Summary
Makrofajlar hematopoietik sistemin koruyucu immünite ve homeostazda önemli bir role sahip plastik hücrelerdir. Bu raporda, tolerogenik koşullar altında nakledilen organda biriken greft infiltrasyon düzenleyici makrofajları fenotipik ve fonksiyonel olarak karakterize eden optimize in vitro teknikler açıklanmaktadır.
Abstract
Nakil yapılan organlarda makrofaj birikimi, allograft reddi 1'in bir özelliği olarak uzun zamandır bilinmektedir. Immunogenic monocytes, transplantasyondan hemen sonra allogrefte infiltre olur, nakledilen organa karşı bir greft reaktif yanıt verir ve organ reddi başlatır 2 . Son yıllardaki veriler, baskılayıcı makrofajların başarılı uzun vadeli transplantasyon 3'ü kolaylaştırdığını ve transplantasyon toleransının indüksiyonu için gerekli olduğunu göstermektedir4. Bu makrofaj fonksiyonunun izolasyonu ve analizi için yeni bir yol haritası isteyen, makrofaj ontogenezi, aktivasyonu ve fonksiyonunun çok boyutlu bir kavramını önermektedir. Makrofajların esnekliği nedeniyle makrofajları doku ortamına bağlı olarak izole etmek ve karakterize etmek için bir metodoloji sağlamak ve fonksiyonlarını farklı senaryolara göre tanımlamak gerekir. İşte, açıklıyoruzGreft sızdıran makrofajların bağışıklık karakterizasyonu için bir protokol olabilir ve CD8 + T proliferasyonunu inhibe etme ve CD4 + Foxp3 + Treg genleşmesini in vitro teşvik etme kapasitelerini fonksiyonel olarak değerlendirmede kullandığımız yöntemler olabilir .
Introduction
Bu protokol, T hücre yanıtlarını modüle edebilme yeteneklerine göre, kardiyak allograftlardan izole edilen dokuya sızdıran makrofajların fonksiyonunu incelemek için in vitro teknikleri tanımlamaktadır. Literatürde yaygın olarak tarif edilen floresan hücre izleme boyaları, akış sitometrisiyle kombinasyon halinde, in vitro ve in vivo spesifik hücre tiplerinin baskılayıcı fonksiyonlarını incelemek için güçlü araçlardır . Protokolümüz , in vitro lenfosit proliferasyonunu izlemek için karboksiflüoresase süksinimidil ester (CFSE) yöntemini izlemektedir.
Bir CFSE etiketli hücre bölünürse, nesli karboksiflüoresantin ile etiketlenen moleküllerin sayısının yarısını alır 6 . Akış sitometresi ile hücre floresanındaki karşılık gelen düşüş, hücre bölünmesini değerlendirmek için, baskılayıcı makrofajların T hücre immün yanıtlarını modüle etme kapasitesini izlemek için kullanılabilir. CFSE floresein bazlı bir boya olduğu için, bir br ile uyumludur.Çok renkli akış sitometrisi için uygun hale getiren, diğer florokromlardan daha geniş bir yelpazede. Fenotipleme için florokromların uygun seçimi, aşırı spektrum örtüşmesini ve özellikle CFSE 7 gibi görünür protein boyaları ile antikor pozitif hücrelerin tanınamamasını önlemek açısından önemlidir.
