Abstract
Doter matériaux de surface avec des propriétés de cellules-adhésif est une stratégie commune dans la recherche biomatériau et l'ingénierie tissulaire. Ceci est particulièrement intéressant pour les polymères déjà approuvés qui ont une utilisation de longue date en médecine parce que ces matériaux sont bien caractérisées et les questions juridiques liées à l'introduction de polymères nouvellement synthétisés peuvent être évités. Polytétrafluoroéthylène (PTFE) est l'un des matériaux les plus fréquemment employés pour la fabrication de greffes vasculaires, mais le polymère manque d'adhérence cellulaire favorisant fonctions. Endothélialisation, soit une couverture complète de la greffe de surface interne avec une couche confluente de cellules endothéliales est considérée clé pour une performance optimale, notamment en réduisant la thrombogénicité de l'interface artificielle.
Cette étude porte sur la croissance des cellules endothéliales de PTFE peptidique modifié et compare ces résultats à ceux obtenus sur un substrat non modifié. Couplage avec leendothélial peptide adhésif de cellule Arg-Glu-Asp-Val (REDV) est réalisée via l'activation du polymère contenant fluorin utilisant le réactif naphtalénure de sodium, suivie par des étapes ultérieures de conjugaison. La culture cellulaire est réalisée en utilisant des cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC) et une excellente croissance cellulaire sur la matière peptidique immobilisé est démontrée sur une période de deux semaines.
Introduction
Divers polymères utilisés en médecine qui ont été approuvés pour un certain temps ne présentent pas la biocompatibilité améliorée, à savoir, le manque de cellules-adhésivité, l' induction de l' encapsulation fibrotique et thrombogénicité, pour ne citer que quelques - uns. Les interactions entre le biomatériau et le système biologique a lieu principalement à la surface de l'implant. En conséquence, les recherches ont porté sur la modification de surface afin de créer des propriétés appropriées pour une application désirée, tout en laissant les propriétés de la matière en vrac non affecté. Polytétrafluoroéthylène (PTFE) en tant que polymère physiologiquement inerte est utilisé dans de nombreux domaines médicaux tels que hernie treillis chirurgical 1, ports médicaux 2 et, surtout, des greffes vasculaires 3.
Notamment en cas de contact avec le sang de la nature hydrophobe de PTFE provoque une adsorption non spécifique des composants du plasma, et en conséquence l'adhérence des plaquettes, ce qui entraîne souvent thrombotic événements et de l' occlusion du greffon 4. En outre, le PTFE, comme la plupart des polymères, ne supporte pas l' adhésion cellulaire et la couverture qui serait une caractéristique souhaitable d'induire la formation d'une couche bénéfique des cellules endothéliales (EC) sur le (luminale) surface interne du greffon vasculaire 5. Un endothélium biomimétique devrait remplir plusieurs des fonctions de son équivalent naturel, notamment ses propriétés antithrombotiques 6. Une stratégie générale de modification biomimétique est basée sur le concept de doter le matériau exclusivement avec des cellules adhésivité tout en laissant les propriétés des matériaux en vrac non affecté. En outre, l' adhésion des plaquettes peut être réduite en incorporant l' anti-adhésif (anti-fouling) attribue 7. - Divers peptides principalement dérivés de protéines de la matrice extracellulaire - ont été décrits qui améliorent fortement l' adhésion cellulaire en se liant à des récepteurs cellulaires, appartenant à la classe des intégrines 8. L'êtrest exemple connu à cet égard est le peptide Arg-Gly-Asp (RGD) qui interagit avec la plupart des types de cellules. D'autres séquences d'acides aminés sont reconnus par les intégrines exclusivement exprimés sur des cellules spécifiques. Par exemple, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) et Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) ont été trouvés à se lier à CEs d'une manière spécifique 9. L' immobilisation covalente de ces peptides a été effectuée sur une grande variété de matériaux intrinsèquement non adhésives , y compris les métaux et les polymères 10,11.
