenders und der aufsteigenden Aorta wird gezeigt. Empfänger-Mäuse wurden mit 250 μg anti-CD40L-mAb (Klon MR1) für die Toleranzinduktion an den Tagen 0, 2 und 4 behandelt, wie wir vor kurzem berichteten. Die Graft-Funktion wurde jeden zweiten Tag durch Abdominalpalpation überwacht. Ablehnung wurde als vollständige Beendigung eines tastbaren Herzschlags definiert und wurde durch direkte Visualisierung bei bestätigt Laparotomie. ( B ) Repräsentatives Bild und ( C ) Darstellung der anatomischen Lage von LN und Milz (rot gefärbt) und das Allograft (farbig in lila) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Makrophagen-Sortierstrategie Ausgehend von der oberen linken, werden die Leukozyten zuerst von der Größe gated, und dann werden Singulettzellen von Trümmern und Klumpen unterschieden. Aus Einzelstücken werden tote Zellen ausgeschlossen, die auf der DAPI-Negativfraktion ankommen. Von lebenden Zellen wird CD45 + CD11b + verwendet, um myeloide Zellen zu identifizieren. Drei myeloische Zellpopulationen werden weiter basierend auf Lyon- und Ly6G-Expression identifiziert.= "_ Blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Lymphozytensortierstrategie Repräsentative Durchflusszytometrieergebnisse für die Lymphozytensortierstrategie. Von oben links, Tor auf der Lymphozytenpopulation nach Vorwärts- und Seitenstreuung. Trümmer und Klumpen ausschließen. Aus Einzelstücken werden tote Zellen durch Gating auf die DAPI-Negativfraktion ausgeschlossen. Aus lebenden Zellen werden ( A ) CD8 + CFSE + doppelpositive Zellen und ( B ) alle CD4 + T-Zellen, die einen Bruchteil von Foxp3 + positiven Zellen enthalten, vergeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 4: Unterdrückungstest ( A ) In vitro- Unterdrückungskapazität jeder myeloiden Teilmenge. CD8 + T-Zell-Proliferation wurde durch CFSE-Verdünnung nach 96 h Co-Kultur mit myeloiden Teilmengen überwacht. ( B ) In-vitro- Treg-Expansion jeder myeloiden Teilmenge. Durchflusszytometrieanalyse der Foxp3-Expression auf CD4 + -T-Zellen nach 96 h Co-Kultur mit myeloiden Teilmengen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Methoden, mit denen wir pfropf-infiltrierende myeloide Zelluntergruppen in einem experimentellen Mausmodell der Herztransplantation immunocharakterisieren, was auch für andere Gewebe in verschiedenen murinen experimentellen Modellen gilt. Die Niederdruckzellsortierung bei 20 psi war die bevorzugte Methode, um eine gute Ausbeute an reinen Zelluntergruppen zu isolieren. Die Aufrechterhaltung der Reinheit jeder myeloiden Teilmenge ist entscheidend, um schlüssige Ergebnisse der Unterdrückungskapazität zwischen den verschiedenen myeloiden Populationen herzustellen. Jedoch können andere Verfahren für die Isolierung von verschiedenen Leukozytenpopulationen verwendet werden, wie zum Beispiel kommerzielle Anreicherungs-Kits. Unabhängig von der interessierenden Zellpopulation ist die Erzielung lebensfähiger Einzelzell-Suspensionen aus dem transplantierten Gewebe für optimale Oberflächenfärbung und Durchflusszytometrie erforderlich. Falsche Gewebemanipulation kann Zellverlust und damit eine geringe Ausbeute an myeloiden Teilmengen verursachen. Um die Ausbeute zu erhöhen, vergewissern Sie sich, die Probe zu verarbeitenSingen kalte Puffer und pflegen die Zellen in Behältern mit geringer Zelladhäsion (Polypropylen-Röhrchen). In diesem Protokoll verwendeten wir Collagenase A aus C. histolyticum , das weithin für die Disaggregation vieler Gewebearten ( zB Lunge, Herz, Muskel, Knochen, Adipose, Leber, Niere, Knorpel, Milchdrüse, Plazenta, Blut) verwendet wird Gefäß, Gehirn und Tumor). Um den Verlust von Zellen während der Sortierung zu verhindern, ist die Optimierung der Antikörper und die Erzeugung einer effizienten Gating-Strategie sehr zu empfehlen. In diesem Protokoll charakterisierten wir murine Makrophagen mit CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, Ly6C / APC und Ly6G Pe / Cy7 fluoreszenz-konjugierten Antikörpern und Durchflusszytometrie. Da die Epitope Ly6C / G nicht im Menschen existieren, ist die Verwendung von CD14 / CD15 / CD16 für die Sortierung menschlicher myeloider Zellen erforderlich 15 .
