Abstract
Förse material yta med cellvidhäftningsegenskaper är en gemensam strategi i biomaterialforskning och tissue engineering. Detta är särskilt intressant för redan godkända polymerer som har en mångårig användning inom medicinen, eftersom dessa material är väl karakteriserade och juridiska frågor i samband med införandet av nya syntetiserade polymerer kan undvikas. Polytetrafluoretylen (PTFE) är en av de mest användes material för tillverkning av kärlimplantat, men polymeren saknar cellvidhäftningsbefrämjande egenskaper. Endotelisering, det vill säga, är fullständig täckning av transplantaten inre yta med ett sammanflytande skikt av endotelceller anses nyckeln till optimal prestanda, framför allt genom att minska trombogenicitet av den konstgjorda gränssnitt.
Denna studie undersöker tillväxten av endotelceller på peptid-modifierad PTFE och jämför dessa resultat som de som uppnås på omodifierade substrat. Koppling med denendotelceller lim peptiden Arg-Glu-Asp-Val (REDV) sker via aktivering av fluorin polymer med hjälp av reagens natriumnaftalenid, följt av efterföljande konjugation steg. Cellodling sker med hjälp av Human navelvenendotelceller (HUVEC) och utmärkt celltillväxt på peptid-immobiliserade materialet visas under en tvåveckorsperiod.
Introduction
Olika polymerer som används i läkemedel som har godkänts för en tid inte uppvisa förbättrad biokompatibilitet, dvs brist på cellvidhäftningsförmåga, induktion av fibrotisk inkapsling och trombogenicitet, för att nämna några. Interaktioner mellan biomaterialet och det biologiska systemet sker huvudsakligen vid ytan av implantatet. Som en konsekvens, har forskningen fokuserat på ytmodifiering för att skapa lämpliga egenskaper för en önskad tillämpning samtidigt som de berörda bulkegenskaperna hos materialet påverkas inte. Polytetrafluoretylen (PTFE) som en fysiologiskt inert polymer används i många medicinska områden såsom bråck kirurgiskt nät 1, medicinska portar 2 och, viktigast av allt, vaskulära transplantat 3.
Särskilt i situationer blod kontakt med hydrofoba natur PTFE orsakar ospecifik adsorption av plasmakomponenter och som en vidhäftnings följd trombocyter, vilket ofta resulterar i thrombotic händelser och ocklusion av transplantatet 4. Dessutom PTFE, liksom de flesta polymerer, stöder inte cellulär adhesion och täckning, vilket skulle vara en önskvärd egenskap för att inducera bildandet av en gynnsam skikt av endotelceller (ECS) på den inre (luminala) ytan av den vaskulära transplantatet 5. En biomimetiska endotel förväntas uppfylla många av funktionerna hos sin naturliga motsvarighet, särskilt dess antitrombogena egenskaper 6. En allmän modifiering strategi biomimetiska är baserat på konceptet med uteslutande förse materialet med cellvidhäftningsförmåga samtidigt som de berörda materialen bulkegenskapema opåverkade. Dessutom kan blodplättsadhesion minskas genom att införliva anti-adhesiv (anti-fouling) attribut 7. Olika peptider - mestadels härrör från proteiner av den extracellulära matrisen - har beskrivits som starkt förbättrar cell adhesion genom att binda till cellulära receptorer, som tillhör klassen av integriner 8. det ärst kända exemplet i detta avseende är peptiden Arg-Gly-Asp (RGD) som samverkar med de flesta celltyper. Andra aminosyrasekvenser erkänns av integriner uteslutande uttryckta på specifika celler. Till exempel, har Arg-Glu-Asp-Val (REDV) och Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR) visat sig binda till EC på ett specifikt sätt 9. Kovalent immobilisering av sådana peptider har utförts på en uppsjö av sin natur icke-adhesiva material, inklusive metaller och polymerer 10,11.
Porös PTFE, närmare bestämt expanderad PTFE (ePTFE) - tillsammans med polyetentereftalat (PET) - är det viktigaste materialet för tillverkning av vaskulära transplantat 12. Etablerade fysiska tekniker för lämplig behandling, såsom plasma ändring 13 eller genom fotokemisk metoder 14, försvåras av det faktum att porösa och / eller rörformiga strukturer är inte lätt behandlingsbar inne i porerna eller lumen respektive. våtkemipå PTFE är en svår uppgift på grund av den mycket inerta naturen av fluorin-innehållande polymer som motstår de flesta kemiska attacker 15.
