Summary
Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.
Introduction
Die Entwicklung von verzweigten epithelialen Geweben, als Verzweiger Morphogenese bekannt ist, wird von Zellen abgeleiteten, physikalischen und Umweltfaktoren reguliert wird. In der Brustdrüse, Morphogenese Verzweigung ist ein iterativer Prozess, durch den geführten kollektive Zellmigration eine baumartige Architektur schafft. Der erste Schritt ist die primäre Knospenbildung aus den Milchgängen, gefolgt von Zweig Initiierung und Dehnung 1,2. Invasion der Filialen in das umgebende Stroma wird durch die systemische Freisetzung von Steroidhormonen in der Pubertät induziert. Neue primäre Knospen initiieren dann von den Enden der bestehenden Filialen, und dieser Prozess wird fortgesetzt 3 eine epitheliale Baum zu erstellen. Obwohl viele wichtige biochemische Signale identifiziert wurden, ein umfassendes Verständnis der zellbiologischen Mechanismen, die diese komplexen Entwicklungsprozess führen derzeit fehlt. Darüber hinaus sind mechanistische Studien über die Einflüsse der spezifischen Signale nur schwer von Erfah zu dekonstruierenrungen in vivo sind so präzise Raum - Zeit - Störungen und Messungen oft nicht möglich.
Dreidimensionale (3D) Kulturtechniken, wie beispielsweise Vollorgankultur, primäre Organoiden und Zellkulturmodellen, sind nützliche Werkzeuge für die systematische Untersuchung der Mechanismen , darunter liegende Gewebe - Morphogenese 4-6. Dies kann besonders nützlich sein für die Bestimmung der Einflüsse von spezifischen Faktoren einzeln, wie mechanische Kräfte und biochemische Signale auf einer Vielzahl von Zellverhalten, einschließlich der Migration, Proliferation und Differenzierung. 6 Engineered Zellkulturmodellen, insbesondere leicht die Störung ermöglichen von einzelnen Zellen und deren Mikroumgebung.
Eine solche Kulturmodell verwendet einen Mikro-basierten Ansatz Modell mammaepithelialen Gewebe zu konstruieren mit 3D-Struktur gesteuert, die konsistent und reproduzierbar Zweige bilden, die gemeinsam wandern, wenn sie mit dem eine induzierteppropriate Wachstumsfaktoren. Der große Vorteil des Modells ist die Fähigkeit, genau zu manipulieren und die Auswirkungen der physikalischen und biochemischen Faktoren, wie beispielsweise Muster der mechanischen Beanspruchung mit hoher statistischer Sicherheit messen. Diese Technik, die zusammen mit Computermodellierung, wurde bereits verwendet 7-11 die relativen Beiträge der physikalischen und biochemischen Signale in der Leitung von der normalen Entwicklung der Brust-Epithelgewebe und anderen verzweigten Epithelien zu bestimmen. Dargestellt ist hier ein detailliertes Protokoll für diese Modellgewebe Gebäude, das leicht auf andere Arten von Zellen und extrazellulären Matrix erweitert werden kann (ECM) Gele, und die dazu dient, als mögliches Instrument für die Prüfung von Therapeutika.
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Protocol
1. Herstellung der Lösungen
- Zur Herstellung einer 5 mg / ml - Lösung von Insulin, verdünnen das pulverisierte Insulin Lager mit 5 mM Salzsäure (HCl) in dH 2 O (500 mg Insulin in 100 ml Lösungsmittel). Herstellung von 100 ml Lösungsmittel durch 50 & mgr; l konzentrierter HCl Zugabe zu 100 ml destilliertem Wasser (dH 2 O).
- Um eine 1x PBS - Lösung machen, verdünnen das 10x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Stammlösung mit dH 2 O unter sterilen Bedingungen auf 1x.
- Bereiten Sie das Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomerlösung wie folgt: mischen Sie das PDMS-Präpolymer zusammen mit dem Härter in einem 10: 1 (w: w) Verhältnis.
- Bereiten Sie die Zellkulturmedium wie folgt: zu 500 ml Lager Dulbecco modifiziertem Eagle Medium: Nährsalzgemisch F-12 (DMEM / F-12), 10 ml sterilem fötalen Rinderserum (FBS), 500 ul Gentamicin Reagens und 500 & mgr; l von 5 mg / ml Insulin.
- Um die 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS-Lösung zuzubereiten, 1% (w: V) Lösung Pulver von BSA PBS auf 1x und gründlich mischen.
