Abstract
細胞接着性を有する材料表面を持たせることは生体材料研究と組織工学における一般的な戦略です。これは、これらの材料が新たに合成されたポリマーの導入に関連した十分に特徴づけおよび法的問題を回避することができるされているので、医療に長年の使用を持っている既に承認されたポリマーのために特に興味深いです。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）は、血管移植片の製造のために最も頻繁に用いられる材料の一つであるが、ポリマーの機能を促進、細胞接着を欠いています。内皮化、 すなわち、内皮細胞の融合層と移植片内面の完全なカバレッジは、主に人工的なインターフェイスの血栓形成を低減することにより、最適なパフォーマンスにキーをみなされています。
この研究は、ペプチド修飾PTFE上の内皮細胞の成長を調査し、未修飾基材上に得られたものと、これらの結果を比較します。とのカップリング内皮細胞接着ペプチドのArg-Gluの-ASP-ヴァル（REDV）は、後続の結合工程に続いて、試薬ナトリウムナフタレニドを使用して、含フッ素重合体の活性化を介して行われます。細胞培養は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を用いて達成され、ペプチド固定化材料の優れた細胞増殖は、2週間の期間にわたって示されています。
Introduction
いくつかを言及するためにいくつかの時間のために承認されている医学で使用される様々なポリマー強化された生体適合性を示さない、 すなわち 、細胞接着性の欠如、線維性カプセル化および血栓形成の誘導、。生体材料および生物学的システムとの間の相互作用は、主にインプラントの表面で起こります。その結果、研究は影響を受けない材料のバルク特性を残したまま、所望の用途に適切な特性を作成するために、表面改質に焦点を当てています。ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、生理学的に不活性なポリマーは、例えば、ヘルニア手術用メッシュ1、医療用ポート2のような多くの医療分野で使用されているように、最も重要なのは、血管移植片3。
特に血液に接触状況でPTFEの疎水性は、多くの場合、thrombotiその結果、非特異的血漿成分の吸着と結果の血小板接着としての原因となりますCイベントや移植片4の閉塞。さらに、PTFEは、ほとんどのポリマーのように、望ましい特徴は、血管移植片5の内側（管腔）表面上の内皮細胞（EC）の有益な層の形成を誘導することであろう細胞接着とカバレッジをサポートしていません。バイオミメティック内皮は、特にその抗血栓特性6、その自然同等の機能の多くを果たすことが期待されます。一般的なバイオミメティック修正戦略はバルク特性が影響を受けない材料を残しながら、もっぱら細胞接着性を有する材料を持たせるという概念に基づいています。また、血小板粘着、抗接着剤（防汚）7属性を組み込むことによって減少させることができます。種々のペプチド-主に細胞外マトリックスのタンパク質に由来する-は強くインテグリン8のクラスに属し、細胞受容体に結合することによって細胞接着を増強することが記載されています。ありますこの点の例をST知らほとんどの細胞型と相互作用するペプチドするArg-Gly-Asp（RGD）です。他のアミノ酸配列は、排他的に特定の細胞に発現インテグリンによって認識されます。例えば、Argの-のGlu-ASP-ヴァル（REDV）およびTyr-Ileの-Glyを-のSer-Argの（YIGSR）は、特定の方法9でのECに結 合することが見出されてきました。このようなペプチドの共有結合固定化は、金属およびポリマー10,11を含む、本質的に非接着性材料の過剰に行われています。
多孔質PTFE、より正確には延伸PTFE（ePTFEの） -ポリエチレンテレフタレート（PET）と一緒に-血管移植片12を製造するための最も重要な材料です。このようなプラズマ改質13として、または光化学的方法14による適切な治療のために確立された物理的な技術は、多孔性および/ または管状の構造は、それぞれの孔または管腔内容易に治療可能ではないという事実によって妨げられています。湿式化学PTFEであるため、ほとんどの化学的攻撃15に抵抗する含フッ素重合体の高度に不活性な性質のために困難な作業です。
本稿では、共有結合修飾戦略の比較的容易な方法を説明します。結合可能なPTFEをレンダリングする手順から適応、官能基は、生物学的に活性な分子のさらなる結合のためのアンカーポイントとして機能する材料の表面上に作成されました。
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Protocol
