Abstract
赋予材料与细胞粘接性能的表面是生物材料研究和组织工程的共同战略。这是对于具有在医学长期使用，因为这些材料是公引进新合成的聚合物可避免相关特征和法律问题已核准的聚合物特别有趣。聚四氟乙烯（PTFE）是用于制造血管移植物的最经常使用的材料之一，但该聚合物缺乏细胞粘合促进功能。内皮，即移植物的内表面与血管内皮细胞的汇合层完全覆盖被认为是关键的最佳性能，主要是通过降低人工接口的血栓形成。
本研究探讨的内皮细胞上的肽，改性PTFE的生长和这些结果未修饰基片上得到的那些进行比较。与耦合内皮细胞粘附肽精氨酸 - 谷氨酸 - 天冬氨酸 - 缬氨酸（REDV）经由使用萘基试剂钠含氟聚合物的活化进行，接着后续缀合的步骤。细胞培养使用在肽 - 固定化材料的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和优异的细胞生长证实超过两个星期内完成。
Introduction
在医学中使用的各种聚合物已批准了一段时间没有表现出增强的生物相容性， 即缺乏细胞粘合性，纤维化封装和血栓的诱导，仅举几例。生物材料和生物系统之间的相互作用主要发生在植入物的表面上。因此，研究集中于表面改性，以用于期望的应用创建适当的属性，同时留下的材料的整体性质不受影响。聚四氟乙烯（PTFE）作为生理惰性聚合物在许多医学领域中使用，如疝气手术网1，医疗端口2，以及最重要的是，血管移植物3。
特别是在血液接触的情况下的PTFE的疏水性导致血浆成分的后果血小板粘附和作为非特异性吸附，往往造成thrombotiç事件和移植物4的闭塞。此外，PTFE，最喜欢的聚合物，不支持细胞粘附和覆盖这将是非常理想的，诱导血管移植物5的内（管腔）表面上的内皮细胞（EC）的一个有益的层的形成。仿生内皮有望实现其许多天然等价物的功能，尤其是它的抗凝血性能6。一般的仿生修正策略是基于专门的赋予与细胞粘着材料同时使材料整体性能不受影响的概念。另外，血小板的粘附可以通过将抗粘合剂（防污）属性7被减小。各种肽-大多来自细胞外基质的蛋白的-已被描述，通过结合至细胞受体，属于类整8的强烈增强细胞粘附。该会ST-已知在这方面的例子是，与大多数细胞类型相互作用的肽精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸（RGD）。其它氨基酸序列是通过在特定的细胞中只表达整联的认可。例如，精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-缬氨酸（REDV）和Tyr -异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸（YIGSR）已发现结合于内皮以特定方式9。这种肽的共价固定已在固有的非粘性材料，包括金属和聚合物10,11-过多进行。
PTFE多孔，更精确地膨胀型PTFE（膨体聚四氟乙烯） -与聚对苯二甲酸乙酯（PET）的沿-是用于生产血管的最重要的材料移植物12。对适当的治疗建立物理技术，如等离子体改性13或通过光化学方法14，是由以下事实多孔和/或管状的结构没有分别的孔或腔内容易可治疗阻碍。湿化学聚四氟乙烯是一项困难的任务，因为抵抗大多数化学攻击15含氟聚合物的高惰性性质。
在本文中，我们描述了一个共价修饰策略相对简便的方法。从过程适于渲染聚四氟乙烯粘合，官能团分别对材料表面作为生物活性分子的进一步缀合锚固点创建。
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Protocol
1.钠萘基活性溶液和表面活化制备
注：在通风良好的通风橱内开展的反应。按照一般规则处理高可燃性溶剂和腐蚀性的金属，如金属钠。萘具有非常难闻的气味（后备），即使在极少量！如果没有另外说明的反应是在室温下进行。叠氮化钠是剧毒！的THF（99.9％，参见材料的列表）被储存在约20％（体积）分子筛。蒸馏THF有明显的水分含量超过钠。如果痕量水存在不发生萘钠的形成。
- 到的萘1.4克（10.9毫摩尔）在20毫升四氢呋喃中的溶液（THF中，用3埃分子筛干燥），加入0.25g克（10.9毫摩尔）的金属钠在装有PTFE-一个螺旋盖的100ml玻璃瓶涂覆的磁性搅拌棒。
注：Dissolu（ - 40℃35）和灰可通过切割钠切成小片，并温和加热大大提高。最终溶液具有暗，稍浅绿色并且可以严格干燥的条件下储存。 - 0.5毫米厚箔材冲压出直径为12毫米的PTFE盘。马克一面（ 例如 ，使用一个字母邮票打孔），清洁的异丙醇。
- 2分钟使用镊子 - 在活化溶液（步骤1.1）中1单独孵育聚四氟乙烯样品。注：从白色的颜色变化至黑褐色表示成功治疗。