Floresan boyaları, radyoetiketlenmiş timidin (TdR) 8 kullanan timidin toplama testi gibi hücre çoğalmasını ölçen alternatif teknikler üzerine kullanmanın birçok avantajı vardır. Bu deney, mitotik hücre bölünmesi sırasında kromozomal DNA'nın yeni iplikçiklerine dahil edilmiş, parçalanmış timidin (3H-TdR) kullanmaktadır. Bu tahlil ile ilgili bir güvenlik endişesi, radyoizotopların kullanılmasıdır, çünkü bir sintilasyon beta-sayacı, hücre bölünmesinin derecesini belirlemek için hücrelerden alınan DNA'daki radyoaktiviteyi ölçmek için kullanılır. Metodolojik olarak, kıyılmış timidin kıçAy, boyama sonrası düşük hücre sayısı ve gecikmiş analiz gibi önemli klinik laboratuvar kısıtlamalarına uyacak kadar esnek değildir. Aksine, CFSE boyamasının hücre proliferasyonunu önlediği ve CD69, HLA-DR ve CD259 gibi kritik aktivasyon belirteçlerine müdahale ettiği gösterilmiştir. Bu nedenle, her bir metodolojinin avantajlarını ve kısıtlamalarını anlamak, özellikle farklı renk türlerini izlemek için birden fazla boyanın kullanıldığı çok renkli çalışmalar için doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik önem taşır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada fareler, Birleşik Devletler Tarım Bakanlığı yönergelerine ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Halk Sağlığı Hizmeti Kılavuzu'nun önerileri uyarınca yerleştirildi. Hayvan kullanımını içeren tüm deneysel teknikler, Sina Üniversitesi Tıp Fakültesi'nin onaylı protokolleri olan Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) uyarınca gerçekleştirildi.
1. Medya Hazırlığı
- 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM zorunlu olmayan amino asitler, 5 mM HEPES ve 0.05 mM 2 kullanarak,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin (10,000 U / mL) ile komple RPMI 1640 ortamı hazırlayın. mersaptoetanol.
2. Allograft İzolasyon ve Tek Hücreli Süspansiyon
NOT: Pulmoner arter ve inferior kava veninin transplantasyon ve anastomoz tekniği başlangıçta Corry ve işbirlikçileri tarafından tanımlanmıştır ve Liu ve Kang'da görselleştirilebilirS = "xref"> 10 , 11 ( Şekil 1A ).
- Bir indüksiyon odasında% 4-5 izofluran içeren bir fare anestezisi. Servikal dislokasyonla onu kurban edin.
- Standart makasla orta hat abdominal insizyon yapın ve aorta lokalize etmek için abdominal içeriği kaldırın.
NOT: Transplante kalp, alıcı abdominal aortanın sağ tarafında olacaktır ( Şekil 1B ). - İnce keskin dişli forseps kullanarak yavaşça grefti çekin ve hemen buz gibi RPMI ortamına yerleştirin.
NOT: Grefti aorta ayırmak için bir ameliyat makasının kullanılması grefte zarar verebilir ve bazı dokuların alıcının üzerine yapışmasına neden olabilir. - Tüm greftler toplandıktan sonra, doku işleme için steril bir kültür başlığına taşıyın. Grefti bir petri kabına yerleştirin ve steril, kütik, mikrocerrahi makası kullanarak dokuyu küçük parçalara (1 mm) zar atın.
- Keskin dişli forc ileEps, parçaları 5 mL kollajenaz A (steril 1x PBS'de 0.1 mg / mL kollajenaz) ile 50 mL'lik bir tüpe aktarın. 37 ° C'lik bir banyoda 1 saat inkübe edin.
- Kollajenazı nötralize etmek için 1 mL'lik bir şırınganın pistonu yardımıyla 100 μm'lik süzgeçle numuneyi aktarmak için 5 mL'lik RPMI ortamı ekleyin.
- Numuneyi 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 xg'de döndürün.
- Pelleti 1 mL ACK liziz tamponuna tekrar süspanse edin. İyi karıştırın ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Liziz tamponunu nötralize etmek için 1 mL RPMI ortamı ekleyin ve numuneyi 4 ° C'de 5 m süreyle 400 xg'de aşağı doğru döndürün.
- RPMI ortamı 200 mcL hücre pelletini süspanse edin ve 5 ml polipropilen yuvarlak tabanlı tüp aktarın.
NOT: Polipropilen tüpler daha az yapışmayı destekler. Ayrıca, hücreleri 4 ° C gibi düşük sıcaklıklarda tutmak, yapışmayı azaltır.
3. Fluoresansla aktive edilmiş Hücre Sıralamasını Kullanarak Greftle Sızma Makrofajlarının İzolasyonuing
- Fc reseptör bloke edici mAb (sıçan anti-fare CD16 / 32) kullanarak miyeloid hücreler üzerindeki istenmeyen spesifik bağlanmayı bloke edin. Yüzey boyamadan 15 dakika önce örnek başına 1-2 μL ekleyin.