1.ナトリウムナフタレニ活性化溶液の調製と表面活性化
注：よく換気ドラフト内で反応を行います。金属ナトリウムなどの引火性の高い溶剤や腐食性の金属を処理するための一般的なルールに従ってください。ナフタリンは、非常に少量で、非常に不快な臭い（防虫剤）を持っています！特記しない場合の反応は室温で行われます。アジ化ナトリウムは非常に有毒です！ THF分子ふるい（体積）に対して約20％を保存した（99.9％は、マテリアルのリストを参照してください）。ナトリウムを超える顕著な含水量でTHFを蒸留。微量の水が存在する場合、ナトリウムナフタレニドの形成は起こりません。
- （3オングストロームのモレキュラーシーブ上で乾燥THF）テトラヒドロフラン20ml中のナフタレンを1.4g（10.9ミリモル）の溶液に、PTFE-を備えたスクリューキャップ100mlのガラスボトル0.25グラム（10.9ミリモル）のナトリウム金属を加えますコーティングされた磁気撹拌棒。
注：Dissolu（ - 40°C 35）化が大幅に小片と適度な加熱にナトリウムを切断することによって向上させることができます。最終溶液は暗い、わずかに緑がかった色を有しており、厳密な乾燥条件下で保存してもよいです。 - 厚さ0.5mmの箔材料から直径12mmのPTFEディスクを打ち抜きます。マーク1の側（ 例えば 、文字スタンプパンチを使用）し、イソプロパノールできれいに。
- 鉗子を使用して2分 - 1のための活性化溶液（ステップ1.1）で個別にPTFE-サンプルをインキュベートします。注：ダークブラウンに白から色の変化は、治療の成功を示しています。
- 続いてイソプロパノールで二回THFで、次いですすぎます。
注：ナフタレニ溶液が排出されるときに淡い光の茶色の色が変化します。 （おそらく金属ナトリウムを含む）、未使用ナフタレニドの溶液をゆっくりと前処理にイソプロパノールを添加することにより分解されなければなりません。 - 3時間トリクロロ酢酸（w / v）の20％を含む過酸化水素水（30％）で処理した試料を酸化します。ウォッシュ水とドライで。表面は現在、わずか茶色がかった外観を有します。注意：表面の大幅増加濡れ性の活性化と酸化の結果を。この発見は、以前は14について詳細に検討しました。
- 、2時間の乾燥THF中の50％（v / v）のヘキサメチレンジイソシアネート（HMDI）で酸化したディスクを扱うTHFで洗浄し、乾燥するために残します。
- 3時間とドライ - 2水にイソシアネートベアリングサンプルを加水分解する。注：最終的なアミノ官能化PTFE表面は、はるかに安定したイソシアネート含有サンプルよりも、さらにカップリングのための多くの標準的な架橋剤と互換性があります。
2.ペプチド固定化
- 炭酸塩緩衝液、pH 9を50mMで20％（v / v）のジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ジエポキシド）の溶液を調製します。
- 個別に24ウェルプレートにマークされた側を上にしてアミノ化ディスクを置き、エポキシド溶液1.5mlを追加します。サンプルの完全なカバレッジを確認してください。 2時間インキュベートし、2を洗います回水で一度炭酸緩衝液と。
- 新鮮な24ウェルプレートの個々のウェルの底には、NaN 3 0.01％を含む50mM中の0.5mg / mlのペプチド（ 例えば 、REDV）炭酸緩衝液、pH 9の50μlを添加して、慎重にエポキシ官能ディスクの利点を置きます-downペプチド溶液の液滴上に（ すなわち 、ダウンサイドマークされています）。井戸の底とPTFEディスクとの間のスペースが完全に毛細管現象に濡らされていることを確認します。
- 少なくとも3時間または一晩（底にウエットティッシュペーパーを配置することによって）加湿雰囲気で湿った室（ 例えば、タイトな閉鎖蓋を持つ任意の密封可能なプラスチックの箱）でインキュベートします。
注：REDVモチーフが同様に特徴付けみなすことができるものの、スクランブル又は逆転アミノ酸配列は、追加の陰性対照として含まれてもよいです。 - 水で3回洗浄し、少なくとも30分間、50％イソプロパノール/水中で滅菌します。細胞播種、rinsに先立ち滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に試料を電子。
3.細胞播種
- 標準的な細胞培養手順17,18を使用したHUVECを成長させます。
- 24ウェルプレートで修正された面を上にして、ペプチドコンジュゲートのサンプルを置きます。コントロールとして、未処理のPTFEディスクを使用してください。
- シード5×10ウェルあたり2 mlの培地中で4 HUVECを、37℃で4時間、インキュベーター中、5％CO 2インキュベートします。