I denna uppsats beskriver vi en jämförelsevis enkel metod för en kovalent modifiering strategi. Anpassat från ett förfarande för att göra PTFE-bindbar, var funktionella grupper skapas på material yta som tjänar som förankringspunkter för ytterligare konjugering av biologiskt aktiva molekyler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av natriumnaftalenid aktiverande lösning och ytaktivering
Obs: Genomför reaktioner i ett väl ventilerat dragskåp. Följ allmänna regler för hantering av brandfarliga lösningsmedel och frätande metaller som metalliskt natrium. Naftalen har en mycket obehaglig lukt (mothball), även i mycket små mängder! Om ej annat anges reaktioner utförs vid rumstemperatur. Natriumazid är mycket giftigt! THF (99,9%, se lista över material) förvarades under ungefär 20% (volym) molekylsikt. Destillera THF med en märkbar vattenhalt över natrium. Bildandet av natriumnaftalenid uppstår inte om spårmängder av vatten är närvarande.
- Till en lösning av 1,4 g (10,9 mmol) naftalen i 20 ml tetrahydrofuran (THF, torkades över 3 Å molekylsikt), tillsätt 0,25 g (10,9 mmol) natriummetall i en skruvkork 100 ml glasflaska utrustad med en PTFE belagd magnetisk omrörarstav.
Notera: Dissolution kan förbättras avsevärt genom att skära natrium i små bitar och blygsam värme (35-40 ° C). Den slutliga lösningen har en mörk, svagt grönaktig färg och kan lagras under strikt torra förhållanden. - Stansa ut PTFE skivor av 12 mm diameter från 0,5 mm tjock foliematerial. Markera en sida (t.ex. med hjälp av ett brev stämpel punch) och ren med isopropanol.
- Inkubera PTFE-prover individuellt i aktiveringslösningen (steg 1,1) för 1-2 min med hjälp av pincett. Obs: färgändring från vitt till mörkbrun indikerar framgångsrik behandling.
- Därefter skölj två gånger med THF och därefter med iso-propanol.
Obs! Naphthalenide lösning är slut när dess färg ändras till en vattnig ljusbrun. Oanvänd naphthalenide lösning (eventuellt innehållande metalliskt natrium) måste sönderdelas genom att långsamt tillsätta iso-propanol innan de bortskaffas. - Oxidera behandlade prover i väteperoxid (30%) innehållande 20% (vikt / volym) triklorättiksyra under 3 timmar. Tvättamed vatten och torka. Ytan har nu en liten aktig färg. Obs: Aktivering och oxidering resulterar i en drastisk ökning vätbarhet av ytan. Denna upptäckt undersöktes i detalj tidigare 14.
- Behandla oxiderade skivor med 50% (v / v) hexametylendiisocyanat (HMDI) i torr THF under 2 timmar, skölj med THF och låt torka.
- Hydrolysera isocyanat lager prov i vatten 2 - 3 timmar och torr. Obs: Den slutliga amino-funktionaliserad PTFE yta är mycket mer stabila än de isocyanat bärande prover och är kompatibel med många standard tvärbindare för ytterligare koppling.
2. Peptid Immobilisering
- Bered en lösning av 20% (volym / volym) dietylenglykol-diglycidyleter (diepoxiden) i 50 mM karbonatbuffert, pH 9.
- Placera de aminerade skivor med den markerade sidan upp individuellt i en platta med 24 brunnar och tillsätt 1,5 ml av epoxiden lösning. Säkerställa full täckning av proverna. Inkubera under 2 timmar och tvätta tvågånger med vatten och en gång med karbonatbuffert.
- Tillsätt 50 | il av en 0,5 mg / ml peptid (t.ex., REDV) i 50 mM karbonatbuffert, pH 9, innehållande 0,01% NaN3, till botten av individuella brunnar i en ny 24-brunnsplatta och försiktigt placera epoxi-funktionaliserade skivor upside vridna (dvs märkt sidan nedåt) på droppe av peptidlösningen. Se till att utrymmet mellan botten av brunnen och PTFE skivan är fullständigt vätt på grund av kapillärverkan.
- Inkubera i en fuktig kammare (t.ex. någon förseglingsplastlåda med en tät stängning lock) med fuktad atmosfär (genom att placera våt mjukpapper på undersidan) under minst tre timmar eller över natten.
Obs: Om än den REDV motivet kan betraktas som väldefinierad, en förvrängd eller omvänd aminosyrasekvens kan ingå som en ytterligare negativ kontroll. - Tvätta tre gånger med vatten och sterilisera i 50% iso-propanol / vatten i minst 30 min. Före cellsådd, Rinse proverna i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
3. Cell Seeding
- Väx HUVEC med hjälp av standardcellodlingsförfaranden 17,18.