PTFE poreux, plus précisément en PTFE expansé (ePTFE) - ainsi que le polyéthylène téréphtalate (PET) - est le matériau le plus important pour la production de greffes vasculaires 12. Techniques physiques établies pour les traitements appropriés, tels que la modification de plasma 13 ou par des méthodes photochimiques 14, sont entravés par le fait que les structures poreuses et / ou tubulaires ne sont pas faciles à traiter à l' intérieur des pores ou la lumière respectivement. La chimie humidele PTFE est une tâche difficile en raison de la nature hautement inerte du polymère contenant fluorin qui résiste à la plupart des attaques chimiques 15.
Dans cet article, nous décrivons une méthode relativement facile pour une stratégie de modification covalente. Adapté d'une procédure pour rendre le PTFE liable, les groupes fonctionnels ont été créés à la surface des matériaux qui servent de points d'ancrage pour la conjugaison en outre des molécules biologiquement actives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Préparation de sodium naphtalénure Activation Solution et activation de surface
Remarque: Effectuer des réactions dans une hotte bien ventilée. Suivez les règles générales pour la manipulation des solvants très inflammables et les métaux corrosifs comme le sodium métallique. Le naphtalène a une odeur très désagréable (de naphtaline), même en très petites quantités! Sauf indication contraire les réactions sont effectuées à température ambiante. L'azoture de sodium est très toxique! THF (99,9%, voir la liste des matériaux) a été stocké sur environ 20% (en volume) tamis moléculaire. Distiller THF avec une teneur notable en eau sur sodium. La formation de naphtalénure de sodium ne se produit pas si des traces d'eau sont présentes.
- A une solution de 1,4 g (10,9 mmol) de naphtalène dans 20 ml de tétrahydrofuranne (THF, séché sur tamis moléculaire 3 Å), ajouter 0,25 g (10,9 mmol) de sodium métallique dans un flacon de 100 ml en verre à bouchon à vis équipé d'un PTFE- revêtu barreau d'agitation magnétique.
Note: Dissolution peut être grandement améliorée en coupant le sodium en petits morceaux et le chauffage modeste (35 - 40 ° C). La solution finale a une couleur légèrement verdâtre foncé et peut être stocké dans des conditions strictement sèches. - Poinçonner des disques en PTFE d'un diamètre de 12 mm à partir de matériau en feuille d'épaisseur 0,5 mm. Mark un côté (par exemple, en utilisant une lettre tampon poinçon) et nettoyer avec de l' isopropanol.
- Incuber PTFE échantillons individuellement dans la solution d'activation (étape 1.1) pendant 1 - 2 min à l'aide de forceps. Remarque: Le changement de couleur du blanc au brun foncé indique la réussite du traitement.
- Ensuite rincer deux fois avec du THF, puis avec de l'isopropanol.
Remarque: La solution de naphtalénure est épuisé lorsque sa couleur change pour un brun clair aqueux. solution naphtalénure Inutilisé (éventuellement contenant du sodium métallique) doit être décomposé en ajoutant lentement l'isopropanol avant élimination. - Oxyder les échantillons traités au peroxyde d'hydrogène (30%) contenant 20% (p / v) d'acide trichloroacétique pendant 3 h. lavageavec de l'eau et sèche. La surface a maintenant une légère apparence brunâtre. Remarque: L'activation et le résultat de l'oxydation dans une mouillabilité accrue de façon drastique la surface. Cette constatation a été examinée en détail précédemment 14.
- Traiter les disques oxydées avec 50% (v / v) hexaméthylènediisocyanate (HMDI) dans du THF sec pendant 2 heures, rincer avec du THF et laisser sécher.
- Hydrolyser échantillons porteurs isocyanate dans l'eau pendant 2 - 3 h et sec. Remarque: La surface finale amino fonctionnalisée PTFE est beaucoup plus stable que les échantillons d'isocyanates porteurs et est compatible avec de nombreux agents de réticulation standard pour couplage supplémentaire.