- Um eine 4 mg / ml-Lösung von neutralisiert Rinder-Typ vorbereiten I-Kollagen, fügen Sie 50 ul 10x Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) Puffer, 30 ul 0,1 N Natriumhydroxid (NaOH), 30 & mgr; l Zellkulturmedium und 400 ul Lager Kollagen zu einem gekühlten Mikrozentrifugen-Röhrchen von 1,5 ml. Mischen Sie langsam durch Pipettieren nach oben und unten; vermeiden Blasen einzuführen. Um alle Blasen zu entfernen, kurz die Mischung bei 4 ° C zentrifugiert werden.
- Bereiten Sie eine Fixierungslösung um 16% Paraformaldehyd Verdünnung 1: 4 (v: v) in 1x PBS.
- Bereiten Sie eine Kerne Markierungslösung durch den Bestand Kerne Markierungslösung verdünnt 1: 1000 (v: v) in 1x PBS.
- Vorbereiten eines 0,3% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und Detergens (PBST) Lösung, die durch Mischen von 1x PBS mit 0,3% (v: v) Waschmittel.
- Bereiten Blocking-Puffer durch Verdünnen Ziegenserum 01.10 (v: v) in 0,3% PBST.
- Bereiten eines primären Antikörperlösung für ein bestimmtes Protein von Interesse durch Verdünnen priMary Antikörper (beispielsweise Kaninchen-anti-focal adhesion kinase (FAK)) 1: 200 (v: v) in Blocking-Puffer.
- Vorbereiten eines sekundären Antikörperlösung durch eine fluoreszierende Sonde konjugierte Antikörper verdünnt (beispielsweise Ziegen-anti-Kaninchen) 1: 1000 (v: v) in Blocking-Puffer.
2. Herstellung von Elastomer-Briefmarken für 3D-Mikrostrukturierung
Hinweis: Elastomeres Stempel werden mit PDMS hergestellt.
- Machen Sie eine PDMS-Lösung im gleichen Verhältnis wie 1.3 in Schritt beschrieben und gründlich mischen. Platzieren der Mischung in einer Vakuumkammer für 15-30 min alle Luftblasen zu entfernen, die während des Mischprozesses eingebracht wurden.
- Gießen Sie die entgaste Lösung in eine Plastik wiegen Boot oder eine Petrischale mit einem Silizium-Master enthält, die lithographisch mit Eigenschaften der gewünschten Geometrie strukturiert wird. Für die besten Ergebnisse, heilen die PDMS-Lösung bei 60 ° C für ca. 12 Stunden.
Hinweis: Die Silizium-Meister hochgradig anpassbar sind; Dieses Protokoll verwendet rechteckige Strukturen mit Abmessungen von 50& mgr; m × 200 & mgr; m × 50 & mgr; m Abstand 200 & mgr; m voneinander entfernt. Die Silizium-Master können unter Verwendung von Standard-Photolithographietechniken hergestellt werden. Kurz gesagt wird ein auf Epoxybasis Photoresist auf einem Siliciumwafer spinbeschichtet. Eine Maske, die gewünschten Stempel Funktionen Detaillierung ist auf der Oberseite des Photoresist beschichteten Wafer angeordnet, die dann mit UV-Licht ausgesetzt wird. Die gewünschten Eigenschaften, die nicht von der Maske blockiert werden dem Licht ausgesetzt und der Photoresist an diesen Stellen wird vernetzt, während der Rest der Photoresistschicht löslich ist, und kann weggespült werden. - Nachdem das PDMS um die gewünschten Funktionen auf dem Silizium-Master ausgehärtet ist, entfernen Sie die PDMS und Master aus dem Plastikbehälter. Trennen Sie sorgfältig die PDMS aus dem Siliziumwafer und den Überschuss entfernen PDMS aus um die geprägten Merkmale einer sauberen Rasierklinge.
- Schneiden Sie nun die PDMS gemustert mit aufgedrucktem Funktionen in einzelne rechteckigen Stempel (~ 8 mm x 5 mm) mit einer Rasierklinge. Bewahren Sie diese Funktion Seite nach oben in einem cleein 100-mm-Durchmesser Petrischale.
- Darüber hinaus verwenden die PDMS-Lösung 1.3 in Schritt beschriebenen Träger für die rechteckigen Stempel zu machen.
- Verwendung einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung, verteilt ~ 2-3 g des PDMS-Lösung gleichmäßig auf einer 100-mm-Durchmesser-Petrischale und härten die PDMS für ~ 12 Stunden bei 60 ° C, wie in Schritt 2.1. Dann mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die dünne Schicht aus PDMS in Rechtecke (~ 5 mm x 2 mm).