- Anti-fare CD11b Percp / Cy5.5 (RPMI ortamında 0.6 μg / μL son konsantrasyon), anti-fare CD45 APC / eFluor780 (0.6 μg / μL), anti-fare Ly6C APC (2 μg / μL) Ve anti-fare Ly6G Pe / Cy7 (2 ug / ml). Floresan antikorları ışığa karşı korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 45 dakika boyunca 4 ° C'de buzdolabında tüpleri inkübe edin.
NOT: Tek leke dengelemeleri için negatif bir kontrol tüpü (leke yok) ve flokromların her biri ile tek tek etiketlenmiş hücreler içeren tüpler hazırlayın. Kapıyı ayarlamaya yardımcı olmak için, izotip kontrolleri özellikle Ly6C (IgG2a) ve Ly6G (IgG2b) için kullanılabilir. - Hücreleri RPMI ortamı ile iki kez yıkayın ve 400 xg'de 5 dakika süreyle 4 ° C'de döndürün. Tripan mavisi ve hemositomet kullanarak hücreleri sayın.R ve 1 x 10 6 hücre başına 1 mL RPMI ortamında seyreltin. Sınıflamadan önce, numuneleri 5 mL, 70 μm hücre süzgeç borusu başlığı ile aktarın. Bir hücre yaşayabilirlik markörü olarak DAPI (1 μg / mL) ekleyin ve sıralama yapmaya devam edin.
- Makrofajlar hassas ve kırılgan hücreler olduğundan, sıralama koşullarını 20 psi'ye ayarlayın ve makrofajları 4 yönlü saflık modu kullanarak izole etmek için 100 μm'lik bir meme boyutu kullanın.
- Toplama tüplerini 1 mL'lik RPMI ortamı ile 5 mL'lik bir polipropilen tüp içerisinde hazırlayın.
- Sorgulayıcı yazılımını kullanarak yeni deneyler açın ve ayarları tanımlamak için boş bir panelle boş deney seçin.
- En düşük ileriye ve yan dağılım gösteren döküntüleri ve kümeleri hariç tutarak, tüm lökositlerde ileri (FSC) karşı yan dağılım (SSC) ve kapıyı gösteren bir nokta çizelgesi kurun. Bu ana kapıda, SSC'yi vs. DAPI ve kapıları DAPI hücrelerinde görüntüleyen yeni bir nokta çizelgesi oluşturun.
- Yeni kontrol edilen bu nüfusta reklam oluşturunCD11b'yi CD45'e ve kapıyı çift-pozitif (CD11b + CD45 + ) makrofajları ve nötrofilleri görüntüleyen ot parsel.
- Buradan Ly6C - Ly6G görüntüleyen ve istenen popülasyonları gösteren son bir nokta çizelgesi oluşturun: Ly6C hi Ly6G - , Ly6C lo Ly6G - ve Ly6C int Ly6G + ( Şekil 2 ).
- Sıralamadan sonra saflık ve hücre yaşayabilirliğini kontrol edin (>% 90) ve toplama tüplerini 4 ° C'de 5 dakika süreyle 400 xg'de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometreyi kullanarak hücreleri sayın ve tam RPMI ortamında istenen konsantrasyonda ( örn., 1 x 10 6 makrofaj / mL) tekrar süspanse edin.
- 100 uL komple RPMI ortamı ile 96 oyuklu, yuvarlak tabanlı bir plakada oyuk başına 50 x 10 3 makrofaj. Hücreleri en az 24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de rahatsız bırakmayın.
4. İzolatioFloresansla Etkinleştirilmiş Hücre Ayırma Kullanan T Hücrelerinin n
NOT: C57BL / 6-Foxp3tmlFlv / Jn, Foxp3 (forkhead kutusu P3) genini monomerik kırmızı flüoresan proteini (mRFP) ile birlikte işaretleyen hücrelere işaret eden, X bağlantılı hedeflenmiş bir kapanmış fare suşudur.
- Adım 2.1'de daha önce anlatıldığı gibi C57BL / 6 ve C57BL / 6-Foxp3tmlFlv / J (H-2b) farelerini anestezikle ve feda edin. Dalak ve lenf düğümlerini (LN: kasık, lomber, aksiller, brakiyal ve servikal) izole edin ve onları hızlıca buz gibi soğuk RPMI ortamına yerleştirin.
