Abstract
Наделение материалы поверхность с клеточно-адгезионные свойства является общей стратегией в исследовании биоматериалов и тканевой инженерии. Это особенно интересно для уже утвержденных полимеров, которые имеют длительный срок использования, стоя в медицине, так как эти материалы хорошо охарактеризованы и правовые вопросы, связанные с введением новых синтезированных полимеров можно избежать. Политетрафторэтилен (PTFE), является одним из наиболее часто применяемых материалов для изготовления сосудистых тканей, но полимер испытывает недостаток клеток, усиливающего адгезию особенности. Эндотелиализацию, то есть полный охват трансплантатов внутренней поверхности с вырожденным слоем эндотелиальных клеток считается ключом к оптимальной производительности, в основном , за счет снижения тромбогенности искусственного интерфейса.
Это исследование исследует рост эндотелиальных клеток на пептид-модифицированный ПТФЭ, и сравнивает эти результаты, полученные на немодифицированной подложке. Сцепление сэндотелиальный клей клетка пептид Arg-Glu-Asp-Val (REDV) осуществляется через активацию Fluorin полимера, содержащего, используя реагент нафталинид натрия с последующим последующих стадий конъюгации. Культура клеток осуществляется с использованием человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs) и отличный клеточный рост на пептидной иммобилизованным материале демонстрируется в течение двух недель.
Introduction
Различные полимеры , используемые в медицине , которые были утверждены в течение некоторого времени не проявляют повышенную биосовместимость, т.е. отсутствие клеток-липкости, индукцию фиброзной капсулой и тромбообразования, чтобы упомянуть некоторые из них. Взаимодействие между биоматериала и биологической системы происходит в основном на поверхности имплантата. Как следствие этого, исследование сосредоточилось на модификации поверхности для того, чтобы создать соответствующие свойства для требуемого применения, оставляя объемные свойства материала не изменяются. Политетрафторэтилена (ПТФЭ) в качестве физиологически инертный полимер используется во многих областях медицины , таких как грыжа хирургической сетки 1, медицинские порты 2 и, самое главное, сосудистых трансплантатов 3.
Особенно в крови контактирование ситуации гидрофобный характер PTFE вызывает неспецифическую адсорбцию компонентов плазмы и, как следствие адгезии тромбоцитов, что часто приводит к thrombotiC события и закупорка трансплантата 4. Кроме того, из ПТФЭ, как и большинство полимеров, не поддерживает клеточную адгезию и покрытие , которое было бы желательным признаком , чтобы вызвать образование полезного слоя эндотелиальных клеток (ЭКС) на внутренней (полостной) поверхности сосудистой трансплантата 5. Биомиметический эндотелий , как ожидается , выполнять многие из функций его естественного эквивалента, в частности , его антитромбогенные свойства 6. Общая биомиметический стратегия модификации основана на концепции исключительно наделение материал с клеточной адгезионной способностью, оставляя материалы объемные свойства не изменяются. Кроме того, адгезия тромбоцитов может быть уменьшена за счет включения антиадгезионного (анти-обрастания) признаки 7. Различные пептиды - в основном полученные из протеинов внеклеточного матрикса - были описаны , что сильно повысить клеточную адгезию путем связывания с клеточными рецепторами, принадлежащий к классу интегринов 8. БытиеSt известным примером в этом отношении является пептид Arg-Gly-Asp (RGD), который взаимодействует с большинством типов клеток. Другие аминокислотные последовательности распознаются интегринов экспрессируется исключительно на конкретных клетках. Например, Арг-Glu-Asp-Val (REDV) и Тир-Иле-Гли-Ser-Arg (YIGSR) было обнаружено, что связываться с КЧС определенным образом 9. Ковалентной иммобилизации таких пептидов было проведено на изобилием по своей природе не липких материалов , включая металлы и полимеры 10,11.
Пористый ПТФЭ, более точно расширен ПТФЭ (ПТФЭ) - наряду с полиэтилентерефталата (ПЭТ) - это наиболее важный материал для производства сосудистых трансплантатов 12. Установленные физические методы для надлежащего лечения, такие как модификация плазмы 13 или фотохимическим методами 14, затруднены тем , что пористые и / или трубчатые структуры не легко поддается лечению в порах или просвет соответственно. Влажная химияПТФЭ является сложной задачей из-за чрезвычайно инертной природы Fluorin содержащего полимер , который противодействует большинство химических атак 15.