2. Peptide Immobilisation
- Préparer une solution de 20% (v / v) d'éther diglycidylique de diéthylène (diépoxyde) dans 50 mM de tampon carbonate, pH 9.
- Placez les disques aminées avec le côté marqué individuellement dans une plaque 24 puits et ajouter 1,5 ml de la solution d'époxyde. Assurer une couverture complète des échantillons. Incuber pendant 2 heures et laver deuxfois avec de l'eau et une fois avec du tampon de carbonate.
- Ajouter 50 ul d'une solution à 0,5 mg / ml de peptide (par exemple, REDV) dans 50 mM de tampon carbonate, pH 9 , contenant 0,01% de NaN3, au fond des puits individuels d'une plaque à puits fraîche 24 et placer délicatement le disque à l' envers époxyfonctionnalisé -down ( par exemple, marquée vers le bas) sur la goutte de la solution de peptide. Assurez-vous que l'espace entre le fond du puits et le disque en PTFE est complètement mouillée en raison de l'action capillaire.
- Incuber dans une chambre humide (par exemple, toute boîte en plastique refermable avec un couvercle de fermeture étanche) avec atmosphère humidifiée (en plaçant du papier de soie humide sur le fond) pendant au moins 3 heures ou toute la nuit.
Note: Quoique le motif REDV peut être considéré comme bien caractérisé, d'une séquence d'acides aminés brouillés ou inverse peut être inclus comme témoin négatif supplémentaire. - Laver trois fois avec de l'eau et stériliser dans 50% d'isopropanol / eau pendant au moins 30 min. Avant cellule ensemencement, rinse les échantillons dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
3. Cellule Semis
- Cultivez HUVEC en utilisant des procédures de culture de cellules standards 17,18.
- Placer les échantillons peptidiques conjugués avec la partie modifiée dans un 24 puits. Utilisez des disques de PTFE non traités comme témoin.
- Semences 5 x 10 4 cellules HUVEC dans 2 ml de milieu par puits et incuber pendant 4 heures à 37 ° C et 5% de CO2 dans un incubateur.
- Retirez les disques, rincer soigneusement pour éliminer les cellules seules et transférer dans une assiette bien fraîche 24. Ajouter 2 ml de milieu frais et on incube pendant la durée souhaitée (par exemple 24 h, w 1, etc.). Changer le milieu tous les deux jours.
- Préparer une solution mère de 1 mg / ml de calcéine-AM dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Après la croissance des cellules supprimer le milieu, laver avec du PBS et ajouter PBS contenant 1 pl / ml de calcéine-AM tache (par exemple, 1 pi d'une solution mère par ml PBS). agiter et Incubat doucemente à 37 ° C pendant 45 min dans l'obscurité.
- Laver avec du PBS et prendre immédiatement micrographies sur un microscope à fluorescence équipé de filtres FITC standards (Ex 488 nm, Em 515 nm). Utilisez grossissement de 100 fois. Effectuer triplicats de non modifiée ainsi que des échantillons traités.
- En utilisant le logiciel ImageJ déterminer la zone colonisée par les cellules. Vous pouvez également compter les cellules manuellement ou utiliser ImageJ. Les deux méthodes donnent des informations similaires au sujet de la fixation et la croissance des cellules sur les surfaces respectives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les résultats des étapes cruciales de réaction chimique ont été contrôlées par spectroscopie infrarouge (Figure 1). L'activation initiale avec naphtalénure de sodium génère des doubles liaisons - et, dans une moindre mesure - OH fonctionnalités. Le signal indiquant liaisons C = C disparaissent lors de l'oxydation, ce qui donne une surface portant presque exclusivement groupes hydroxyle. Analyse des autres étapes de conjugaison standards ne sont pas représentés ici. Les changements de couleur dus à l' activation et à l' oxydation sont en accord avec la chimie attendue qui est utilisée: systèmes conjugués de liaison doubles devraient être et ses résultats de perte brunâtre éclaircissant (Figure 2). En outre, les résultats possibles de l'activation et de l'oxydation sur la morphologie de surface a été étudié par microscopie électronique à balayage. Pratiquement aucun effet néfaste du traitement a été observée (figure 2).