- Placera de peptid konjugerade prover med den modifierade sidan uppåt i en 24-brunnsplattor. Använd obehandlade PTFE-skivor som en kontroll.
- Frö 5 x 10 4 HUVEC i två ml medium per brunn och inkubera under 4 h vid 37 ° C och 5% CO2 i en inkubator.
- Ta bort skivor, skölj noggrant för att avlägsna obundna celler och överför till en ny platta med 24 brunnar. Tillsätt 2 ml färskt medium och inkubera under den önskade perioden (t.ex., 24 tim, 1 w osv). Ändra mediet varannan dag.
- Bered en stamlösning av 1 mg / ml kalcein-AM i dimetylsulfoxid (DMSO).
- Efter odling av cellerna avlägsna mediet, tvätta med PBS och tillsätt PBS innehållande 1 pl / ml Calcein-AM färgämne (t.ex., 1 | j, l av en stamlösning per ml PBS). Försiktigt agitera och incubate vid 37 ° C under 45 minuter i mörker.
- Tvätta med PBS och omedelbart ta mikrofotografier på ett fluorescensmikroskop utrustad med standard FITC filter (Ex 488 nm, Em 515 nm). Använd 100 gångers förstoring. Utför tre exemplar från omodifierad samt behandlade prover.
- Använda ImageJ programvara bestämma området koloniserades av cellerna. Alternativt räkna cellerna manuellt eller använda ImageJ. Båda metoderna kommer att ge liknande information om vidhäftning och tillväxt av celler på de respektive ytorna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten av de avgörande kemiska reaktionssteg övervakades genom IR-spektroskopi (fig 1). Den första aktiveringen med natriumnaftalenid genererar dubbelbindningar - och i mindre utsträckning - OH-funktionaliteter. Signalen som indikerar C = C-bindningar försvinner vid oxidation, vilket ger en yta som bär nästan uteslutande hydroxylgrupper. Analys av ytterligare standard konjugeringstekniker steg visas inte här. De färgförändringar på grund av aktivering och oxidation är i överensstämmelse med den förväntade kemi som används: konjugerade dubbelbindningssystem förväntas bli brunaktig och dess resultat förlust i ljusnande (Figur 2). Dessutom var det möjliga resultatet av aktivering och oxidation på ytan morfologi undersöktes med hjälp av svepelektronmikroskopi. Praktiskt taget ingen skadlig effekt av behandlingen observerades (figur 2).
Figurerna 3 och 4 visar resultatet av REDV-immobilisering på endotelial celltillväxt. Medan praktiskt taget ingen celladhesion och proliferation sker på obehandlat material ändringen stöder starkt kolonisering under en två veckors period. Exemplifierats för en klinisk tillämpning (dvs kärltransplantat), var modifieringen identiskt utförs på originalmaterial från en kommersiellt tillgänglig graft gjord av expanderad PTFE med en liknande resultat under en period av en vecka (Figur 5).
Figur 1. IR-spektroskopi av PTFE. Behandling av orörda PTFE (A) resulterar i bildning av dubbelbindningar och i viss mån av hydroxifunktioner (B). Därefter C = C-bindningar reduceras på grund av oxidation (C Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Optisk utseende nakna och yta aktiverad PTFE. (A) medan obehandlade PTFE (vänster) visas vit, aktivering med hjälp av natriumnaftalenid ger en mörk brunaktig färg (mitten) som är något ljusare vid oxidation (höger). Obehandlade (B) och oxiderade PTFE (C) prover dessutom undersöktes med hjälp av svepelektronmikroskop (förstoring: 2,000X). Skivor är 12 mm i diameter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Endothelial cellodling på orörda och peptid-modifierad PTFE. Obehandlade prover inte koloniseras av EC (A, C, E efter 24 tim, 1 w och 2 w respektive) medan vidhäftning och tillväxt på peptid-modifierat material har ökat avsevärt (B, D och F efter 24 timmar, en vikt och två w respektive). Skala bar:. 100 um, förstoring 100X Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kvantifiering av celltäckning genom ImageJ analys. Cellulär tillväxt på ren PTFE (A, C,E) och om REDV-konjugerad polymerytor (B, D, F), uttryckt som procentuella täckningen av totala ytan. Immobiliserade peptiden möjliggör tydligt initial vidhäftning (B) och stöder kolonisering över en 2-veckors period (D, F). Tredubbla bestäm, medelvärde ± standardavvikelse). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Endotelceller odlas för en vecka på expanderad PTFE. Strukturen av ePTFE är visad med användning av svepelektronmikroskopi (A). De erhållna resultaten på poröst material är förenliga med de som erhölls för platta PTFE prov. I motsats till de få celler som hittaspå bart material (B) den modifierade ytan (C) ger en utmärkt substrat för celltillväxt. Skala barer är 100 pm för A, B och C respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Schematisk bild av kemisk modifiering av PTFE med hjälp av våt-kemi. Dubbelbindningar som genereras av Na-naphthalenide behandling oxideras vilket resulterar i OH-funktioner. En hydroxyl-reaktiv diisocyanat immobiliseras sedan och hydrolyseras till en amin. Slutligen bifunktionella diepoxiden appliceras konjugera REDV peptid med N-terminal aminogrupp. Klicka här för att visa b en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den detaljerade beskrivningen av ytmodifiering protokoll av PTFE består av på varandra följande steg som börjar med eliminering av fluor från polymerhuvudkedjan såsom visas i fig 6. Som ett resultat, är ett skikt bildat som innehåller en riklig mängd konjugerade kol-kol-dubbelbindningar i enlighet med den mörka brunaktig färg som utvecklades vid naphthalenide behandling. Standard oxidation med sura väteperoxid ger en hydroxylerad yta åtföljs genom att lysa med en blekbrun, återspeglar detta förlust av dubbelbindningar. Denna process bevisas klart genom IR-spektroskopi.