В этой статье мы опишем сравнительно легкое метод стратегии ковалентной модификации. Адаптировано из процедуры для визуализации ПТФЭ к связыванию, функциональные группы были созданы на поверхности материалов, которые служат в качестве опорных точек для дальнейшего сопряжения биологически активных молекул.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение натрия нафталинид активизирующего раствора и поверхности активации
Примечание: Проведение реакции в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу. Следуйте общим правилам для сылно растворителей и коррозионные металлы, такие как металлический натрий. Нафталин имеет очень неприятный запах (законсервировать), даже в очень небольших количествах! Если не указано иначе реакции проводят при комнатной температуре. Азид натрия очень токсичен! ТГФ (99,9%, см список материалов) хранился в течение примерно 20% (по объему) молекулярного сита. Отфильтровываю ТГФ с заметным содержанием воды над натрием. Формирование нафталенидом натрия не происходит, если следовые количества воды присутствуют.
- К раствору 1,4 г (10,9 ммоль) нафталина в 20 мл тетрагидрофурана (ТГФ, сушили над 3 молекулярного сита), добавляют 0,25 г (10,9 ммоль) металлического натрия в завинчивающейся крышкой стеклянный флакон 100 мл, снабженную PTFE- с покрытием магнитной мешалкой.
Примечание: Dissoluция может быть значительно повышена за счет сокращения натрия на мелкие кусочки и скромные нагрева (35 - 40 ° C). Конечный раствор имеет темный, слегка зеленоватого цвета, и могут храниться в строго сухих условиях. - Выбивать PTFE диски диаметром 12 мм из материала толстой фольги 0,5 мм. Марк с одной стороны (например, с использованием штампа письмо удар) и чистый с изопропанолом.
- Выдержите ПТФЭ образцы по отдельности в растворе активирующего (шаг 1,1) в течение 1 - 2 мин с помощью щипцов. Примечание: Изменение цвета от белого до темно-коричневого указывает на успешное лечение.
- Затем прополоскать дважды ТГФ и затем изопропанолом.
Примечание: Решение нафталинид исчерпывается, когда его цвет меняется на водянистой светло-коричневого цвета. Неиспользованный раствор нафталинид (возможно, содержащий металлический натрий) должен быть разложен, медленно добавляя изопропанола перед удалением. - Oxidize обработанные образцы в перекиси водорода (30%), содержащего 20% (вес / объем) трихлоруксусной кислоты в течение 3 ч. мытьс водой и высушить. Поверхность теперь имеет небольшой коричневатый внешний вид. Примечание: Включение и результат окисления в резко повышенной смачиваемостью поверхности. Этот вывод был подробно рассмотрен ранее 14.
- Лечить окисленные диски с 50% (об / об) гексаметилендиизоцианатом (HMDI) в сухом ТГФ в течение 2 ч, промывают ТГФ и оставить до полного высыхания.
- Hydrolyze изоцианатные образцы подшипников в воде в течение 2 - 3 ч и сухой. Примечание: Конечный амино-функционализированные поверхности ПТФЭ является гораздо более стабильным, чем по отношению к изоцианату, приносящих образцов и совместим со многими стандартными сшиватели для дальнейшей связи.
2. Пептид иммобилизации
- Приготовьте раствор 20% (об / об) диэтиленгликоля диглицидиловый эфир (диэпоксидную) в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9.
- Поместите аминируется диски с отмеченной стороной вверх по отдельности в 24-луночный планшет и добавляют 1,5 мл раствора эпоксида. Обеспечить полный охват образцов. Выдержите в течение 2 часов и мыть двараз водой и один раз с карбонатным буфером.
- Добавляют 50 мкл 0,5 мг / мл пептида (например, REDV) в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9 , содержащего 0,01% NaN 3, в нижней части отдельные лунки свежей 24 - луночного планшета и осторожно поместить эпоксидную функционализованных диски вверх -вниз (то есть, отмеченные стороной вниз) на каплю раствора пептида. Убедитесь, что пространство между дном скважины и PTFE диск полностью смачивается из-за капиллярного действия.
- Выдержите во влажной камере (например, любой закрывающийся пластиковый ящик с плотно закрывающей крышки) с влажной атмосфере (путем размещения бумаги мокрой ткани на дне) , по крайней мере , 3 часа или на ночь.
Примечание: REDV хотя и введены мотив можно рассматривать как хорошо охарактеризован, скремблированный или обратная аминокислотная последовательность может быть включена в качестве дополнительного отрицательного контроля. - Промыть три раза водой и стерилизуют в 50% изопропанол / вода в течение по крайней мере 30 мин. До посева клеток, RINSе образцы в стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS).
3. Посев Cell
- Grow HUVECs с использованием процедур культивирования клеток стандарт 17,18.
