Abstract
Stiften Materialien Oberfläche mit zellKlebeEigenschaften ist eine gemeinsame Strategie in Biomaterial Forschung und Tissue Engineering. Dies ist besonders interessant für bereits zugelassene Polymere, die eine langjährige Verwendung in der Medizin haben, weil diese Materialien sind gut charakterisiert und rechtliche Fragen bei der Einführung im Zusammenhang von neu synthetisierten Polymere vermieden werden können. Polytetrafluorethylen (PTFE) ist eine der am häufigsten verwendeten Materialien für die Herstellung von Gefäßprothesen, aber das Polymer fehlt Förderung Merkmale Zelladhäsion. Endothelialisierung, dh eine vollständige Abdeckung der Transplantate Innenfläche mit einer konfluenten Schicht von Endothelzellen ist der Schlüssel für eine optimale Leistung angesehen, vor allem durch Thrombogenität der künstlichen Schnittstelle reduziert wird .
Diese Studie untersucht, das Wachstum von Endothelzellen auf Peptid-modifiziertem PTFE und vergleicht diese Ergebnisse mit denen auf unmodifizierte Substrat erhalten. Kupplung mit demendotheliale Zellen-Haftungs-Peptid Arg-Glu-Asp-Val (REDV) über die Aktivierung des fluorin enthaltenden Polymers unter Verwendung des Reagenzes Natriumnaphthalenid, gefolgt durch nachfolgende Konjugation Schritten durchgeführt. Zellkulturen Zellen (HUVECs) und eine hervorragende Zellwachstum auf Peptid-immobilisierte Material unter Verwendung von humanen Umbilical Vein Endothelial erreicht wird, ein Zeitraum von zwei Wochen gezeigt über.
Introduction
Verschiedene Polymere in der Medizin eingesetzt , die seit einiger Zeit zugelassen wurden keine verbesserte Biokompatibilität aufweisen, das heißt, der Mangel an Zell-Haft, Induktion von fibrotischen Verkapselung und Thrombogenität, um nur einige zu nennen. Wechselwirkungen zwischen dem Biomaterial und dem biologischen System erfolgt hauptsächlich an der Oberfläche des Implantats. Als Folge hat sich die Forschung auf die Oberflächenmodifikation konzentriert, um geeignete Eigenschaften für eine gewünschte Anwendung zu schaffen, während die Volumeneigenschaften des Materials unbeeinflusst bleibt. Polytetrafluorethylen (PTFE) als ein physiologisch inertes Polymer wird in vielen medizinischen Gebieten, wie Hernie chirurgisches Netz 1, medizinische Anschlüsse 2 verwendet und, am wichtigsten, vaskuläre Transplantate 3.
Insbesondere in Blut in Kontakt Situationen die hydrophobe Natur von PTFE verursacht unspezifische Adsorption von Plasmabestandteilen und als Folge Thrombozytenadhäsion, oft in thromboti ergebc Ereignisse und Okklusion des Transplantats 4. Weiterhin PTFE, wie die meisten Polymere nicht unterstützt Zelladhäsion und Abdeckung , die ein wünschenswertes Merkmal 5 wäre die Bildung einer nützlichen Schicht von Endothelzellen (ECs) auf der inneren (luminale) Oberfläche des vaskulären Transplantats zu induzieren. Eine biomimetische Endothel wird erwartet , dass viele der Funktionen seiner natürlichen Äquivalent zu erfüllen, vor allem seine antithrombogenen Eigenschaften 6. Eine allgemeine biomimetischen Modifikationsstrategie basiert auf dem Konzept der ausschließlich das Material mit Zellhaftfähigkeit verleihen, während die Eigenschaften Materialien bulk verlassen unberührt. Zusätzlich kann Thrombozytenadhäsion durch Einarbeiten antiadhäsive (anti-fouling) Attribute 7 reduziert werden. Verschiedene Peptide - meist aus Proteinen der extrazellulären Matrix abgeleitet ist - wurden beschrieben , die stark durch die Bindung an zelluläre Rezeptoren gehört zu der Klasse von Integrinen 8 Zelladhäsion verbessern. Das Seinst bekanntes Beispiel in dieser Hinsicht ist das Peptid Arg-Gly-Asp (RGD), die mit den meisten Zelltypen interagiert. Andere Aminosäuresequenzen werden durch Integrine exprimiert ausschließlich auf spezifische Zellen erkannt. Zum Beispiel Arg-Glu-Asp-Val (REDV-) und Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR-) wurden ECs zu binden , in einer bestimmten Art und Weise 9 gefunden. Kovalente Immobilisierung solcher Peptide wurde auch von Natur aus nicht klebenden Materialien durchgeführt auf einer Vielzahl von Metallen und Polymeren 10,11.