- LN'yi izole etmek için fareyi yatay bir pozisyona getirin, alttan üste doğru orta hat cilt insizyonu yapın, dikkatli bir şekilde periton keserek cildi hafifçe dışarıya yayın. Tüm inguinal, bel, aksiller, brakiyal ve servikal LN toplandığında ( Şekil 1C , kırmızı renklidir), periton kesilir ve bağırsağın sol üst tarafındaki dalağı izole eder.
- Dalak ve LN'yi 100 μm'lik bir filtre yerleştirerek ayırın.50 mL'lik bir tüpün üstünde. 1 mL'lik şırınganın pistonu kullanarak, dokuyu hafifçe bastırın. Filtreyi temizleyene kadar RPMI ortamı ile gerektiği kadar çalkalayın.
NOT: Her fareden alınan LN ve dalaklar, aynı tüp içerisinde bir araya getirilebilir. - 4 ° C'de 5 dakika süreyle 400 xg'de döndürün.
- Pelleti 2 mL ACK liziz tamponuna tekrar süspanse edin. İyi karıştırın ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
- Liziz tamponunu nötralize etmek için 2 mL RPMI ortamı ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika süreyle 400 xg'de döndürün.
- RPMI ortamı 200 mcL hücre pelletini süspanse edin ve 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüp aktarın.
- Anti-fare CD4 APC (0.6 μg / μL) ve / veya anti-fare CD8 PeCy7 (2 μg / μL) için boyayın. Floresan antikorları ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün ve 45 dakika süreyle 4 ° C'de buzdolabında tüpleri inkübe edin.
NOT: Tek lekeli telafi için negatif bir kontrol tüpü hazırlayın (leke yoktur) veFlorokromların her biri ile tek tek etiketli hücreler içeren tüpler. - Hücreleri RPMI ortamı ile iki kez yıkayın ve 400 xg'de 5 dakika süreyle 4 ° C'de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
NOT: CFSE boya, genellikle 50 ug'de karboksiflüoresein diasetat süksinimidil ester tozu olarak sağlanır. 5 mM son stok solüsyonu için bir CFSE şişesine 18 uL DMSO ekleyin ve birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklayın. - CFSE etiketi için, CD8 lekeli hücreleri, stok çözeltisinden 5 μM CFSE'nin nihai bir çalışma konsantrasyonunda PBS içinde mL başına 10 6 hücreye kadar bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon haline getirin. Daha önce tarif edildiği gibi 5 dakika süreyle 20 ° C'de bir banyoda inkübe edin 6 .
NOT: (ÖNEMLİ ADIM) Düşük konsantrasyonda (≤10 6 / mL) hücreler için, hücrelerin, CFSE'nin toksik etkilerini tamponlamak için ilave protein varlığında etiketlenmesi gereklidir. Bu nedenle, PBS% 5 FBS içerebilir. Unutmayın ki benDiom kullanılırsa, serbest amino asitler CFSE için rekabet ederek etiketleme verimliliğini düşürebilir. - CFSE'yi 2 mL RPMI ortamı ile nötralize edin. 400 xg'de 5 dakika süreyle 4 ° C'de döndürün. 1 x 10 6 CD8 T hücre başına 1 mL RPMI orta ekleyin.
- Sınıflamadan önce, numuneyi 5 mL'lik tüp kapakta 70 μm'lik hücre süzgeci ile aktarın. Bir hücre canlılığı markörü olarak 50 μL 1x DAPI (1 μg / mL) ekleyin ve sıralama devam edin.
NOT: 1x, reaktifin diğer bileşene göre 1: 1 oranı anlamına gelir. - Çifte pozitif CD8 + CFSE + T hücrelerini izole etmek için sıralama koşullarını 20 psi ve 100 μm nozul boyutunda ayarlayın ( Şekil 3A ).
- Toplama tüplerini 1 mL'lik RPMI ortamı ile 5 mL polipropilen tüp içerisinde hazırlayın ve sıralamaya devam edin.
