Abstract
Dotando materiali di superficie con proprietà delle celle-adesivo è una strategia comune nel campo della ricerca biomateriale e ingegneria dei tessuti. Ciò è particolarmente interessante per i polimeri già approvati che hanno un uso prolungato in piedi in medicina perché questi materiali sono ben caratterizzate e problemi legali associati con l'introduzione di polimeri di nuova sintesi possono essere evitati. Politetrafluoroetilene (PTFE) è uno dei materiali più frequentemente impiegati per la fabbricazione di protesi vascolari, ma manca il polimero adesione cellulare promuovendo caratteristiche. Endotelizzazione, cioè, una copertura completa degli innesti superficie interna di uno strato confluenti di cellule endoteliali è considerato chiave per prestazioni ottimali, principalmente riducendo trombogenicità dell'interfaccia artificiale.
Questo studio indaga la crescita delle cellule endoteliali in PTFE peptide-modificato e confronta questi risultati con quelli ottenuti su substrato non modificato. L'accoppiamento con ilendoteliali adesivo cellule peptide Arg-Glu-Asp-Val (RedV) avviene mediante l'attivazione del polimero fluorin contenente usando l'naphthalenide reagente di sodio, seguita da successive fasi di coniugazione. coltura cellulare viene eseguita utilizzando cellule ombelicale Vena endoteliali (HUVEC) e ottima la crescita cellulare su materiale peptide-immobilizzato è dimostrata per un periodo di due settimane.
Introduction
Vari polimeri utilizzati in medicina che sono stati approvati per un certo tempo non presentano una maggiore biocompatibilità, vale a dire, la mancanza di cellule-adesività, induzione di incapsulamento fibrotico e trombogenicità, per citarne alcuni. Le interazioni tra il biomateriale ed il sistema biologico si svolge principalmente alla superficie dell'impianto. Di conseguenza, la ricerca si è focalizzata sulla modifica della superficie per creare proprietà appropriate per un'applicazione desiderata lasciando le proprietà di massa del materiale inalterato. Politetrafluoroetilene (PTFE) come polimero fisiologicamente inerte viene utilizzato in molti campi medici quali ernia maglia chirurgica 1, porte medici 2 e, soprattutto, innesti vascolari 3.
Soprattutto in situazioni sangue contattando la natura idrofoba di PTFE provoca adsorbimento non specifico di componenti del plasma e, di conseguenza, l'adesione piastrinica, spesso con conseguente thrombotieventi C e l'occlusione del graft 4. Inoltre, PTFE, come la maggior parte dei polimeri, non supporta adesione cellulare e la copertura che sarebbe una caratteristica desiderabile per indurre la formazione di uno strato benefico di cellule endoteliali (EC) sulla superficie interna (luminale) del graft vascolare 5. Un endotelio biomimetica dovrebbe compiere molte delle funzioni del suo equivalente naturali, in particolare le proprietà antitrombogeniche 6. Una strategia generale modifica biomimetica si basa sul concetto di dotare esclusivamente materiale con cella-adesività, lasciando le proprietà materiali sfusi inalterati. Inoltre, l'adesione piastrinica può essere ridotta incorporando antiadesivo (anti-fouling) attributi 7. Vari peptidi - principalmente derivati da proteine della matrice extracellulare - sono stati descritti che fortemente migliorare cell-adesione legandosi ai recettori cellulari, appartenente alla classe delle integrine 8. L'essereesempio st noto a questo proposito è il peptide Arg-Gly-Asp (RGD) che interagisce con la maggior parte dei tipi di cellule. Altre sequenze di aminoacidi sono riconosciuti da integrine espresse esclusivamente su cellule specifiche. Ad esempio, Arg-Glu-Asp-Val (RedV) e Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) sono stati trovati di legarsi a EC in modo specifico 9. Immobilizzazione covalente di tali peptidi è stata effettuata su una pletora di materiali intrinsecamente non adesivi compresi i metalli e polimeri 10,11.
PTFE poroso, più precisamente PTFE espanso (ePTFE) - insieme con polietilene tereftalato (PET) - è il materiale più importante per la produzione di innesti vascolari 12. Tecniche fisiche stabilite per trattamenti appropriati, come ad esempio la modifica al plasma 13 o con metodi fotochimici 14, sono ostacolati dal fatto che le strutture porose e / o tubolari non sono facilmente curabili all'interno dei pori o il lume rispettivamente. chimica umidaPTFE è un compito difficile a causa della natura altamente inerte del polimero fluorin contenente che resiste attacchi più chimici 15.
In questo articolo si descrive un metodo relativamente facile per una strategia di modificazione covalente. Adattato da un procedimento per rendere bondable PTFE, gruppi funzionali sono stati creati sulla superficie materiali che servono come punti di ancoraggio per ulteriori coniugazione di molecole biologicamente attive.