- 随后冲洗两次用THF，然后用异丙醇。
注：萘基液耗尽了它的颜色变成水汪汪的浅棕色的时候。 （可能含有金属钠）未使用的萘基溶液必须通过处置前缓慢加入异丙醇分解。 - 氧化在含20％（重量/体积）三氯乙酸3小时的过氧化氢（30％）处理的样品。洗与水和干燥。表面现在有一个轻微的褐色外观。注意：激活和氧化导致表面的急剧增加的润湿性。这一发现进行了详细的研究之前14。
- 治疗用50％（V / V）的六亚甲基在无水THF异氰酸酯（HMDI）氧化光盘2小时，用THF冲洗并离开干燥。
- 水解水异氰酸酯轴承样品2 - 3小时，干燥。注意：最终氨基官能化的PTFE表面比异氰酸酯承载样品更稳定，并与许多标准交联剂进一步耦合兼容。
2.固定肽
- 在50mM制备的20％（体积/体积）二甘醇二缩水甘油基醚（二环氧化物）中的溶液的碳酸盐缓冲液，pH 9。
- 将带有标记的朝上的胺化光盘单独成24孔板，并添加1.5环氧化物溶液。保证样品的全面覆盖。孵育2小时，洗2次用水和一次用碳酸盐缓冲液。
- 加入50μl0.5毫克/毫升的肽（ 例如 ，REDV）在50mM碳酸盐缓冲液，pH 9含有0.01％NaN 3的的，到一个新的24孔板的各个孔的底部，并小心地将环氧官能化的光盘向上-down（ 即 ，标记面朝下）到肽溶液的下降。确保良好的底部和聚四氟乙烯盘之间的空间被完全润湿由于毛细管作用。
- 孵育在湿室（ 例如，任何可密封塑料盒具有紧闭盖）与湿润气氛（通过将湿纸巾的底部）至少3小时或过夜。
注意：尽管在REDV基序可被视为充分表征，加扰或反向氨基酸序列可以被包括作为一个附加的阴性对照。 - 用水洗涤三次，并在50％的异丙醇/水消毒至少30分钟。至细胞接种，RINS之前E在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的样本。
3.细胞接种
- 使用标准的细胞培养过程17,18血管内皮细胞生长。
- 放置与改性朝上肽缀合的样品在24孔板中。使用未经处理的PTFE盘作为对照。
- 种子5×10 4的HUVEC以每孔2毫升培养基并孵育在37℃的恒温箱中4小时和5％的CO 2。
- 取出光盘，仔细冲洗去除独立的细胞，并转移到一个新的24孔板。加入2毫升的新鲜培养基中并孵育所需的周期（ 例如，24小时，1个W 等 ）。介质改变每两天。
- 制备1mg / ml的钙黄绿素-AM的二甲亚砜（DMSO）的储备溶液。
- 生长后细胞中除去培养基，用PBS洗并加入PBS中含1微升/毫升钙黄绿素-AM染色（ 例如，1微升每毫升PBS中的储备液）。轻轻搅动和incubat向在37℃下在黑暗中45分钟。
- 用PBS洗涤，并立即在配备标准FITC滤光片的荧光显微镜显微照片（前488纳米，515 EM纳米）。用放大100倍。执行从未修改三份以及处理的样品。
- 使用ImageJ软件确定由细胞定植的区域。或者手动计数细胞或使用ImageJ的。这两种方法都将给出关于各表面上的附着和细胞生长的类似信息。
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Representative Results
的关键化学反应步骤的结果是通过IR光谱（ 图1）进行监测。用萘钠初次激活产生双键 - 对一个未成年人的程度 - OH-功能。该信号指示C = C键消失在氧化，得到表面轴承几乎完全的羟基基团。进一步规范结合的步骤分析，这里没有显示。由于激活和氧化的颜色变化是在与所使用的预期化学协议：共轭双键系统预计是褐色及其损失导致增亮（ 图2）。此外，激活和氧化的表面形貌的可能结果是由扫描电子显微镜的装置的影响。几乎观察治疗没有不利影响（ 图2）。
图3和4示出REDV固定化的内皮细胞生长的结果。而几乎没有细胞粘附和增殖的未处理材料发生变形强烈支持在两周定植。例举用于临床应用（ 即，血管移植物），改性物相同于原始材料从与在一段一周（ 图5）的一个类似的结果由发泡PTFE的市售接枝进行。
图1.纯净聚四氟乙烯（A）的结果中的双键的形成和羟基功能（B）在一定程度上的聚四氟乙烯，治疗的红外光谱 。接着C = C键都由于减少到氧化（℃ 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 裸露和表面活化PTFE的光学外观。（A）中而未经处理的PTFE（左）显示为白色，使用萘钠的激活产生了暗褐色（中间），其略微氧化时（右）亮。使用扫描电子显微镜（：2000倍放大率）未处理的（B）和氧化的PTFE（C）的样品进行另外的影响。光盘直径12毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
