Abstract
Dotando materiais de superfície com propriedades de células-adesivo é uma estratégia comum em pesquisa biomaterial e engenharia de tecidos. Isto é particularmente interessante para os polímeros já aprovados que têm uma utilização de longa data na medicina, pois estes materiais são bem caracterizadas e questões legais relacionadas com a introdução de polímeros sintetizados de novo podem ser evitadas. Politetrafluoroetileno (PTFE) é um dos materiais mais utilizados para a produção de enxertos vasculares, mas o polímero carece de promover a adesão celular características. Endotelização, ou seja, a cobertura completa dos enxertos superfície interior com uma camada confluente de células endoteliais é considerada chave para um desempenho óptimo, principalmente pela redução da trombogenicidade da interface artificial.
Este estudo investiga o crescimento de células endoteliais em PTFE modificado com péptido e compara estes resultados com os obtidos no substrato não modificado. Acoplamento com opéptido de adesão celular endotelial Arg-Glu-Asp-Val (REDV) é realizada através da activação do polímero contendo fluorin usando o reagente de naftaleneto de sódio, seguido de passos subsequentes de conjugação. A cultura de células é realizado utilizando Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs) e excelente crescimento celular em material imobilizado-péptido é demonstrada ao longo de um período de duas semanas.
Introduction
Vários polímeros utilizados na medicina que tenham sido aprovados por algum tempo não apresentam biocompatibilidade melhorada, isto é, a falta de adesão célula-a adesividade, a indução de encapsulamento fibrótica e trombogenicidade, para mencionar alguns. As interacções entre o biomaterial e o sistema biológico ocorre principalmente na superfície do implante. Como consequência, a investigação centrou-se na modificação da superfície, a fim de criar propriedades apropriadas para uma aplicação desejada, deixando as propriedades de volume do material afectado. Politetrafluoroetileno (PTFE) como um polímero fisiologicamente inerte é utilizado em muitos campos médicos, tais como hérnia uma malha cirúrgica, portas médicos 2 e, o mais importante, os enxertos vasculares 3.
Especialmente em situações de contacto de sangue a natureza hidrofóbica de PTFE faz com que a adsorção não específica dos componentes do plasma e como uma consequência a adesão de plaquetas, frequentemente resultando em thrombotieventos c e oclusão do enxerto 4. Além disso, o PTFE, como a maioria dos polímeros, não suporta a adesão celular e da cobertura que seria uma característica desejável para induzir a formação de uma camada de células endoteliais benéfico (ECS) no interior (luminal) da superfície do enxerto vascular 5. A endotélio biomimética é esperado para cumprir muitas das funções de seu equivalente natural, nomeadamente as suas propriedades antitrombogênicas 6. Uma estratégia geral biomimética modificação baseia-se no conceito de dotar exclusivamente com o material de células-adesividade, deixando as propriedades materiais a granel afectada. Além disso, a adesão de plaquetas pode ser reduzida através da incorporação de anti-adesivo (anti-incrustação) 7 atributos. Vários péptidos - principalmente derivados de proteínas da matriz extracelular - foram descritas que aumentam fortemente de adesão celular através da ligação a receptores celulares, que pertence à classe de integrinas 8. O serr exemplo conhecido a este respeito, é o péptido Arg-Gly-Asp (RGD) que interage com a maioria dos tipos de células. Outras sequências de aminoácidos são reconhecidas pelas integrinas exclusivamente expressa em células específicas. Por exemplo, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) e Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR), foram encontrados para se ligarem a células endoteliais de uma forma específica 9. Imobilização covalente de tais péptidos foi levada a cabo numa multiplicidade de materiais inerentemente não aderentes, incluindo metais e polímeros 10,11.
PTFE poroso, mais precisamente, de PTFE expandido (ePTFE) - juntamente com tereftalato de polietileno (PET) - é o material mais importante para a produção de enxertos vasculares 12. Técnicas físicas estabelecidas para os tratamentos apropriados, tais como a modificação de plasma 13 ou por métodos fotoquímicos 14, está dificultada pelo facto de que as estruturas porosas e / ou tubulares não são prontamente tratáveis no interior dos poros ou o lúmen, respectivamente. química úmidaem PTFE é uma tarefa difícil devido à natureza altamente inerte do polímero contendo fluorin que resiste a ataques mais químicas 15.
Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil para uma estratégia de modificação covalente. Adaptado a partir de um processo para processar PTFE colável, grupos funcionais foram criados na superfície de materiais que servem como pontos de ancoragem para posterior conjugação de moléculas biologicamente activas.