- Поместите пептидные-конъюгированные образцы с модифицированной стороной вверх в 24-луночные планшеты. Использование необработанной PTFE дисков в качестве контроля.
- Семя 5 х 10 4 HUVECs в 2 мл среды на лунку и инкубировать в течение 4 ч при температуре 37 ° С и 5% СО 2 в инкубаторе.
- Удалите диски, промойте тщательно, чтобы удалить клетки и неприкрепленные передавать на свежий 24-луночного планшета. Добавляют 2 мл свежей среды и инкубировать в течение требуемого периода (например, 24 часа в сутки, 1 ш и т.д.). Изменение средних каждые два дня.
- Подготовка исходного раствора 1 мг / мл кальцеином AM в диметилсульфоксиде (ДМСО).
- После выращивания клеток удаления среды, промывают PBS и добавляют PBS , содержащего 1 мкл / мл кальцеин-АМ краситель (например, 1 мкл исходного раствора на мл PBS). Аккуратно агитировать и incubatе при 37 ° С в течение 45 мин в темноте.
- Мытье с PBS и немедленно принять микрофотографии на флуоресцентный микроскоп оснащен стандартными FITC фильтрами (Ex 488 нм, Em 515 нм). С помощью 100-кратным увеличением. Выполните трехкратном повторе из немодифицированного, а также обработанные образцы.
- С помощью программного обеспечения ImageJ определить площадь колонизировали клеток. В качестве альтернативы подсчитывать клетки вручную или с помощью ImageJ. Оба метода дают аналогичную информацию о прикрепленном и роста клеток на соответствующих поверхностях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты важнейших химических стадий реакции контролировали с помощью ИК - спектроскопии (рис 1). Первоначальная активация нафталенидом натрия порождает двойные связи - и в незначительной степени - ОН-функциональные возможности. Сигнал, указывающий С = С связей исчезают при окислении, что дает Несущая поверхность почти исключительно к гидроксильным группам групп. Анализ дальнейших стандартных шагов конъюгации здесь не показаны. Изменения цвета за счет активации и окисления находятся в согласии с ожидаемой химии, которая используется: конъюгированные системы двойной связью , как ожидается , будет коричневатые и его результаты потери в яркости (Рисунок 2). Кроме того, возможным результатом активации и окисления на морфологию поверхности была исследована с помощью сканирующей электронной микроскопии. Практически не пагубный эффект лечения не наблюдалось (рисунок 2).
рисунках 3 и 4 показаны результаты REDV-иммобилизации на рост эндотелиальных клеток. В то время как практически нет адгезии клеток и пролиферации не происходит на необработанном материале модификация сильно поддерживает колонизацию в течение двух недель. Вышеописанное для клинического применения (то есть, сосудистые трансплантаты), модификация была тождественно выполняется на исходном материале из коммерчески доступного трансплантата , изготовленного из вспененного ПТФЭ с аналогичными результатами в течение периода продолжительностью в одну неделю (рисунок 5).
Рисунок 1. ИК - спектроскопия PTFE. Лечение нетронутого PTFE (А) приводит к образованию двойных связей , и в определенной степени гидроксифосфонатов функций (B). В дальнейшем С = С связи снижаются из - за окисления (C Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Оптический внешний вид голой и поверхности активированного PTFE. (A) В то время как необработанного PTFE (слева) появляется белый, активация с помощью нафталинид натрия дает темно - коричневатый цвет (средний) , который слегка отбеленную при окислении (справа). Неочищенные (В) и окисленного PTFE (C) образцы дополнительно исследовали с помощью сканирующей электронной микроскопии (увеличение: 2,000X). Диски диаметром 12 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. культивирования эндотелиальных клеток на нетронутую и пептид-модифицированный ПТФЭ. Необработанные образцы не колонизирована КЭ (А, С, Е , после 24 часов, 1 Вт и 2 Вт соответственно) , тогда как адгезии и роста на пептидном-модифицированного материала значительно усиливается (B, D и F через 24 ч, 1 Вт и 2 вес соответственно). Шкала бар:. 100 мкм, увеличение 100X Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Количественное покрытия клеток с помощью анализа ImageJ. Клеточный рост на голое PTFE (A, C,Е) и на REDV-конъюгированные поверхностей полимера (В, D, F) , выраженная в процентах охвата общей площади. Иммобилизованные пептид ясно дает начальную адгезию (B) и поддерживает колонизацию в течение 2-недельного периода (D, F). Triplicate определений, среднее ± стандартное отклонение). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. эндотелиальные клетки выращивают в течение 1 недели на расширенном PTFE. Структура ПТФЭ показана с помощью сканирующей электронной микроскопии (A). Результаты, полученные на пористом материале в соответствии с результатами, полученными для плоского образца из ПТФЭ. В отличие от нескольких клеток, обнаруженныхна незащищенного материала (В) , модифицированной поверхности (С) обеспечивает отличную субстрат для роста клеток. Шкала баров 100 мкм для A, B и C соответственно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Схематическое изображение химической модификации ПТФЭ с использованием мокрого лохимические. Двойные связи , сгенерированные обработкой Na-нафталинид окисляются в результате ОН-функциональными возможностями . Гидроксил-реактивный диизоцианат затем иммобилизовали и гидролизуют с амином. Наконец бифункциональный диэпоксид применяется к сопряжем REDV пептида с использованием N-концевой аминогруппы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы VIEW большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Подробное описание протокола модификации поверхности ПТФЭ состоит из последовательных этапов , начиная с преодолением фтора из полимерной цепи , как показано на рисунке 6. В результате, слой образуется , который содержит большое количество конъюгированных двойных углерод-углеродных связей в соответствии с темно-коричневого цвета, что разработанный при обработке нафталинид. Стандартный окисление с кислой перекисью водорода дает гидроксилированная поверхность сопровождается осветление до бледно-коричневого цвета, это отражает потерю двойных связей. Этот процесс четко свидетельствует ИК-спектроскопии.