Hinweis: Zwei Stützen für jeden PDMS-Stempel in 2.3 Schritt gemacht benötigt werden. Die Träger können in der 100-mm-Durchmesser-Petrischale aufbewahrt werden, die die PDMS-Stempel enthält. - Bevor die PDMS-Stempel und Träger können für die Zellkultur verwendet werden, Sterilisieren durch Eintauchen in 70% Ethanol und trocken unter Verwendung eines Aspirator in einer biologischen Sicherheit Schrank (Zellkulturhaube).
3. Herstellung von 3D-Epithelgewebe
- In einem Biosicherheitsschrank, fügen Sie oben auf jeder Stempel einen Rückgang von etwa 50 & mgr; l von 1% BSA in PBS. Legen Sie die Tröpfchen bei 4 ° C bedeckt Briefmarken für einen Minimum von 4 h, um sicherzustellen, dass das BSA an die Oberfläche des Stempels adsorbiert.
- Absaugen BSA-Lösung aus den PDMS-Stempel.
- Waschen der Oberflächen der zwei Mal mit Zellkulturmedium Tempel (50 & mgr; l pro Wasch pro Stempel sollte ausreichend sein) und nach jeder Wasch Absaugen.
- Behandeln Sie die sterilisierten PDMS-Stempel und Träger mit gebogenen Pinzette aus rostfreiem Stahl. In einem Biosicherheitsschrank, legen Sie ein 35-mm-Durchmesser-Gewebekulturschale für jeden Stempel PDMS. In jedem Gericht, legte sich zwei PDMS unterstützt durch einen Abstand, der etwas kleiner als die Länge der Stempel PDMS getrennt.
- Mit Hilfe der Pinzette, sterilisieren, so viele kreisförmige Glasplättchen (15 mm Durchmesser, # 1), da PDMS-Stempel unter Verwendung von 70% igem Ethanol sind. Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus den Deckgläsern, während sie mit der Pinzette zu halten. Bewahren Sie die gewaschenen Deckgläser in einem separaten 100-mm-Durchmesser Petrischale.
- Dispense ~ 50 & mgr; l der Kollagenmischung zu gleichmäßig zu beschichten die Oberfläche jedes PDMS-Stempel.
- Abholenjeweils mit Kollagen beschichteten PDMS-Stempel mit der Pinzette und invertieren sie sanft. Senken die invertierten Stempel auf der Oberseite des PDMS unterstützt gelegt in 35-mm-Durchmesser-Gewebekulturklöpper, so dass das Kollagen zwischen dem Stempel und dem Boden der Gewebekulturschale ist. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C für 30 min.
- Dispense ~ 50 & mgr; l der verbleibenden Kollagenmischung auf jede der kreisförmigen Deckgläser (später, werden diese auf der Oberseite der engineered Gewebe platziert werden, um sie vollständig in Kollagen einkapseln) und inkubieren bei 37 ° C für 30 min.
- Besorgen Sie sich einen 100-mm-Durchmesser-Gewebekulturschale mit Epithelzellen (ex. EpH4 Maus Brustepithelzellen) bei ~ 40% Konfluenz. Absaugen Zellkulturmedium und wäscht einmal mit 10 ml 1x PBS. 2 ml Trypsin zu den Zellen und inkubiere bei 37 ° C für 5-10 min.
- 8 ml frisches Kulturmedium auf die Gewebekulturschale mit Trypsin behandelt Zellen enthält, löst alle verbleibenden adhärenten Zellen von der Schale. Vorsichtig mischen durch Pipettieren und bewegen Sie das Zellgemisch in ein 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 100 × g für 5 min.
- Absaugen Überstand aus dem konischen Rohr und Resuspendieren des Zellpellets in Zellkulturmedium. unter Verwendung eines Hämozytometers zählen die Zellen die Konzentration der Suspension zu bestimmen. Stellen Sie das Suspensionsvolumen um eine Endkonzentration von ~ 10 6 bis 10 7 Zellen / ml zu erhalten.
- Entfernen Sie die gelierte Kollagenproben aus dem Inkubator. Mit der Pinzette, heben Sie vorsichtig die PDMS-Stempel gerade nach oben, sie aus dem geformten Kollagen zu lösen und sie zu verwerfen.
- Dispense ~ 30 & mgr; l der konzentrierten Zellsuspension auf die Oberfläche jedes Kollagengel Formhohlräume der gewünschten Geometrie enthält. Beachten Sie die Zellen unter einem Hellfeldmikroskop mit einem Objektiv 10x / 0,25 NA , während sanft die Gerichte Seite Schütteln zur Seite Zelle zu fördern innerhalb der Hohlräume nieder. Die Hohlräume sollten innerhalb von ca. 5 min gefüllt werden.