Poröse PTFE, genauer aus expandiertem PTFE (ePTFE) - zusammen mit Polyethylenterephthalat (PET) - ist das wichtigste Material für die Herstellung von vaskulären Transplantaten 12. Etablierte physikalische Techniken für entsprechende Behandlungen, wie Plasmamodifizierung 13 oder durch photochemische Verfahren 14 werden durch die Tatsache behindert , daß poröse und / oder röhrenförmige Strukturen sind nicht leicht behandelbar in den Poren oder dem Lumen verbunden. naßchemischenauf PTFE ist eine schwierige Aufgabe aufgrund der stark inert Natur des fluorin enthaltenden Polymer , das die meisten chemischen Angriffen 15 widersteht .
In diesem Papier beschreiben wir ein vergleichsweise einfaches Verfahren für eine kovalente Modifikation Strategie. Angepasst von einem Verfahren PTFE bindungsfähig zu machen, funktionelle Gruppen wurden auf der Materialoberfläche geschaffen, die für eine weitere Konjugation von biologisch aktiven Molekülen als Ankerpunkte dienen.
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Protocol
1. Herstellung von Natriumnaphthalenid Aktivierungslösung und Oberflächenaktivierung
Hinweis: Führen Sie die Reaktionen in einem gut belüfteten Abzug durchführen. Die allgemeinen Regeln für den Umgang mit hoch brennbaren Lösungsmitteln und korrosiven Metalle wie metallisches Natrium. Naphtalin hat einen sehr unangenehmen Geruch (mothball), auch in sehr kleinen Mengen! Wenn nicht anders angegeben Reaktionen werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Natriumazid ist hochgiftig! THF (99,9%, siehe Materialliste) wurde über etwa 20% (bezogen auf das Volumen) Molekularsieb gelagert. Destillieren THF mit einem merklichen Wassergehalt über Natrium. Die Bildung von Natriumnaphthalenid tritt nicht auf, wenn Spurenmengen von Wasser vorhanden sind.
- Zu einer Lösung von 1,4 g (10,9 mmol) Naphthalin in 20 ml Tetrahydrofuran (THF, getrocknet über 3 Å Molekularsieb), Zugabe von 0,25 g (10,9 mmol) Natriummetall in einem Schraubverschluss 100 ml Glasflasche mit einem PTFE- ausgestattet beschichteten magnetischen Rührstab.
Hinweis: dissolu(- 40 ° C 35) tion kann durch Schneiden des Natrium in kleine Stücke und bescheiden Erwärmung stark verbessert werden. Die endgültige Lösung hat eine dunkle, leicht grünliche Farbe und kann unter streng trocken gelagert werden. - Punch-Out-PTFE-Scheiben von 12 mm Durchmesser von 0,5 mm dicken Folienmaterial. Markieren Sie eine Seite (zB mit einem Brief Stempel Stempel) und sauber und mit iso-Propanol.
- Inkubieren PTFE-Proben einzeln in der Aktivierungslösung (Schritt 1.1) mit 1 - 2 Minuten mit einer Pinzette. Hinweis: Der Farbumschlag von weiß bis dunkelbraun erfolgreiche Behandlung zeigt.
- Anschließend spülen zweimal mit THF und dann mit Isopropanol.
Hinweis: Die Naphthalenid ist erschöpft, wenn seine Farbe ändert sich zu einem wässrig hellbraun. Nicht verwendete Naphthalenid Lösung (möglicherweise metallisches Natrium enthält) muss durch langsam zerlegt werden, indem Isopropanol vor der Entsorgung. - Oxidieren behandelten Proben in Wasserstoffperoxid (30%) 20% (w / v) Trichloressigsäure für 3 Stunden. Waschenmit Wasser und trocken. Die Oberfläche hat jetzt eine leichte bräunliche Aussehen. Hinweis: Die Aktivierung und Oxidation führt zu einer drastisch erhöhten Benetzbarkeit der Oberfläche. Diese Feststellung wurde im Detail zuvor 14 untersucht.
- Behandeln Sie oxidierte Scheiben mit 50% (v / v) Hexamethylendiisocyanat (HMDI) in trockenem THF 2 h gründlich mit THF und trocknen lassen.