- Sorgulayıcı yazılımını kullanarak yeni deneyler açın ve ayarları tanımlamak için boş bir panelle boş deney seçin.
- CD4 + T hücre izolasyonu için,Dendritik hücreler gibi büyük taneli hücrelerin yanı sıra enkaz hariç, FSC'yi SSC ve kapı lenfositlerini çalar.
- Bu ana kapıda, SSC'yi vs. DAPI ve kapıları DAPI hücrelerinde görüntüleyen yeni bir nokta çizelgesi oluşturun.
- Bu yeni kapılı popülasyonda, tüm CD4 + hücrelerini izole etmek için SSC'ye CD4'ü gösteren bir nokta çizelgesi oluşturun ( Şekil 3B ). Alternatif olarak saf T hücre popülasyonlarının izolasyonunu sağlamak için bir anti-CD3 mAb kullanılabilir.
NOT: Tüm CD4 + T hücrelerinin küçük bir fraksiyonu (% 5-10) Foxp3 + mRFP + olmalıdır.
- Sıralamadan sonra saflık ve hücre yaşayabilirliğini kontrol edin (>% 90) ve toplama tüplerini 4 ° C'de 5 dakika süreyle 400 xg'de döndürün. Tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 2x10 6 T hücre başına 1 mL eksiksiz RPMI ortamı kullanarak tekrar süspansiyon haline getirin.
- Daha önceden sıralanmış makrofajlar ile T hücrelerini kültürleyerek bastırma tahlilini oluşturun. Plaka 10 x 10 4 CD4 + T ve 10 x 10 4 CD8 + CFSE + T hücrelerinin aynı oyukta 100 ul tamamlanmış RPMI ortamında eklendi. 96 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin.
NOT: Makrofajlar ve T hücreleri 1: 4 oranında kullanılmıştır. - Azid içeren tamponu temizlemek için bunları kullanmadan önce T hücre bölünmesini T hücresi etkinleştiricisi CD3 / CD28 manyetik boncuklarını 2 mL PBS içinde yıkayarak stimüle edin. Her göz başına 5 μL fare T hücresi etkinleştiricisi CD3 / CD28 boncuk ekleyin.
NOT: Manyetik boncuklar, antijen sunan hücrelere benzer boyuttadır ve anti-CD3 ve anti-CD28 mAb ile birleşir ve T hücrelerinin aktivasyonu ve genişletilmesi için basit bir yöntem sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temsili sonuçlar yukarıdaki protokolde açıklanan geçiş stratejisini göstermektedir. Sonuçlar, greftle sızdıran makrofajlar ile birlikte kültürden sonra T-hücresi çoğalma aktivitesinin analizini de göstermektedir. Makrofaj alt gruplarının in vitro baskılayıcı kapasitesi Şekil 4'te analiz edilmiştir. Sonuçlar, toleranslı alıcılardan elde edilen Ly6C lo Ly6G - makrofajların baskılayıcı olduğunu göstermektedir. Sonuçlar aynı zamanda, Ly6C int Ly6G + hücrelerinin mütevazı bir baskılayıcı kapasite sergilediğini de gösterir. Sadece Ly6CoL6G - hücreleri in vitro CD4 + Foxp3 + Treg genleşmesini arttırdı. Birlikte, veriler, greft infiltrasyonlu CD11b + Ly6C lo Ly6G - makrofajların monosit türevi baskılayıcı hücreler 12 ile ilişkili olduğu bildirilen birçok özelliğe sahip olduğu sonucunu desteklemektedir.CD8 T-hücresi çoğalmasını 13 inhibe etme kabiliyetlerini ve CD4 + Foxp3 + Treg genleşmesini 14 arttırma kabiliyetlerini kapsar.