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Protocol
1. Preparazione di sodio Naphthalenide Attivazione Solution e attivazione della superficie
Nota: Effettuare reazioni in una cappa aspirante ben ventilata. Seguire le regole generali per la gestione dei solventi altamente infiammabili e metalli corrosivi come il sodio metallico. Naftalene ha un odore molto sgradevole (naftalina), anche in quantità molto piccole! Se non indicato diversamente reazioni vengono eseguite a temperatura ambiente. La sodio azide è altamente tossico! THF (99,9%, vedi Elenco dei materiali) è stato immagazzinato in circa il 20% (in volume) setaccio molecolare. Distillare THF con un contenuto d'acqua evidente nel corso di sodio. La formazione di naphthalenide di sodio non si verifica se sono presenti tracce di acqua.
- Ad una soluzione di 1,4 g (10,9 mmoli) di naftalene in 20 ml di tetraidrofurano (THF, essiccato su 3 Å setaccio molecolare), aggiungere 0,25 g (10,9 mmol) di sodio metallico in una bottiglia di vetro da 100 ml con tappo a vite munito di PTFE- rivestito barretta magnetica.
Nota: dissoluzionezione può essere notevolmente migliorata tagliando il sodio in piccoli pezzi e riscaldamento modesta (35 - 40 ° C). La soluzione finale ha un colore leggermente verdastro e può essere conservato in condizioni rigorosamente secco. - Punzonare dischi in PTFE di diametro di 12 mm dal materiale stagnola spessa 0,5 mm. Mark un lato (per esempio, utilizzando una lettera timbro punch) e pulire con iso-propanolo.
- Incubare PTFE-campioni individualmente nella soluzione di attivazione (passo 1,1) per 1 - 2 min utilizzando una pinza. Nota: Il cambiamento di colore dal bianco al marrone scuro indica il successo del trattamento.
- Successivamente lavare due volte con THF e poi con iso-propanolo.
Nota: La soluzione naphthalenide si esaurisce quando il suo colore diventa un marrone chiaro acquoso. soluzione naphthalenide non utilizzata (eventualmente contenente sodio metallico) deve essere decomposto aggiungendo lentamente iso-propanolo prima dello smaltimento. - Ossidare campioni trattati a perossido di idrogeno (30%) contenente il 20% (w / v) di acido tricloroacetico per 3 ore. lavaggiocon acqua e asciugare. La superficie ha ora un leggero aspetto brunastro. Nota: Attivazione e risultato di ossidazione in un drastico aumento della bagnabilità della superficie. Questo risultato è stato esaminato in dettaglio in precedenza 14.
- Trattare i dischi ossidato con il 50% (v / v) diisocianato (HMDI) in THF secco per 2 ore, risciacquare con THF e lasciare asciugare.
- Idrolizzare campioni cuscinetto isocianato in acqua per 2 - 3 ore e secco. Nota: La superficie PTFE ammino-funzionalizzato finale è molto più stabile rispetto ai campioni isocianato-cuscinetto ed è compatibile con molti reticolanti standard per ulteriori accoppiamento.
2. Peptide immobilizzazione
- Preparare una soluzione di 20% (v / v) dietilenglicol diglicidil etere (diepossido) in 50 mM tampone carbonato, pH 9.
- Posizionare i dischi amminati con il lato contrassegnato singolarmente in una piastra 24 pozzetti e aggiungere 1,5 ml della soluzione di epossido. Garantire la piena copertura dei campioni. Incubare per 2 ore e lavare duevolte con acqua e una volta con tampone carbonato.
- Aggiungere 50 ml di 0,5 mg / peptide ml (ad esempio, RedV) in 50 mM tampone carbonato, pH 9 contenente 0,01% NaN 3, sul fondo dei singoli pozzetti di una 24 piatto fresco bene e attentamente luogo la resina funzionalizzata dischi sottosopra down (cioè, contrassegnata lato giù) sulla goccia della soluzione di peptide. Assicurarsi che lo spazio tra il fondo del pozzo e il disco PTFE è completamente bagnata per capillarità.
- Incubare in una camera umida (per esempio, qualsiasi scatola di plastica richiudibile con un coperchio di chiusura a tenuta) con atmosfera umidificata (posizionando carta velina bagnata sul fondo) per almeno 3 ore o durante la notte.
Nota: Anche se il motivo RedV può essere considerata come ben caratterizzato, una sequenza aminoacidica scrambled o inversa può essere incluso come controllo negativo aggiuntivo. - Lavare tre volte con acqua e sterilizzare in 50% iso-propanolo / acqua per almeno 30 min. Prima di cella semina, rinsvia e campioni in sterile tampone fosfato salino (PBS).
3. cellulare Semina
- Grow HUVECs utilizzando le procedure standard di coltura cellulare 17,18.