- ディスクを取り出し、付着していない細胞を除去し、新鮮な24ウェルプレートに転送するために慎重にすすいでください。新鮮な培地の2ミリリットルを加え、所望の期間インキュベート（ 例えば、24時間、1ワット、 など ）。 2日毎に培地に変更します。
- ジメチルスルホキシド（DMSO）に1mg / mlのカルセインAMのストック溶液を準備します。
- 培地を除去し、細胞を成長させた後、PBSで洗浄し、1μL/ mlのカルセインAM染色（ 例えば、mlのPBSあたり原液の1μl）を含むPBSを追加します。静かに攪拌し、incubat暗所で45分間、37℃での電子。
- 標準FITCフィルターを備えた蛍光顕微鏡で顕微鏡写真を取る（例：488 nmの、エム515 nm）をすぐにPBSで洗浄し。 100倍の倍率を使用してください。変更されていないだけでなく、処理された試料からの三連を実行します。
- ImageJソフトウェアを使用すると、細胞が定着領域を決定します。あるいは、手動で細胞数をカウントしたり、ImageJのを使用しています。どちらの方法でも、それぞれの表面上の細胞の付着と成長についての同様の情報を提供します。
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Representative Results
重要な化学反応工程の結果は、IR分光法（ 図1）によりモニターしました。マイナー程度まで - - OH-機能ナトリウムナフタレニドとの最初の活性化は、二重結合を生成します。信号を示すC = C結合は、ほぼ独占的にヒドロキシル基を有する表面が得られる、酸化により消滅します。さらに、標準的なコンジュゲーション工程の分析はここでは示されていません。活性化および酸化による色の変化が使用されると予想化学と一致する。共役二重結合系は、（ 図2）を明るくに、その損失をもたらす茶色がかったことが期待されます。また、表面形態の活性化及び酸化の可能な結果は、走査型電子顕微鏡を用いて調べました。事実上、治療の有害な影響は（ 図2）は観察されませんでした。
3及び図 4は、内皮細胞増殖に対するREDV、固定化の結果を示します。実質的には、細胞接着および増殖が未処理材に発生していないのに対し、修正が強く2週間にわたってコロニー形成をサポートしています。臨床応用（ すなわち、血管移植片）について例示し、修正は同じ一週間（ 図5）の期間にわたって、同様の結果を有する延伸PTFE製の市販のグラフトから元の材料で行いました。
自然のままのPTFE（A）の二重結合の形成およびヒドロキシ機能（B）のある程度の結果のPTFE。治療の 図1. IR分光法 。続いてC = C結合が酸化による（Cに還元されますこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
裸の表面活性化したPTFEの 図2. 光学外観。（A）未処理のPTFEは（左）白色に見えるのに対し、ナトリウムナフタレニを使用して、活性化は、わずか（右）酸化時に明るくなる濃い茶色がかった色（真ん中）が得られます。未処理の（B）およびPTFE（C）サンプルをさらに走査型電子顕微鏡（倍率2,000X）を用いて検討した酸化。ディスクは直径12mmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
自然のままのペプチドで修飾されたPTFE上 図3. 内皮細胞培養。ペプチド修飾材料上の接着と成長が大幅に強化されているのに対し、未処理の試料は電気部品（A、C、24時間後E、1ワットと2それぞれワット）によって植民地化されていません（それぞれW 24時間W 1及び2後のB、D及びF）。スケールバー：100μmであり、倍率100X この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ImageJの解析によるセルカバレッジの 図4. 定量。裸PTFE（A、C上の細胞の成長、E）およびREDV共役系高分子の表面に（B、D、F）は総面積の割合のカバレッジとして表現。固定化ペプチドは明らかに初期接着（B）を可能にし、2週間の期間（D、F）上でコロニー形成をサポートしています。 ）平均±標準偏差、決定をトリプリケート。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5. 内皮細胞は、延伸PTFEで1週間増殖させた。ePTFEの構造は、走査型電子顕微鏡（A）を用いて示されています。多孔質材料で得られた結果は、平らなPTFEの試料について得られたものと一致しています。