- Hydrolysieren Isocyanat Lagerproben in Wasser für 2 - 3 Stunden und trocken. Anmerkung: Die endgültige aminofunktionalisierte PTFE-Oberfläche als die Isocyanat-tragenden Proben wesentlich stabiler ist und ist kompatibel mit vielen Standard-Vernetzer für die weitere Kupplung.
2. Peptide Immobilisation
- Eine Lösung aus 20% (v / v) Diethylenglycol-diglycidylether (Diepoxid) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9.
- Legen Sie die aminierte Scheiben mit der markierten Seite nach oben einzeln in eine 24-Well-Platte und fügen Sie 1,5 ml der Epoxid-Lösung. Achten Sie darauf, eine vollständige Abdeckung der Proben. Inkubieren für 2 Stunden und waschen zweimals mit Wasser und einmal mit Carbonatpuffer.
- Zugabe von 50 ul einer 0,5 mg / ml Peptid (zB REDV) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9 , enthaltend 0,01% NaN 3, auf den Boden der einzelnen Vertiefungen einer frischen 24 - Well - Platte und legen sorgfältig die epoxy-funktionalisierten Scheiben upside -down (dh markierte Seite nach unten) auf den Abfall der Peptidlösung. Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen dem Boden des Bohrlochs und der PTFE Scheibe Kapillarwirkung aufgrund vollständig benetzt wird.
- Inkubieren in einer feuchten Kammer (zB jede verschließbaren Plastikkasten mit einem dicht schließendem Deckel) mit befeuchteten Atmosphäre (durch nasse Seidenpapier auf dem Boden platzieren) für mindestens 3 Stunden oder über Nacht.
Hinweis: Wenn auch das REDV- Motiv als gut charakterisiert, kann ein Rühr- oder Reverse Aminosäuresequenz angesehen werden kann als zusätzliche Negativkontrolle einbezogen werden. - Waschen dreimal mit Wasser und Sterilisieren in 50% iso-Propanol / Wasser für mindestens 30 min. Vor der Aussaat zu Zelle, rinse die Proben in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
3. Zell Seeding
- Wachsen HUVECs unter Verwendung von Standardzellkulturverfahren 17,18.
- Legen Sie die Peptid-konjugierten Proben mit der modifizierten Seite nach oben in einer 24-Well-Platten. Verwenden Sie unbehandelten PTFE-Discs als Kontrolle.
- Seed 5 x 10 4 HUVECs in 2 ml Medium pro Vertiefung und Inkubation für 4 h bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem Inkubator.
- Entfernen Sie die Scheiben gründlich sorgfältig ungebunden Zellen zu entfernen und in ein frisches 24-Well-Platte. 2 ml frisches Medium und Inkubation für den gewünschten Zeitraum (zB 24 Stunden, 1 w, etc.). Ändern Sie das Medium alle zwei Tage.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mg / ml Calcein-AM in Dimethylsulfoxid (DMSO).
- Nach dem Züchten der Zellen des Mediums, Waschen mit PBS entfernen und PBS , das 1 & mgr; l / ml Calcein-AM - Färbung (beispielsweise 1 & mgr; l einer Stammlösung pro ml PBS) hinzuzufügen. Vorsichtig geschwenkt und INCUBATe bei 37 ° C für 45 min im Dunkeln.
- Waschen mit PBS und sofort nehmen mikroskopische Aufnahmen auf einem Fluoreszenzmikroskop mit Standard-FITC-Filter ausgestattet (Ex 488 nm, Em 515 nm). Verwenden Sie das 100-fache Vergrößerung. Führen Sie Triplikaten von unmodifizierten sowie behandelten Proben.
- Mit ImageJ Software bestimmen den Bereich von den Zellen besiedelt. zählen Alternativ können die Zellen manuell oder ImageJ verwenden. Beide Verfahren geben ähnliche Informationen über die Anhaftung und das Wachstum von Zellen auf den jeweiligen Oberflächen.
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Representative Results
Die Ergebnisse der entscheidenden chemischen Reaktionsschritte wurden durch IR - Spektroskopie (Figur 1) überwacht. Die anfängliche Aktivierung mit Natriumnaphthalenid erzeugt Doppelbindungen - und in geringerem Umfang - OH-Funktionalitäten. Das Signal, das anzeigt C = C-Bindungen verschwinden bei der Oxidation, eine Oberfläche ergibt sich fast ausschließlich Hydroxyl-Gruppen tragen. Analyse weiterer Standard Konjugation Schritte sind hier nicht dargestellt. Die Farbe ändert sich aufgrund der Aktivierung und Oxidation sind in Übereinstimmung mit dem erwarteten Chemie, der verwendet wird: konjugierte Doppelbindungssysteme sind zu erwarten sein bräunlich und seinen Verlust Ergebnisse in Aufhellung (Abbildung 2). Darüber hinaus wurde das mögliche Ergebnis der Aktivierung und Oxidation auf der Oberflächenmorphologie durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Praktisch keine nachteilige Wirkung der Behandlung wurde beobachtet (Abbildung 2).