I syfte att uppnå en mer allmängiltig funktionalitet, var de vidhängande OH-grupper omvandlas till amino-funktionaliteter genom enkel behandling med ett diisocyanat och efterföljande hydrolys av NCO-grupper till primära aminer. Detta är gynnsamt, eftersom aminbärande material kan lagras under långa tidsperioder, medan den highly reaktivt isocyanat är känslig för mycket närvaro av luftfuktighet.
Man måste vara försiktig i att undvika även spårmängder av vatten i den initiala aktiveringssteget och HMDI behandling eftersom både natriumnaftalenid och isocyanatet är mycket mottagliga för hydrolys. I motsats till standardförfaranden i vilken provet är helt nedsänkt i lösningen, nödvändiggör det nuvarande protokollet endast små mängder av reagensen. Därför är denna metod sparar mycket den kostsamma peptiden.
Aminlagerytorna är idealiska utgångspunkter för koppling av många biomolekyler. Diepoxiden användes i detta arbete är intressant i flera avseenden: det är förhållandevis billig, hydrofila, mycket reaktiva mot aminer och icke-reagerade epoxider hydrolyseras i en vattenbaserad miljö i "fysiologiskt inerta" dioler. Homobifunktionella tvärbindningsmedel är lämpliga reagens där endast en reaktiv grupp före on peptiden som skall immobiliseras. Detta gäller för REDV innehåller endast en enda primär amino-grupp på N-terminal (detta är densamma för de ofta använda sekvens RGDS). För peptider innehållande lysinrester (med sidokedje-aminer) resultatet av konjugering är tvetydig, vilket innebär att en korrekt koppling inte förekommer i ett definierat sätt. I detta fall, är en strategi med användning av heterobifunktionella tvärbindare (t.ex. amin- och tiol-reaktivt) och cystein (N- eller C-terminala) innehållande peptider till hjälp 18.
Resultaten av peptid immobilisering i termer av cellvidhäftning är entydiga (figurerna 3 och 4). Medan praktiskt taget inga celler fästa på bar PTFE, gör REDV-modifiering materialet en utmärkt cell självhäftande substrat. Som komplement till den ovan nämnda protokoll förarbete visar att denna teknik är också tillämplig på porös (utvidgad) PTFE med liknande resultat (Figur 5 13, plasmapolymerisation 19), ger detta protokoll en riktlinje för kovalent modifiering av PTFE genom att använda lätt tillgängliga kemikalier och laboratorieförfarandena och genom att undvika mycket sofistikerad utrustning. Plasma metoder såsom reaktiv plasma (O2, NH3, etc.) och plasmapolymerisation inte är tillämpliga inom porösa konstruktioner eller slangar eftersom reaktiva ämnen (t.ex. radikaler) inte kan tränga dessa strukturer på grund av inaktivering vid kontakt med materialen yta. Till exempel liten kaliber kärltransplantat (diameter <5 mm) inte kan behandlas på detta sätt. I motsats till detta, med hjälp av våt kemi, det finns ingen begränsning när det gäller formen på enheten. På detta sätt, genom att möjliggöra bildningen av en endothelial skikt på den luminala sidan av en ePTFE vaskulärt transplantat, trombogenicitet och långtidsöppenheten kan förbättras. Dessutom är en cell vidhäftande yta för kirurgiska hernia maskor ska leda till bättre integration vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE foil 0.5 mm | Cadillac Plastic | n/a | |
| REDV peptide | Genecust | n/a | custom synthesis >95% purity |
| iso-propanol | Sigma Aldrich | 34965 | |
| tetrahydrofurane (THF) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| dimethylsulfoxide | Sigma Aldrich | D8418 | |
| molecular sieve 3 Å | Sigma Aldrich | 208574 | |
| sodium metal | Sigma Aldrich | 483745 | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| naphthalene | Sigma Aldrich | 147141 | |
| hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 95321 | |
| trichloroacetic acid | Sigma Aldrich | T6399 | |
| diethylene glycol diglycidyl ether | Sigma Aldrich | 17741 | |
| hexamethylene diisocyanate (HMDI) | Sigma Aldrich | 52650 | |
| Calcein-AM | Sigma Aldrich | 56496 | |
| sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
| 24 well plates | Greiner-Bio-One | 662 160 | |
| ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850 | Nicolet | n/a | |
| fluorescence microscope Olympus X-70 | Olympus | n/a | |
| humbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | n/a | |
| ePTFE vascular graft | Gore | n/a |
References
- Doctor, H. G. Evaluation of various prosthetic materials and newer meshes for hernia repairs. J. Minim. Access Surg. 2, 110-116 (2006).