Для того, чтобы добиться более общего применения функциональных возможностей, подвесные ОН-группы были превращены в амино-функциональные возможности путем простой обработки с диизоцианатом и последующим гидролизом NCO-фрагментов в первичные амины. Это выгодно, потому что амин-несущий материал можно хранить в течение длительных периодов времени в то время как HIGHLY реактивный изоцианат восприимчивы к самому наличию влажности воздуха.
Необходимо соблюдать осторожность во избежании даже следовых количеств воды в начальной стадии активации и лечения HMDI, поскольку оба нафталинид натрия и изоцианат очень чувствительны к гидролизу. В отличие от стандартных процедур, в которых образец полностью погружают в раствор, настоящий протокол требует лишь небольшое количество реагента. Поэтому этот метод экономит много дорогостоящего пептида.
Амин-несущие поверхности являются идеальными отправными точками для сочетания многих биомолекул. Диэпоксида занятых в этой работе, интересно в нескольких отношениях: это сравнительно дешевый, гидрофильные, высокой реакционной способностью по отношению к аминам и непрореагировавших эпоксидов гидролизуются в водной среде в "физиологически инертные" диолов. Гомобифункциональными сшиватели являются подходящими реагентами, где только одна реакционноспособная группа присутствует Oп пептид иммобилизуемого. Это относится к REDV, содержащего только одну единственную первичную аминогруппу на N-терминал (это то же самое для часто используемых RGDS последовательности). Для получения пептидов, содержащих остатки лизина (с боковой цепи аминов) исход сопряжения неоднозначна, а это означает, что надлежащее сцепление не происходит определенным образом. В этом случае стратегия использования гетеробифункциональные сшивающие (например, аминов и тиоловых-реактивных) и цистеин (N- или С-концевых) , содержащий пептиды , полезно 18.
Результаты пептидной иммобилизации с точки зрения клеточной адгезии однозначна (Рисунки 3 и 4). В то время как практически отсутствуют клетки не прилипать на голой PTFE, REDV-модификация оказывает материалу отличную клеточную клеевой основы. В дополнение к вышеизложенные протокола предварительной работы показывают , что этот метод также применим на пористой (расширенной) PTFE с аналогичными результатами (рис 5 13, плазменной полимеризации 19), этот протокол обеспечивает руководство для ковалентной модификации ПТФЭ с использованием легкодоступных химических веществ и процедур , лабораторных и избегая весьма сложного оборудования. Методологии плазмы , таких как реактивное плазмы (O 2, NH 3 и т.д.) и плазменной полимеризации не применяются в пористых конструкций , или трубопровода , так как активные формы (например, радикалы) не способны проникнуть в эти структуры из - за инактивации при контакте с материалами поверхность. Например малого калибра сосудистых трансплантатов (диаметр <5 мм) не могут быть обработаны таким образом. В отличие от этого, при помощи влажной химии, нет никаких ограничений в отношении формы устройства. Таким образом, путем включения формирование endothelial слой на полостной стороны от сосудистой трансплантата ПТФЭ, тромбообразования и долгосрочной проходимость может быть улучшена. Кроме того, клей на клеточной поверхности для хирургических грыжа сетках предполагается, приведет к более тесной интеграции ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S.
- Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S.
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