Figuren 3 und 4 zeigen die Ergebnisse der REDV-Immobilisierung auf endotheliale Zellwachstum. Während praktisch keine Zelladhäsion und Proliferation auf unbehandeltem Material tritt unterstützt die Änderung stark Besiedlung über einen Zeitraum von zwei Wochen. Exemplifiziert für eine klinische Anwendung (dh Gefäßtransplantaten) wurde die Modifikation identisch auf Originalmaterial aus einem handelsüblichen Transplantats ausgeführt aus expandiertem PTFE mit ähnlichen Ergebnissen über einen Zeitraum von einer Woche (Abbildung 5).
Abbildung 1. IR - Spektroskopie von PTFE. Die Behandlung von unberührten PTFE (A) führt zur Bildung von Doppelbindungen und bis zu einem gewissen Ausmaß von Hydroxyfunktionen (B). Anschließend C = C - Bindungen aufgrund reduziert werden auf die Oxidation (C Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. optische Erscheinungsbild von nackten und oberflächenaktivierte PTFE. (A) Die unbehandelten PTFE (links) erscheint weiß, die Aktivierung Natriumnaphthalenid Verwendung ergibt eine dunkelbraune Farbe (Mitte) , die leicht bei der Oxidation aufgehellt wird (rechts). Unbehandelte (B) und oxidierten PTFE (C) Proben wurden zusätzlich mittels Rasterelektronenmikroskopie untersucht (Vergrößerung: 2,000X). Discs sind 12 mm im Durchmesser. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die endotheliale Zellkultur auf unberührten und Peptid-modifiziertem PTFE. Unbehandelte Proben nicht durch ECs kolonisiert (A, C, E nach 24 Stunden, 1 w und 2 w jeweils) , während die Haftung und das Wachstum auf Peptid-modifizierten Materials stark verbessert (B, D und F nach 24 Stunden, 1 w und 2 w beziehungsweise). Maßstabsbalken:. 100 & mgr; m, Vergrößerung 100X Bitte klicken Sie hier eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Quantifizierung der Zellenabdeckung durch ImageJ Analyse. Zellwachstum auf blankem PTFE (A, C,E) und auf REDV-konjugierten Polymeroberflächen (B, D, F) , ausgedrückt als prozentuale Bedeckung der Gesamtfläche. Immobilisierte Peptid ermöglicht deutlich Anfangshaftung (B) und unterstützt die Besiedlung über einen Zeitraum von 2 Wochen (D, F). Dreifachbestimmungen, Mittelwert ± Standardabweichung). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Endothelial - Zellen für 1 Woche auf expandiertem PTFE gezüchtet. Die Struktur des ePTFE gezeigt Rasterelektronenmikroskopie unter Verwendung von (A). Die Ergebnisse auf poröses Material erhalten werden, sind in Übereinstimmung mit den für Flach PTFE Probe erhalten. Im Gegensatz zu den wenigen Zellenauf blankem Material (B) die modifizierte Oberfläche (C) stellt ein ausgezeichnetes Substrat für das Zellwachstum. Maßstabsbalken sind 100 & mgr; m für A, B und C sind. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 6 Schematische Darstellung der chemischen Modifizierung von PTFE unter Verwendung von Nasschemie. Doppelbindungen , die durch Na-Naphthalenid Behandlung oxidiert werden, was zu OH-Funktionalitäten. Ein Hydroxyl-reaktives Diisocyanat wird dann mit einem Amin immobilisiert und hydrolysiert. Schließlich wird das bifunktionelle Diepoxid wird angewendet , um das REDV- Peptid mit dem N-terminalen Aminogruppe. Konjugieren Bitte klicken Sie hier , um vIEW eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die detaillierte Beschreibung der Oberflächenmodifikationsprotokoll PTFE besteht aus aufeinanderfolgenden Stufen unter Abspaltung von Fluor aus dem Polymergerüst in 6 als dargestellt zu starten. Als Ergebnis wird eine Schicht gebildet, die eine reichliche Menge an konjugierten Kohlenstoff-Kohlenstoff - Doppelbindungen enthält , in gemäß der dunkelbraune Farbe, die auf Naphthalenid Behandlung entwickelt. Standard Oxidation mit sauren Wasserstoffperoxid ergibt eine hydroxylierte Oberfläche durch Aufhellung zu einer blaßbraunen begleitet, dies den Verlust von Doppelbindungen widerspiegelt. Dieser Vorgang wird eindeutig durch IR-Spektroskopie nachgewiesen.