figures 3 et 4 montrent les résultats de REDV-immobilisation sur la croissance des cellules endothéliales. Alors que pratiquement aucune adhérence et la prolifération cellulaire se produit sur un matériau non traité la modification soutient fortement la colonisation sur une période de deux semaines. Exemplifié pour une application clinique (c. -à- greffes vasculaires), la modification a été effectuée de manière identique sur le matériau d' origine à partir d' un greffon disponible dans le commerce en PTFE expansé avec des résultats similaires sur une période d'une semaine (figure 5).
La figure 1. La spectroscopie IR de PTFE. Le traitement du PTFE vierge (A) conduit à la formation de doubles liaisons et , dans une certaine mesure , des fonctions hydroxyle (B). Par la suite C = liaisons C sont réduites en raison de l'oxydation (C S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Aspect optique de PTFE activé nu et la surface. (A) considérant que PTFE non traité ( à gauche) apparaît en blanc, l'activation en utilisant naphtalénure de sodium donne une couleur brun foncé (au milieu) qui est légèrement éclairci lors de l' oxydation ( à droite). Sans traitement (B) et oxydé en PTFE (C) , les échantillons ont été en outre étudiées en utilisant un microscope électronique à balayage (grossissement: 2,000X). Les disques sont de 12 mm de diamètre. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. endothéliale culture cellulaire de PTFE vierge et le peptide modifié. Échantillons non traités ne sont pas colonisés par CEs (A, C, E , après 24 heures, 1 m et 2 m , respectivement) , tandis que l' adhérence et la croissance sur la matière peptidique modifié est grandement améliorée (B, D et F après 24 h, 1 w et 2 w respectivement). Barre d' échelle:. 100 um, grossissement 100X S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 4. Quantification de la couverture cellulaire par analyse ImageJ. La croissance cellulaire de PTFE nu (A, C,E) et sur des surfaces de polymère RedV conjugué (B, D, F) exprimés en pourcentage de couverture de la superficie totale. Peptide immobilisé permet clairement d' adhérence initiale (B) et soutient la colonisation sur une période de 2 semaines (D, F). Déterminations en triple, moyenne ± écart - type). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Les cellules endotheliales cultivées pendant 1 semaine en PTFE expansé. La structure de PTFEe est affiché en utilisant la microscopie électronique à balayage (A). Les résultats obtenus sur le matériau poreux sont conformes à ceux obtenus pour l'échantillon de PTFE plat. Par contraste avec les quelques cellules trouvéessur un matériau nu (B) la surface modifiée (C) fournit un excellent substrat pour la croissance cellulaire. Les barres d'échelle sont 100 um pour A, B et C respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Représentation schématique de la modification chimique du PTFE par chimie humide. Les doubles liaisons générées par le traitement de Na naphtalénure sont oxydées traduit par OH fonctionnalités. Un diisocyanate hydroxyle réactif est alors immobilisé et hydrolyse en une amine. Enfin , le diépoxyde bifonctionnel est appliqué à conjuguer le peptide REDV en utilisant le groupe amino N-terminal. S'il vous plaît , cliquez ici pour vIEW une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La description détaillée du protocole de modification de la surface du PTFE se compose d'étapes successives en commençant par l'élimination du fluor à partir du squelette polymère tel que représenté sur la figure 6. Par conséquent, une couche est formée qui contient une quantité abondante de carbone-carbone conjuguées doubles liaisons conformément à la couleur brun foncé qui se sont développées lors du traitement naphtalénure. oxydation standard avec acide peroxyde d'hydrogène donne une surface hydroxylée accompagnée d'éclaircissement à un brun pâle, ce qui reflète la perte de doubles liaisons. Ce procédé est clairement mise en évidence par spectroscopie infrarouge.