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Protocol
1. Preparação de sódio naftaleneto Activar Solution e ativação de superfície
Nota: Realizar reações em um exaustor bem ventilado. Siga as regras gerais para lidar com solventes altamente inflamáveis e corrosivos metais como o sódio metálico. Naftaleno tem um cheiro muito desagradável (naftalina), mesmo em quantidades muito pequenas! Se não for indicado de outro modo as reacções são realizadas à temperatura ambiente. A azida de sódio é altamente tóxico! THF (99,9%, ver Lista de Materiais) foi armazenada ao longo de aproximadamente 20% (em volume) de crivo molecular. Destila-se THF com um teor de água perceptível ao longo de sódio. A formação de naftaleneto de sódio não ocorre se pequenas quantidades de água estão presentes.
- A uma solução de 1,4 g (10,9 mmol) de naftaleno em 20 ml de tetra-hidrofurano (THF, seco sobre peneiro molecular de 3 Á), adicionar 0,25 g (10,9 mmol) de metal de sódio em uma garrafa de vidro de 100 ml com tampa de rosca equipado com um PTFE revestido barra de agitação magnética.
Nota: dissolução pode ser grandemente aumentada através do corte do de sódio em pedaços pequenos e aquecimento moderado (35 - 40 ° C). A solução final tem uma cor ligeiramente esverdeada escura e podem ser armazenadas em condições rigorosamente seco. - Punch out discos de PTFE de 12 mm de diâmetro a partir de material de folha de espessura de 0,5 mm. Mark um lado (por exemplo, usando uma carta carimbo de soco) e limpo, com iso-propanol.
- Incubar PTFE-amostras individualmente na solução de activação (passo 1.1) para 1 - 2 min usando uma pinça. Nota: A mudança de cor do branco ao marrom escuro indica o sucesso do tratamento.
- Subsequentemente lavar duas vezes com THF e depois com iso-propanol.
Nota: A solução naftaleneto se esgota quando sua cor muda para um castanho claro aguado. naftaleneto solução não utilizada (possivelmente contendo sódio metálico) tem de ser decomposto por adição lenta de iso-propanol antes da sua eliminação. - Oxidar amostras tratadas em peróxido de hidrogénio (30%) contendo 20% (w / v) de ácido tricloroacético, durante 3 h. lavarcom água e seco. A superfície agora tem uma aparência leve acastanhada. Nota: A activação e o resultado de oxidação em uma molhabilidade drasticamente aumentada da superfície. Esta descoberta foi examinada em detalhe anteriormente 14.
- Tratar discos oxidados com 50% (v / v) de diisocianato de hexametileno (HMDI) em THF seco durante 2 h, lavar com THF e deixar secar.
- Hidrolisar amostras com isocianato em água por 2-3 horas e seco. Nota: A superfície de PTFE amino-funcionalizado final é muito mais estável do que as amostras de rolamento isocianato e é compatível com muitos agentes de ligação cruzada standard para acoplamento adicional.
2. Peptide Imobilização
- Prepara-se uma solução de 20% (v / v) de éter de diglicidilo de dietilenoglicol (diepóxido) em 50 mM de tampão carbonato, pH 9.
- Colocar os discos aminado com o lado marcados individualmente para uma placa de 24 poços e adicionar 1,5 ml da solução de epóxido. Assegurar uma cobertura completa das amostras. Incubar durante 2 horas e lavar duasvezes com água e uma vez com tampão de carbonato.
- Adicionar 50 ul de uma solução a 0,5 mg / ml de péptido (por exemplo, REDV) em 50 mM de tampão carbonato, pH 9 contendo 0,01% de NaN 3, ao fundo dos poços individuais de uma placa de 24 poços frescas e colocar cuidadosamente os discos de cabeça funcionalizado com epoxi -down (isto é, marcada voltado para baixo) para a gota de solução de péptido. Certifique-se de que o espaço entre a parte inferior do poço e o disco de PTFE é completamente molhado devido à acção capilar.
- Incubar numa câmara húmida (por exemplo, qualquer caixa de plástico lacrado com uma tampa de fecho estanque) com atmosfera húmida (por colocação de papel de tecido húmido na parte inferior) durante pelo menos 3 horas ou durante a noite.
Nota: Embora o motivo REDV pode ser considerado como bem caracterizado, uma sequência de aminoácido codificado ou inverso pode ser incluído como um controlo negativo adicional. - Lavar três vezes com água e esterilizar em 50% de iso-propanol / água durante pelo menos 30 min. Antes da sementeira, célula RinsÊ O amostras em solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS).
Sementeira 3. celular
- HUVECs crescem utilizando procedimentos de cultura celular padrão 17,18.