Um eine allgemein gültige Funktionalität, die anhängenden OH-Gruppen wurden in Amino-Funktionalitäten umgewandelt durch einfache Behandlung mit einem Diisocyanat und anschließende Hydrolyse der NCO-Resten zu primären Aminen zu erreichen. Dies ist günstig, weil aminhaltige Material kann über einen längeren Zeitraum, während die hig gelagert werdenhly reaktive Isocyanat ist auf die Anwesenheit von Luftfeuchtigkeit anfällig.
Vorsicht ist bei der Vermeidung ergriffen werden sogar Mengen an Wasser in der anfänglichen Aktivierungsschritt verfolgen und die HMDI Behandlung, weil sowohl Natriumnaphthalenid und das Isocyanat sind gegen Hydrolyse sehr anfällig. Im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren, bei denen die Probe vollständig in die Lösung eingetaucht wird, erfordert das vorliegende Protokoll nur geringe Mengen des Reagenzes. Deshalb spart dieses Verfahren eine Menge des teuren Peptid.
Amin-Lagerflächen sind ideale Ausgangspunkte für die Kopplung von vielen Biomolekülen. Das Diepoxid in dieser Arbeit verwendet wird, ist interessant, in mehrfacher Hinsicht: Es ist vergleichsweise billig, hydrophilen, hoch reaktiv gegenüber Aminen und nicht umgesetztem Epoxide werden in einer wässrigen Umgebung in die "physiologisch inert" Diole hydrolysiert. Homobifunktionelle Vernetzer sind geeignete Reagenzien, wo nur eine reaktive Gruppe vorhanden on das Peptid immobilisiert werden. Dies gilt für REDV nur eine einzige primäre Amino-Gruppe am N-Terminus enthält (dies ist die gleiche für die häufig verwendeten Sequenz RGDS). Für Peptide, die Lysinreste (mit Seitenkette Amine) das Ergebnis der Konjugation ist mehrdeutig, was bedeutet, dass eine ordnungsgemäße Kupplung nicht in definierter Weise auftritt. In diesem Fall wird eine Strategie heterobifunktionelle Vernetzer (beispielsweise Amin- und Thiol-reaktiv) und Cystein (N- oder C-terminal) enthaltenden Peptiden ist hilfreich 18.
Die Ergebnisse der Peptid Immobilisierung in Bezug auf Zellhaftung ist unzweideutig (3 und 4). Während praktisch keine Zellen auf blanken PTFE haften, macht REDV--Modifikation das Material eine ausgezeichnete zelladhäsive Substrat. Ergänzend zu dem obigen Protokoll Vorarbeiten zeigen erwähnt , dass diese Technik auf porösen (erweitert) PTFE mit ähnlichen Ergebnissen auch anwendbar ist (Abbildung 5 13, Plasmapolymerisation 19) machen, bietet dieses Protokoll eine Richtlinie für die kovalente Modifikation von PTFE durch leicht erhältliche Chemikalien und Laborverfahren verwendet wird und durch hochentwickelte Geräte zu vermeiden. Plasma Methodologien wie reaktives Plasma (O 2, NH 3, etc.) und Plasma - Polymerisation sind nicht anwendbar im porösen Konstrukte oder Schläuche , da reaktive Spezies (zB Reste) sind nicht in der Lage , diese Strukturen aufgrund der Inaktivierung bei Kontakt mit den Materialien zu durchdringen Oberfläche. Zum Beispiel kleinkalibrigen Gefäßtransplantaten (Durchmesser <5 mm) können nicht auf diese Weise behandelt werden. Im Gegensatz dazu, mittels Nasschemie, gibt es keine Beschränkung hinsichtlich der Form der Vorrichtung. Auf diese Weise ist es durch die Bildung eines endoth ermöglichtElial Schicht auf der luminalen Seite eines ePTFE Gefßtransplantats, Thrombogenität und Langzeitdurchgängigkeit verbessert werden. Außerdem wird eine Zellhaftfläche für chirurgische Herniennetze soll in bessere Gewebeintegration zu resultieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
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