- Posizionare i campioni peptide coniugato con il lato le modifiche effettuate fino a un 24 pozzetti. Utilizzare dischi in PTFE non trattati come controllo.
- Seme 5 x 10 4 HUVEC in 2 ml di mezzo per pozzetto ed incubare per 4 ore a 37 ° C e CO 2 5% in un incubatore.
- Rimuovere i dischi, risciacquare con cura per rimuovere le cellule senza legami e trasferire in un piatto fresco 24 bene. Aggiungere 2 ml di mezzo fresco e incubare per il periodo desiderato (ad esempio, 24 ore, 1 w, etc.). Cambiare media ogni due giorni.
- Preparare una soluzione stock di 1 mg / ml calceina-AM in dimetilsolfossido (DMSO).
- Dopo la crescita delle cellule rimuovere il mezzo, lavare con PBS e aggiungere PBS contenente 1 ml / ml calceina-AM macchia (ad esempio, 1 ml di una soluzione madre per ml PBS). Agitare delicatamente e incubate a 37 ° C per 45 minuti al buio.
- Lavare con PBS e prendere immediatamente micrografie su un microscopio a fluorescenza dotato di filtri FITC normali (Ex 488 nm, Em 515 nm). Utilizzare ingrandimento 100 volte. Eseguire triplicato da non modificato così come campioni trattati.
- Utilizzando il software ImageJ determinare l'area colonizzato dalle cellule. In alternativa contare le cellule manualmente o utilizzare ImageJ. Entrambi i metodi daranno informazioni simili su l'attaccamento e la crescita delle cellule sulle rispettive superfici.
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Representative Results
I risultati dei passaggi cruciali reazioni chimiche sono stati monitorati mediante spettroscopia IR (Figura 1). L'attivazione iniziale con naphthalenide sodio genera doppi legami - e, in misura minore - OH-funzionalità. Il segnale indicativo legami C = C scompaiono per ossidazione, ottenendo una superficie recante quasi esclusivamente idrossile gruppi. L'analisi di ulteriori fasi di coniugazione standard non sono mostrati qui. I cambiamenti di colore dovute all'attivazione ed ossidazione sono in accordo con la chimica prevista utilizzato: sistemi di incollaggio doppi coniugati dovrebbero essere brunastro ei risultati di perdita in illuminante (Figura 2). Inoltre, il possibile risultato di attivazione e ossidazione sulla morfologia superficiale è stato studiato mediante microscopia elettronica a scansione. Praticamente nessun effetto dannoso del trattamento è stato osservato (Figura 2).
Figure 3 e 4 mostrano i risultati di RedV-immobilizzazione sulla crescita delle cellule endoteliali. Mentre praticamente nessuna adesione cellulare e la proliferazione si verifica sul materiale non trattato modifica sostiene fortemente la colonizzazione nel corso di un periodo di due settimane. Esemplificato per un'applicazione clinica (cioè, innesti vascolari), la modifica è stata identico eseguita su materiale originale da un innesto commercialmente disponibile in PTFE espanso con risultati simili per un periodo di una settimana (Figura 5).
Figura 1. IR spettroscopia di PTFE. Il trattamento di PTFE incontaminata (A) porta alla formazione di doppi legami e in una certa misura di funzioni idrossi (B). Successivamente C = legami C sono ridotti a causa dell'ossidazione (C Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. aspetto ottico di PTFE attivato nuda e di superficie. (A) considerando che in PTFE non trattata (a sinistra) appare bianco, l'attivazione utilizzando naphthalenide sodio produce un colore bruno scuro (al centro) che è leggermente illuminato su di ossidazione (a destra). Non trattato (B) e ossidato PTFE campioni (C) sono stati inoltre studiati usando la microscopia elettronica a scansione (ingrandimento: 2,000X). I dischi sono 12 mm di diametro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. la cultura delle cellule endoteliali in PTFE incontaminata e peptidi modificati. Campioni non trattati non sono colonizzate da ECS (A, C, E, dopo 24 ore, 1 w e 2 w, rispettivamente), mentre l'adesione e la crescita su materiale peptide-modificato è notevolmente migliorata (B, D e F, dopo 24 ore, 1 w e 2 w rispettivamente). Barra di scala:. 100 micron, ingrandimento 100X Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Quantificazione di copertura cellulare mediante analisi ImageJ. La crescita cellulare sul nudo PTFE (A, C,E) e sulle superfici polimeriche RedV coniugato (B, D, F) espressi come percentuale di copertura della superficie totale. Peptide immobilizzato permette chiaramente adesione iniziale (B) e supporta la colonizzazione in un periodo di 2 settimane (D, F). Triplice copia determinazioni, media ± deviazione standard). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Le cellule endoteliali coltivate per 1 settimana in PTFE espanso. La struttura di ePTFE è dimostrata utilizzando microscopia elettronica a scansione (A). I risultati ottenuti su materiale poroso sono conformi a quelli ottenuti con campioni PTFE piane. In contrasto con poche cellule trovatesu materiale nudo (B) la superficie modificata (C) costituisce un eccellente substrato per la crescita cellulare. Barre di scala sono 100 micron per A, B e C, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Rappresentazione schematica della modificazione chimica di PTFE utilizzando wet-chimica. Doppi legami generati dal trattamento Na-naphthalenide vengono ossidati conseguente OH funzionalità. Un diisocianato idrossile-reattiva viene poi immobilizzato e idrolizzato ad una ammina. Infine il diepossido bifunzionale viene applicato a coniugare il peptide RedV con il gruppo amminico N-terminale. Clicca qui per view una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La descrizione dettagliata del protocollo di modifica della superficie di PTFE costituito da gradini successivi a partire con l'eliminazione del fluoro dalla catena polimerica come illustrato in figura 6. Come risultato, uno strato è formato che contiene una quantità abbondante di doppi legami coniugati carbonio-carbonio in secondo il colore marrone scuro che si è sviluppato in seguito al trattamento naphthalenide. ossidazione standard con perossido di idrogeno acido si ottiene una superficie idrossilato accompagnato da illuminare per un marrone chiaro, questo riflette la perdita di doppi legami. Questo processo è chiaramente evidenziato mediante spettroscopia IR.