Şekil 1: Hayvan modeli. ( A ) Balb / c kalpleri (H2-d) daha önce tarif edildiği gibi 10 tamamen allojenik C57BL / 6'ya (H2-b) nakledildi. Alıcının cava veninin ve abdominal aortanın vericinin pulmoner arteri ve artan aortu ile anastomozu gösterilmiştir. Alıcı fareler, 0, 2 ve 4. günlerde tolerans indüksiyonu için 250 μg anti-CD40L mAb (klon MR1) ile tedavi edildi, çünkü son zamanlarda 4 bildirildi. Greft fonksiyonu her geçen gün abdominal palpasyon ile izlendi. Reddetme, palpe edilebilir bir kalp atışının tamamen kesilmesi olarak tanımlandı ve doğrudan görselleştirme ile teyit edildi. laparotomi. ( B ) Temsilcisi Görüntü ve ( C ) LN ve dalak (kırmızı renkte) ve allograftın (mor renkte) anatomik konumunun gösterimi Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız .
Şekil 2: Makrofaj sıralama stratejisi. Sol üst soldan başlayarak, lökositler önce boyuta göre kapatıldı ve sonra singlet hücreleri enkaz ve kümelerden ayırt edildi. Singletlerden ölü hücreler, DAPI negatif fraksiyonunda geçit alma işlemi dışındadır. Canlı hücrelerden, CD45 + CD11b + , miyeloid hücreleri tanımlamak için kullanılır. Üç myeloid hücre popülasyonu ayrıca Ly6C ve Ly6G ekspresyonuna dayanarak tanımlanır.= "_ Blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: Lenfosit ayırma stratejisi. Lenfosit ayırma stratejisi için temsili akış sitometrisi sonuçları. Sol üstten, lenfosit popülasyonunun ön ve yan dağılımına göre kapısı. Enkaz ve kümeleri hariç tutun. Singletlerden ölü hücreler, DAPI negatif fraksiyon üzerinde geçitleme yoluyla hariç tutulur. Canlı hücrelerden, ( A ) CD8 + CFSE + çift pozitif hücreler ve ( B ) Foxp3 + pozitif hücrelerin bir fraksiyonu içeren tüm CD4 + T hücreleri kapılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
![Şekil 4]("/files/ftp_upload/54242/54242fig4.jpg")
Şekil 4: Bastırma tahlili. ( A ) Her miyeloid alt grubun in vitro baskılayıcı kapasitesi. CD8 + T hücresi çoğalması, 96 saatlik miyeloid altkümeler ile birlikte kültürden sonra CFSE seyrelmesi ile izlendi. ( B ) Her bir miyeloid alt grubunun in vitro Treg genleşmesi. Miyeloid alt-grupları ile birlikte kültürden 96 saat sonra CD4 + T hücrelerinde Foxp3 ekspresyonunun akış sitometrisi analizi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, farklı murin deneysel modellerindeki diğer dokular için de geçerli olan, deneysel bir mürin kalp transplantasyon modelinde greft infiltre eden miyeloid hücre alt gruplarını immüno-karakterize eden yöntemleri tanımlamaktadır. 20 psi'de düşük basınç hücreli sıralama, saf hücre alt gruplarının iyi bir verimliliğini izole etmek için tercih edilen yöntemdi. Her bir miyeloid alt kümesinin saflığını muhafaza etmek, farklı miyeloid popülasyonlar arasındaki baskılayıcı kapasitenin kesin sonuçlarını oluşturmak için kritik önem taşır. Bununla birlikte, ticari zenginleştirme kitleri gibi çeşitli lökosit popülasyonlarının izolasyonu için başka yöntemler kullanılabilir. Hücrenin ilgi odağı ne olursa olsun, optimal yüzey lekesi ve akış sitometrisi sonuçları için, nakledilen dokudan canlı tek hücre süspansiyonlarının elde edilmesi gereklidir. Yanlış doku manipülasyonu, hücre kaybına ve dolayısıyla düşük miyeloid altkümeye neden olabilir. Verimi artırmak için numuneyi u işlediğinizden emin olun.Soğuk tamponlar söyleyin ve hücreleri düşük hücre aderanslı kaplarda (polipropilen tüpler) muhafaza edin. Bu protokolde, birçok doku tipinin ayrıştırılması için yaygın olarak kullanılan C. histolyticum'dan ( örneğin akciğer, kalp, kas, kemik, yağ, karaciğer, böbrek, kıkırdak, meme bezi, plasenta, kan) kolajenaz A kullanılmıştır. Damar, beyin ve tümör). Sıralama sırasında hücrelerin kaybedilmesini önlemek için, antikorların optimize edilmesi ve etkili bir geçiş stratejisi oluşturulması şiddetle tavsiye edilir. Bu protokolde, CD11b-Percp / Cy5.5, CD45-APC / eFluor780, Ly6C / APC ve Ly6G Pe / Cy7 floresan konjuge antikorları ve akış sitometrisi kullanarak sıçangil makrofajlarını karakterize ettik. İnsan epitomları Ly6C / G olmadığından, insan miyeloid hücrelerini ayırmak için CD14 / CD15 / CD16 kullanımı gerekir 15 .