- Colocar as amostras de peptídeos conjugados com o lado alterado em um placas de 24 poços. Use discos de PTFE não tratado como um controlo.
- Semente de 5 x 10 4 HUVEC em 2 ml de meio por poço e incubar durante 4 horas a 37 ° C e CO2 a 5% numa incubadora.
- Retire os discos, lavar cuidadosamente para remover células não ligadas e transferir para um placa de 24 poços fresco. Adicionar 2 ml de meio fresco e incubação durante o período desejado (por exemplo, 24 horas, 1 W, etc.). Mudança do meio de dois em dois dias.
- Prepara-se uma solução stock de 1 mg / ml de Calcein-AM em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
- Após o crescimento as células de remover o meio, lava-se com PBS e adicionar PBS contendo 1 ul / ml de mancha calceína-AM (por exemplo, 1 ul de uma solução de stock por ml de PBS). Agite suavemente e incubate a 37 ° C durante 45 min no escuro.
- Lava-se com PBS e imediatamente tomar micrografias num microscópio de fluorescência equipado com filtros FITC padrão (Ex 488 nm, Em 515 nm). Use ampliação de 100 vezes. Execute triplicados de não modificada, bem como amostras tratadas.
- Utilizando o software ImageJ determinar a área colonizados pelas células. Alternativamente contar as células manualmente ou usar ImageJ. Ambos os métodos lhe dará informações semelhantes sobre a ligação e crescimento de células nas respectivas superfícies.
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Representative Results
Os resultados dos passos de reacção químicos cruciais foram monitorizadas por espectroscopia de IV (Figura 1). A ativação inicial com naftaleneto de sódio gera ligações duplas - e, em menor medida - OH-funcionalidades. O sinal que indica C = ligações C desaparecer por oxidação, dando origem a uma superfície de rolamento quase exclusivamente grupos hidroxilo. Análise de novos passos de conjugação padrão não são mostradas aqui. As mudanças de cor devido à oxidação de activação e estão de acordo com a química esperado que é utilizado: sistemas de colagem duplas conjugadas deverão ser acastanhada e os seus resultados da perda em brilho (Figura 2). Além disso, o possível resultado da activação e oxidação na morfologia da superfície foi investigada por meio de microscopia eletrônica de varredura. Virtualmente, não se observou qualquer efeito prejudicial do tratamento (Figura 2).
As Figuras 3 e 4 mostram o resultado de REDV-imobilização sobre o crescimento de células endoteliais. Considerando praticamente nenhuma adesão e proliferação celular ocorre em matérias não tratadas a modificação apoia fortemente a colonização ao longo de um período de duas semanas. Exemplificado para uma aplicação clínica (isto é, enxertos vasculares), a modificação foi realizada de forma idêntica sobre o material inicial a partir de um enxerto comercialmente disponível feito de PTFE expandido, com um resultado análogo ao longo de um período de uma semana (Figura 5).
Figura 1. espectroscopia de IV de PTFE. O tratamento de PTFE intocada (A) resulta na formação de ligações duplas e, em certa medida de funções hidroxi (B). Subsequentemente C = ligações C são reduzidas devido à oxidação (C Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. aparência óptica do PTFE activado nu e a superfície. (A) Considerando que o PTFE não tratado (esquerda) aparece branca, da activação utilizando naftaleneto de sódio produz uma cor acastanhada escura (meio), que é ligeiramente iluminou por oxidação (à direita). Não tratada (B) e oxidado PTFE amostras (C) foram adicionalmente investigadas por microscopia eletrônica de varredura (ampliação: 2,000X). Os discos são 12 mm de diâmetro. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. cultura de células endoteliais sobre PTFE pura e modificado com péptido. As amostras não tratadas não são colonizadas por células endoteliais (A, C, E, após 24 horas, 1 e W 2 W, respectivamente), enquanto que a adesão e crescimento de material modificado-péptido é grandemente aumentada (B, D e F, após 24 horas, 1 e W 2 w, respectivamente). Barra de escala:. 100 mm, ampliação 100X Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Quantificação de cobertura celular por análise ImageJ. Crescimento celular em PTFE nua (A, C,E) e em superfícies de polímeros REDV-conjugado (B, D, F), expresso como percentagem de cobertura da área total. Péptido imobilizado permite claramente adesão inicial (B) e suporta a colonização ao longo de um período de 2 semanas (D, F). Determinações em triplicado, a média ± desvio padrão). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. As células endoteliais cultivadas por uma semana em PTFE expandido. A estrutura do ePTFE é mostrado usando Microscopia Eletrônica de Varredura (A). Os resultados obtidos no material poroso estão em conformidade com os valores obtidos para amostras de PTFE plana. Em contraste com as poucas células encontradasem meramente material (B) da superfície modificada (C) é um excelente substrato para o crescimento celular. Barras de escala são 100 mm para A, B e C, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Representação esquemática da modificação química de PTFE utilizando molhado-química. As ligações duplas gerados por tratamento de Na-naftaleneto são oxidados resultando em OH-funcionalidades. Um di-isocianato reactivo com hidroxilo é então imobilizado e hidrolisado para uma amina. Finalmente, o diepóxido é aplicada bifuncional para conjugar o péptido REDV utilizando o grupo amino N-terminal. Por favor clique aqui para vIEW uma versão maior desta figura.