Afin de parvenir à une fonctionnalité plus généralement le cas, les suspensions des groupes OH ont été convertis en acides fonctionnalités par simple traitement avec un diisocyanate et l'hydrolyse subséquente des groupes NCO aux groupements amines primaires. Ceci est favorable, parce que le matériel aminé porteur peut être stocké pendant des périodes prolongées, tandis que la highly isocyanate réactif est sensible à la présence de l'humidité de l'air.
Il faut prendre garde à éviter de même des traces d'eau dans l'étape d'activation initiale et le traitement HMDI parce que les deux naphtalénure de sodium et de l'isocyanate sont très sensibles à l'hydrolyse. Contrairement aux procédures standard dans lequel l'échantillon est complètement immergé dans la solution, le présent protocole nécessite que de petites quantités de réactif. Par conséquent, cette méthode permet d'économiser beaucoup de peptide coûteux.
les surfaces portantes amine sont des points de départ idéaux pour le couplage de plusieurs biomolécules. Le diépoxyde utilisé dans ce travail est intéressant à plusieurs égards: il est relativement pas cher, hydrophile, très réactif vis-amines et les époxydes non réagi sont hydrolysées dans un environnement aqueux en diols "physiologiquement inertes". réticulants homobifonctionnels sont des réactifs appropriés où un seul groupe réactif est présent on peptide à être immobilisé. Ceci vaut pour le REDV ne contenant qu'un seul groupe amino primaire unique sur l'extrémité N-terminale (ce qui est la même pour la séquence RGDS fréquemment utilisés). Pour les peptides contenant des résidus de lysine (avec des amines de chaîne latérale), le résultat de la conjugaison est ambiguë, ce qui signifie que le couplage correct ne se produit pas d'une manière définie. Dans ce cas, une stratégie utilisant des agents de reticulation hétérobifonctionnels (par exemple des amines et des thiols réactifs) des peptides et de la cystéine (N- ou C-terminales) contenant 18 est utile.
Les résultats de l'immobilisation du peptide sur le plan de l' adhérence cellulaire est sans ambiguïté (figures 3 et 4). Alors que pratiquement pas de cellules adhèrent sur PTFE nue, REDV-modification rend le matériau un substrat cellulaire-adhésif excellent. En complément du protocole mentionné ci - dessus montrent des travaux préliminaires que cette technique est également applicable sur poreux (élargi) PTFE avec des résultats similaires (Figure 5 13, polymérisation par plasma 19), ce protocole fournit une ligne directrice pour la modification covalente de PTFE en utilisant des produits chimiques facilement disponibles et les procédures de laboratoire et en évitant des équipements très sophistiqués. Méthodologies de plasma tels que le plasma réactif (O 2, NH 3, etc.) et la polymérisation par plasma ne sont pas applicables dans les constructions poreuses ou des tubes , car les espèces réactives (par exemple, les radicaux) ne sont pas capables de pénétrer dans ces structures en raison de l' inactivation lors du contact avec les matières surface. Par exemple des greffes vasculaires de petit calibre (diamètre <5 mm) ne peuvent pas être traités de cette façon. Contrairement à cela, au moyen de la chimie par voie humide, il n'y a aucune restriction quant à la forme du dispositif. De cette manière, en permettant la formation d'un endothcouche Elial sur le côté luminal d'une greffe vasculaire ePTFE, thrombogénicité et à long terme la perméabilité peut être améliorée. En outre, une surface adhésive de cellule pour des mailles chirurgicales hernie est censé se traduire par une meilleure intégration tissulaire.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S.
- Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S.
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