Çok renkli akış sitometrisi analizinde, seçilen florokromların olası spektral örtüşmeleri oluşabilir. Bu nedenle, belirtildiği gibi befoTek leke dengelemeleri, örtüşen konuları önlemek için çok yararlıdır. Ek olarak, antikor titrasyonu, arka plan floresanını azaltmak ve en iyi sonuçları elde etmek için şiddetle tavsiye edilir. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için bir diğer önemli husus canlılık boyalarının kullanılmasıdır. Bu protokolde DAPI yaşayabilirlik boyası olarak kullanılır. DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol), DNA'daki AT zengini bölgelere güçlü bir şekilde bağlanan mavi floresan bir boyadır. DNA'ya bağlı DAPI için uyarma maksimum değeri 358 nm ve emisyon maksimum değeri 461 nm'dir. Protokole göre kullanıldığında, DAPI akış analizinde ölü hücreleri hariç tutarak, az miktarda veya hiç sitoplazmik etiketleme yapmadan çekirdeği özellikle lekeler. Bununla birlikte, seçilen antikorların paneline bağlı olarak, 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) ve propidyum iyodür (PI) gibi diğer yaşamsal boyalar kullanılabilir. Hassas hücre dışı bırakma ve canlı hücre tanımlama, in vitro T hücrelerini başarılı bir şekilde izlemek için ön şarttır, çünkü önemlidir.Lenfosit çoğalmasını, hücre yaşayabilirliği ve fonksiyonu için en ufak bir bozulma ile izleyebilecek prosedürlere sahip olmak.
Yukarıda belirtildiği gibi CFSE gibi hücre izleme boyaları ile hücre etiketleme ve proliferasyon analizleri için kritik adımlar vardır. Literatürde açıklanan bir örnek olarak, CFSE 16 kullanıldığında üniform dağılımlar ve ayırt edilebilen kızı doruk noktaları elde etmek için ölü / ölmekte olan hücrelerin dışlanmasına dikkat edilmelidir. Boyama panellerine bağlı olarak, piyasada bulunan birçok hücre takip boyası vardır. Hücre izleme boyalarına alternatif olarak, kanser çalışmalarında lenfositlerin ve diğer hücrelerin proliferasyonunu değerlendirmek için timidin titrasyonlu analiz gerçekleştirilmiştir 13,14. Timidin birleştirme protokolleri, radyo işaretli 3H- veya 14C-timidin ölçüsü ile hücre bölünmesi sırasında DNA replikasyonunu değerlendirir. Bu yöntem iThymidine titrasyon tekniğinin en büyük dezavantajı radyoaktiviteye sahip olması ve tek hücre seviyesinde bilgi sağlamamasıdır. Öte yandan, CFSE akış sitometrisi analizi, yanıt veren lenfosit altkümeleri hakkında açık bilgi verir ve interlaborasyon ve intralaboratuvar değişkenliği daha azdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Mount Sinai'deki Araştırma Mükemmellik Akım Sitometresi, Mikrocerrahi ve Biyo-depo / Patoloji Merkezlerinin teknik katkılarını kabul ediyoruz. Bu çalışma, COST Action BM1305: Hücre Tolerojenik Tedavilere Odaklanma ve İyileşme Eylemi (A FACTT), Mount Sinai Recanati / Miller Transplantasyon Enstitüsü kalkınma fonları, Ministerio de Ciencia e Innovacion SAF2013-48834-R ve SAF2016-80031-R tarafından desteklenmiştir. JO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1,000x 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100x Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100x L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100x Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1 M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100 mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 µm Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2'deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V.
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