Bei der Mehrfarben-Durchflusszytometrieanalyse können mögliche Spektralüberlappungen der gewählten Fluorochrome auftreten. Daher, wie erwähnt befoRe, Single-Fleck-Kompensationen sind sehr hilfreich, um überlappende Probleme zu vermeiden. Darüber hinaus ist die Antikörpertitration dringend empfohlen, um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren und optimale Ergebnisse zu erzielen. Eine weitere wichtige Überlegung zur Verringerung der unspezifischen Bindung ist die Verwendung von Lebensfähigkeitsfarbstoffen. In diesem Protokoll wird DAPI als Lebensfähigkeitsfarbstoff verwendet. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindol) ist ein blauer Fluoreszenzfleck, der stark an AT-reiche Regionen in der DNA bindet. Das Anregungsmaximum für DAPI, das an DNA gebunden ist, beträgt 358 nm und das Emissionsmaximum beträgt 461 nm. Bei der Verwendung nach dem Protokoll, DAPI Flecken Kerne speziell, mit wenig oder keine zytoplasmatische Markierung, ohne tote Zellen in der Durchfluss-Analyse. Je nach dem Panel der gewählten Antikörper können jedoch andere Lebensfähigkeitsfarbstoffe wie 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) und Propidiumiodid (PI) verwendet werden. Eine genaue Totzelle Ausgrenzung und Live-Zelle Identifikation ist eine Voraussetzung für die erfolgreiche Überwachung in vitro T-Zellen, wie es impor istUm Verfahren zu haben, die der Lymphozytenproliferation mit minimaler Störung der Zelllebensfähigkeit und -funktion folgen können.
Wie oben erwähnt, gibt es kritische Schritte zur Zellmarkierung und Proliferationsanalysen mit Zellverfolgungsfarbstoffen wie CFSE. Als Beispiel, das in der Literatur beschrieben ist, muss sorgfältig auf den Ausschluss von toten / sterbenden Zellen geachtet werden, um bei der Verwendung von CFSE 16 einheitliche Verteilungen und unterscheidbare Tochterspitzen zu erhalten. Es gibt viele handelsübliche Zellverfolgungsfarbstoffe, je nach den Färbeplatten. Als Alternative zu Zellverfolgungsfarbstoffen wird ein Thymidin-titriierter Assay durchgeführt, um die Proliferation von Lymphozyten und anderen Zellen in Krebsstudien 13 , 14 zu bewerten. Thymidin-Inkorporationsprotokolle beurteilen die Replikation von DNA während der Zellteilung durch das Maß von radioaktiv markiertem 3H- oder 14C-Thymidin. Obwohl diese Methode iS ziemlich empfindlich und gut etabliert, die wichtigsten Nachteile für Thymidin titrierte Technik ist, dass es Radioaktivität und bietet keine Informationen auf der einzelnen Zelle Ebene. In der anderen Hand liefert die CFSE-Durchflusszytometrie-Analyse klare Informationen über die Reaktion von Lymphozyten-Teilmengen und hat weniger inter- und intralaboratorische Variabilität.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir anerkennen die technischen Beiträge der Durchflusszytometrie, der Mikrochirurgie und der Bio- / Pathologie-Zentren der Forschungs-Exzellenz am Berg Sinai. Diese Arbeit wurde von der COST-Aktion BM1305 unterstützt: Maßnahmen zur Fokussierung und Beschleunigung zelltolerogener Therapien (A FACTT), dem Entwicklungszentrum des Sinai Recanati / Miller Transplantationsinstituts, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R und SAF2016-80031-R JO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
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