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Discussion
A descrição detalhada do protocolo de modificação da superfície de PTFE consiste em passos sucessivos começando com a eliminação de flúor a partir da espinha dorsal do polímero, como representado na Figura 6. Como resultado, uma camada é formada, que contém uma quantidade abundante de ligações duplas conjugadas carbono-carbono em acordo com a cor marrom escuro que se desenvolveu após tratamento naftaleneto. oxidação padrão com água oxigenada ácida produz uma superfície hidroxilada acompanhada por clarear para um marrom pálido, isso reflete a perda de ligações duplas. Este processo é claramente evidenciado por espectroscopia IV.
A fim de alcançar uma funcionalidade mais geralmente aplicável, o pingente grupos OH foram convertidos em amino-funcionalidades simples por tratamento com um di-isocianato e hidrólise subsequente dos radicais NCO para aminas primárias. Isto é favorável, porque o material de suporte de amina pode ser armazenado por períodos prolongados enquanto que o highly isocianato reactivo é suscetível a própria presença de umidade do ar.
Deve ser tomado cuidado para evitar a ocorrência de mesmo pequenas quantidades de água no passo de activação inicial e o tratamento de HMDI porque ambos naftaleneto de sódio e o isocianato são altamente susceptíveis à hidrólise. Em contraste com processos convencionais em que a amostra é completamente mergulhada na solução, o presente protocolo requer apenas pequenas quantidades de reagente. Portanto, este método economiza muito do peptídeo caro.
amina superfícies de suporte são os pontos de partida ideal para o acoplamento de muitas biomoléculas. O diepóxido empregue neste trabalho é interessante em vários aspectos: é relativamente barata, hidrofílica, altamente reactivos com aminas e epóxidos não reagidos são hidrolisados num meio aquoso em dióis "fisiologicamente inertes". reticuladores homobifuncionais são reagentes adequados, onde apenas um grupo reactivo está presente oN do péptido a ser imobilizada. Isto aplica-se para REDV contendo apenas um único grupo amino primário na extremidade N-terminal (isto é o mesmo para os RGDS de sequência frequentemente utilizado). Para os péptidos contendo resíduos de lisina (com aminas de cadeia lateral) o resultado da conjugação é ambígua, o que significa que o acoplamento adequado não ocorre de uma forma definida. Neste caso, uma estratégia utilizando agentes de reticulação heterobifuncionais (por exemplo, aminas e tiol-reactivo) e péptidos contendo cisteína (N- ou C-terminal) é útil de 18 anos.
Os resultados da imobilização péptido em termos de adesão celular é inequívoca (Figuras 3 e 4). Considerando praticamente sem células aderem em PTFE nua, REDV-modificação torna o material um excelente substrato celular-adesivo. Complementar ao show trabalho preliminar protocolo acima mencionado que esta técnica também é aplicável em poroso (expandido) PTFE com resultados semelhantes (Figura 5 13, a polimerização de plasma 19) de superfície, este protocolo fornece uma diretriz para a modificação covalente de PTFE, empregando produtos químicos facilmente disponíveis e os procedimentos de laboratório e evitando equipamentos altamente sofisticados. Metodologias de plasma, tais como o plasma reactivo (O 2, NH 3, etc.) e a polimerização de plasma não são aplicáveis dentro de construções porosas ou tubos, porque espécies reactivas (p.ex., radicais) não são capazes de penetrar essas estruturas devido a inactivação por contacto com as matérias superfície. Por exemplo enxertos vasculares de pequeno diâmetro (diâmetro <5 mm) não pode ser tratado desta forma. Em contraste com isto, por meio da química húmida, não existe qualquer restrição em relação à forma do dispositivo. Desta forma, ao permitir a formação de um endothcamada Elial no lado luminal de um enxerto vascular ePTFE, trombogenicidade e desobstrução a longo prazo pode ser melhorada. Além disso, uma superfície adesiva celular para malhas cirúrgicas hérnia é suposto resultar numa melhor integração do tecido.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
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