关于原始和肽-改性PTFE 图3. 内皮细胞培养物。未处理的样品没有被内皮细胞（A，C，之后E 24小时，1个W和2瓦特分别）而在肽改性的材料粘附和生长大大增强定植（B，D和F 24小时后，1个W和2瓦特分别）。比例尺：100微米，放大倍率100X 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. ImageJ的分析定量小区覆盖。在裸PTFE（A，C细胞生长，E）和上REDV共轭聚合物的表面（B，D，F），表示为总面积的覆盖百分比。固定化肽显然使初期粘合（B）和支持定植在2周的时间内（D，F）。三次测定，平均±标准差）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. 内皮细胞生长1周上膨胀的PTFE。使用扫描电子显微镜（A）中示出的ePTFE的结构。多孔材料所得到的结果是根据用于扁平PTFE样品获得的那些。在对比中发现的一些细胞在裸材料（B）的改性表面（C）提供了细胞生长的优良的衬底。比例尺是100微米分别为A，B和C。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6. 使用湿化学PTFE的化学修饰的示意图。由钠萘基处理生成的双键被氧化导致OH-功能。然后，羟基活性二异氰酸酯被固定和水解成胺。最后，双功能双环氧化合物应用于使用N端氨基缀合的REDV肽。 请点击此处到vIEW这个数字的放大版本。
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Discussion
PTFE的表面改性协议的详细描述由具有消除从聚合物主链的氟开始， 如图6所示的连续步骤，其结果，在形成的层，其中包含的共轭碳-碳双键的充裕量根据深褐色的颜色，在萘基处理开发。用酸性的过氧化氢标准氧化产生伴随着增亮到淡褐色羟基化表面，这反映了双键的损失。该方法显然是通过IR光谱证明。
为了实现更普遍适用的功能性，悬垂OH-基团通过用所述NCO封部分与伯胺的二异氰酸酯和随后的水解简单处理转化成氨基官能团。这是有利的，因为胺轴承材料可以长时间储存而HIG溶血素反应的异氰酸酯是易被空气湿度的非常存在。
必须小心避免采取的甚至痕量水的初始活化步骤和HMDI治疗，因为这两个萘钠和异氰酸酯是高度容易水解。在对比中，样品完全浸在溶液中的标准方法，本协议就必须只有少量的试剂。因此，这种方法节省了大量昂贵的肽。
胺 - 轴承表面是许多生物分子的耦合理想起始点。在这项工作中所用的二环氧化物是在几个方面有趣：它是相对便宜的，亲水性的，对胺和未反应的环氧化物反应性高，水解在含水环境中为“生理惰性”二醇。同双功能交联剂是合适的试剂，其中只有一个反应基团存在Øn中的肽，固定。这适用于N末端上仅含有一个单一的伯氨基的REDV（这是经常使用的序列RGDS相同）。对于含赖氨酸残基（侧链胺）的肽的缀合的结果是不明确的，这意味着适当的耦合不以限定的方式发生。在这种情况下，使用异交联剂（ 例如 ，胺和硫醇反应性）含有与半胱氨酸（N-或C-末端）的肽的策略是有益的18。
肽固定化的细胞粘附方面的结果是明确的（ 图3和4）。而几乎没有细胞粘附在裸露的PTFE，REDV修饰渲染材质优良的细胞粘接基材。互补于上述协议的初步工作表明，该技术也适用于具有类似的结果多孔（扩）的PTFE（ 图5 13，等离子体聚合19）的，该协议通过使用容易获得的化学品和实验室程序和通过避免高尖端设备提供了PTFE的共价修饰的准则。等离子体方法如反应等离子体（O 2，NH 3 等 ），等离子聚合是不适用的多孔结构或管内，因为反应性物质（ 例如 ，自由基）无法穿透这些结构，由于在与材料接触的失活表面。例如小口径人工血管（直径<5毫米）的不能用这种方法进行处理。与此相反，通过湿化学的手段，也没有关于该装置的形状的限制。以这种方式，通过使一个endoth的形成上的ePTFE脉管移植物，血栓形成和长期通畅的腔内侧elial层可以得到改进。此外，对于外科疝目细胞粘附表面被认为导致更好的组织整合。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S.
- Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S.
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