Al fine di ottenere una funzionalità più generalmente applicabile, le pendente gruppi-OH sono stati convertiti in amino-funzionalità per semplice trattamento con un diisocianato e successiva idrolisi dei NCO-porzioni di ammine primarie. Questo è favorevole, perché il materiale ammina-cuscinetto possono essere conservati per periodi prolungati, mentre la HIGHLY isocianato reattivo è suscettibile alla presenza di umidità dell'aria.
Bisogna fare attenzione a evitare anche di tracce di acqua nella fase di attivazione iniziale e il trattamento HMDI perché sia naphthalenide di sodio e l'isocianato sono altamente suscettibili all'idrolisi. In contrasto con procedure standard in cui il campione è completamente immerso nella soluzione, la presente protocollo richiede solo piccole quantità di reagente. Pertanto questo metodo permette di risparmiare molto peptide costosa.
superfici Amine portanti sono punti di partenza ideali per l'accoppiamento di molte biomolecole. Il diepossido impiegato in questo lavoro è interessante sotto vari aspetti: è relativamente poco costoso, idrofila, altamente reattivo nei confronti ammine ed epossidi non reagiti vengono idrolizzati in ambiente acquoso in dioli "fisiologicamente inerti". reticolanti Homobifunctional sono reagenti adatti in cui un solo gruppo reattivo è presente on il peptide di essere immobilizzato. Questo vale per RedV contenenti un solo singolo ammino-gruppo primario sul N-terminale (questo è lo stesso per i RGDS sequenza di uso frequente). Per peptidi contenenti residui di lisina (con ammine catena laterale) il risultato della coniugazione è ambigua, il che significa che l'accoppiamento corretto non si verifica in un modo definito. In questo caso, una strategia usando i reticolanti eterobifunzionale (ad esempio, quali ammine e tiolo-reattiva) peptidi e cisteina (N- o C-terminale) contenente è utile 18.
I risultati di immobilizzazione peptide in termini di adesione cellulare è univoche (figure 3 e 4). Mentre praticamente cellule aderiscono in PTFE nuda, RedV-modifica rende il materiale un ottimo substrato cellulare-adesivo. Complementare al protocollo sopra citato lavoro preliminare dimostrano che questa tecnica è applicabile anche su poroso (espanso) PTFE con risultati simili (Figura 5 13, plasma polimerizzazione 19), questo protocollo fornisce una guida per la modifica covalente di PTFE impiegando prodotti chimici facilmente disponibili e le procedure di laboratorio ed evitando attrezzature altamente sofisticate. Metodologie plasma come plasma reattivo (O 2, NH 3, etc.) e la polimerizzazione plasma non sono applicabili nei costrutti porosi o tubi perché specie reattive (per esempio, radicali) non sono in grado di penetrare queste strutture a causa di inattivazione a contatto con i materiali superficie. Per esempio innesti vascolari di piccolo calibro (diametro <5 mm) non possono essere trattati in questo modo. In contrasto con questo, mediante chimica umida, non vi sono limitazioni per quanto riguarda la forma del dispositivo. In questo modo, consentendo la formazione di un endothstrato Elial sul lato luminale di un innesto vascolare ePTFE, trombogenicità e pervietà a lungo termine può essere migliorata. Inoltre, una superficie adesiva cella per maglie ernia chirurgici dovrebbe tradursi in una migliore integrazione dei tessuti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
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