- Zaghal, A., et al. Update on totally implantable venous access devices. Surg. Oncol. 21, 207-215 (2012).
- Niu, G., Sapoznik, E., Soker, S.
- Wang, M. -J., Tsai, W. -B. Biomaterials in Blood-Contacting Devices: Complications and Solutions. , Nova Science Publishers. 1 ed (2010).
- de Mel, A., Jell, G., Stevens, M. M., Seifalian, A. M. Biofunctionalization of biomaterials for accelerated in situ endothelialization: a review. Biomacromolecules. 9, 2969-2979 (2008).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part I: state of the art. J. Biomat. Appl. 10, 309-329 (1996).
- Cleary, M. A., et al. Vascular tissue engineering: the next generation. Trends Mol. Med. 18, 394-404 (2012).
- Ruoslahti, E. RGD and other recognition sequences for integrins. Annu. Rev. Dev. Bi. 12, 697-715 (1996).
- Lei, Y., Remy, M., Labrugere, C., Durrieu, M. C. Peptide immobilization on polyethylene terephthalate surfaces to study specific endothelial cell adhesion, spreading and migration. J. Mat. Sci. Mater. M. 23, 2761-2772 (2012).
- Gabriel, M., et al. Covalent RGD Modification of the Inner Pore Surface of Polycaprolactone Scaffolds. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 23, 941-953 (2012).
- Ceylan, H., Tekinay, A. B., Guler, M. O. Selective adhesion and growth of vascular endothelial cells on bioactive peptide nanofiber functionalized stainless steel surface. Biomaterials. 32, 8797-8805 (2011).
- Chlupac, J., Filova, E., Bacakova, L. Blood vessel replacement: 50 years of development and tissue engineering paradigms in vascular surgery. Physiol. Res. / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 58, Suppl 2 119-139 (2009).
- Wise, S. G., Waterhouse, A., Kondyurin, A., Bilek, M. M., Weiss, A. S.
- Mikulikova, R., et al. Cell microarrays on photochemically modified polytetrafluoroethylene. Biomaterials. 26, 5572-5580 (2005).
- Gabriel, M., Dahm, M., Vahl, C. F. Wet-chemical approach for the cell-adhesive modification of polytetrafluoroethylene. Biomed. Mater. 6, 035007 (2011).
- Gabriel, M., van Nieuw Amerongen, G. P., Van Hinsbergh, V. W., Amerongen, A. V., Zentner, A. Direct grafting of RGD-motif-containing peptide on the surface of polycaprolactone films. J. Biomat. Sci.. Polym. E. 17, 567-577 (2006).
- Larsen, C. C., Kligman, F., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. The effect of RGD fluorosurfactant polymer modification of ePTFE on endothelial cell adhesion, growth, and function. Biomaterials. 27, 4846-4855 (2006).
- Gabriel, M., Nazmi, K., Veerman, E. C., Nieuw Amerongen, A. V., Zentner, A. Preparation of LL-37-grafted titanium surfaces with bactericidal activity. Bioconjugate Chem. 17, 548-550 (2006).
- Lotz, A., Heller, M., Brieger, J., Gabriel, M., Förch, R. Derivatization of Plasma Polymerized Thin Films and Attachment of Biomolecules to Influence HUVEC-Cell Adhesion. Plasma Process Polym. 9, 10-16 (2012).