見つかったいくつかの細胞とは対照的に裸の材料（B）に修正された表面（C）は 、細胞増殖のための優れた基板を提供します。スケールバーはそれぞれA、BとCのために100μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ナトリウム-ナフタレニ処理によって生成された図6 の湿式化学を使用してPTFEの化学修飾の模式図。二重結合は、OH、官能基を生じる酸化されます。ヒドロキシル反応ジイソシアネートは、その後、固定化し、アミンに加水分解されます。最後に、二官能性ジエポキシドは、N末端 アミノ基を使用して、REDVペプチドを結合するために適用されます。 Vにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をIEW。
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Discussion
PTFEの表面改質のプロトコルの詳細な説明は、図6に示されるようにポリマー主鎖からのフッ素の除去から始まる連続したステップで構成され、その結果、層は、共役炭素-炭素二重結合の豊富な量が含まれて形成されています。ナフタレニの処理時に開発濃い茶色がかった色に応じて。酸性の過酸化水素による標準的な酸化が淡褐色に明るくすることにより伴うヒドロキシル表面が、これは二重結合の損失を反映して得られます。このプロセスは、明らかに、IR分光法によって証明されます。
より一般的に適用可能な機能性を達成するために、ペンダントOH基は、第一級アミンへのNCO成分のジイソシアネートおよびその後の加水分解との単純な処理により、アミノ官能性に変換しました。アミン含有物質は、HIG一方、長期間保存することができるので、これは、有利ですHLY反応性イソシアネートは、空気湿度の非常に存在に対して感受性です。
ケアは、ナトリウムナフタレニとイソシアネートの両方が加水分解を非常に受けやすいためであっても、初期活性化ステップとHMDI処理中の水の微量の回避に注意しなければなりません。試料が完全に溶液中に浸漬されている標準的な手順とは対照的に、本プロトコルは、試薬の少量のみを必要とします。したがって、この方法は、高価なペプチドの多くを保存します。
アミン軸受面は、多くの生体分子の結合のための理想的な出発点です。この作業に用いられるジエポキシドは、いくつかの点で興味深いものです：「生理的に不活性」のジオールに水性環境中で加水分解され、親水性、比較的安価アミンおよび未反応のエポキシドに対して高度に反応性です。ただ1つの反応基が存在oがあるホモ二官能性架橋剤は、適切な試薬でありますNペプチドが固定化されます。これは、（これは頻繁に使用されるシーケンスRGDSについても同様である）のN末端にただ1つの一級アミノ基を含むREDVに適用されます。 （側鎖アミンとの）リジン残基を含むペプチドを結合の結果は、適切なカップリングが定義された方法では起こらないことを意味し、曖昧です。この場合、ヘテロ架橋剤（ 例えば 、アミンおよびチオール反応性）およびシステイン（N末端 またはC末端）を含むペプチドを用いる戦略が役に立つ18です。
細胞接着性の観点から、ペプチドの固定化の結果は、（ 図3及び4）明白です。ほとんどの細胞は裸のPTFEに付着しないのに対し、REDV-変更は、材料に優れた細胞接着性基材をレンダリングします。この技術はまた、同様の結果を有する多孔性（拡大）PTFE（ 図5に適用可能であることは前述したプロトコルの準備作業のショーに相補的な13、プラズマ重合19）を利用する技術を表面とは対照的に、このプロトコルは、容易に入手可能な化学物質および実験室手順を使用することによって、高度に洗練された設備を回避することによってPTFEの共有結合的修飾のための指針を提供します。反応種（ 例えば 、ラジカル）が材料と接触した際に不活性化のために、これらの構造に浸透することができませんので、このような反応性プラズマ（ など 、O 2、NH 3、）およびプラズマ重合などのプラズマ方法は、多孔性構築物またはチューブの中には適用されません表面。例えば、小口径人工血管（直径<5ミリメートル）は、この方法で処理することはできません。これとは対照的に、湿式化学によって、装置の形状に関する制限はありません。このように、endothの形成を可能にすることにより、ePTFEの血管移植片、血栓形成および長期開存の腔側にelial層を向上させることができます。また、外科ヘルニアメッシュの細胞接着面は、より良好な組織統合をもたらすと考えられます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
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