- Um reMove die Hohlräume überschüssige Zellen aus der Umgebung, neigen jedes Schalenkultur Gewebe auf seiner Seite und sanft verzichtet ~ 400 & mgr; l Zellkulturmedium über die Oberfläche des Kollagengels. Saugen Sie die Flüssigkeit, und wiederholen Sie den Wasch 1-2 weitere Male, die Kollagen-Gelen unter dem Mikroskop in zwischen jeder Wäsche zu überprüfen.
- Nachdem die überschüssigen Zellen aus um die Zelle gefüllten Hohlräume in der Kollagenform gelöscht wurden, legen die Gewebekulturschalen in einer Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 min. Dann mit der Pinzette vorsichtig umdrehen, die mit Kollagen beschichteten Klasse Deck und legen Sie sie auf der Oberseite der Zelle gefüllten Kollagen Formen, so dass das Kollagen aus den Deckgläsern bildet eine Kappe über den Zell gefüllte Hohlräume. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 15 min.
- Sobald die Kollagenkappen an die Zelle gefüllten Kollagen Form anhaften, verzichtet ~ 2-2,5 ml Zellkulturmedium langsam über das Deckglas auf der Gele. Kultur die Proben bei 37 ° C für 1-3 Tage.
Hinweis:24 h nach der anfänglichen Aussaat können die epithelialen Geweben mit Wachstumsfaktoren wie epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) behandelt Verzweigung zu induzieren.
4. Immunofluoreszenz und Bildanalyse
- Saugen Sie das Zellkulturmedium aus den Gewebekulturschalen und fügen Sie genug Fixierungslösung, die zellhaltigen Gelen zu decken. Inkubieren Sie die Gerichte bei Raumtemperatur für 15 min auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute.
- Saugen Sie das Fixiermittel, füllen Sie die Gewebekulturschalen mit 1x PBS und Inkubation für 15 min auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wäschen.
- Zur Kennzeichnung der Kerne: absaugen PBS aus der Gewebekulturschale und ersetzen mit Hoechst Lösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15-20 min. Um FAK oder einen anderen Marker Fleck, der mit Antikörper nachweisbar ist, überspringen 4,5 Schritt.
- Saugen Sie das Kernmarkierungslösung und waschen Sie die Zellen enthaltende gels dreimal mit 1x PBS, wie in Schritt 4.2. Befleckten Proben können in 1x PBS bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
- Um sich für ein Protein von Interesse Fleck: absaugen PBS aus den Gewebekulturschalen, fügen Sie 300 ul 0,3% PBST und inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 min.
- Saugen Sie das PBS, decken Sie die Gele mit Blocking-Puffer und Inkubation auf einem Schüttler (200 UpM) bei Raumtemperatur für ca. 4 Std.
- Saugen Sie den Blockierungspuffer, decken Sie die Gele mit primären Antikörperlösung und bei 200 Umdrehungen pro Minute über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler inkubiert.
- Aspirieren die primäre Antikörperlösung, Zugabe von 0,3% PBST-Lösung und Inkubieren auf einem Schüttler bei 200 rpm für 30 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie das PBST und wiederholen Sie alle 30 min für 3-4 Std.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8, diesmal mit der sekundären Antikörperlösung inkubiert. Wickeln der Gewebekulturschalen mit Aluminiumfolie gegen Ausbleichung des sekundären Antikörpers zu verhindern. Nach dem final Wäsche, Bunt Proben können in 1x PBS bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
- Um Proben zu visualisieren, verwenden Sie einen 10X / 0,30 NA - Objektiv auf der Mittelebene der epithelialen Geweben konzentriert.
- Zur Visualisierung Zellkerne, Bild fixierten Proben mit einem nuklearen Marker markiert mit einem 10x / 0,30 NA - Objektiv unter UV - Beleuchtung.
- Zur Visualisierung Proben für ein Protein von Interesse gefärbt, Bild ein 10x / 0,30 NA - Objektiv auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
- Um Frequenz Karten von Proteinfärbung von mehreren Geweben erstellen (in der Regel 50 oder mehr) von identischen Ausgangsgeometrie, erste Import jedes der Bilder Standardbildanalyse-Software (siehe Materialien) und wandeln sie in 8-Bit-Graustufen.
- Um Schwelle dieser Bilder, wandeln sie in binäre (dh Halbton / schwarz und weiß) durch ein Grau Cutoff - Punkt definieren; Grauwerte unterhalb der Schwelle schwarz werden, und diejenigen, oberhalb der Schwelle werden weiß. Dann kombinierenjedes der einzelnen binären Bilder in einer einzigen Bildstapel.
- Als nächstes registrieren die gestapelten Bilder (dh ausrichten oder sie entsprechen) in der Analyse - Software. Viele Bildanalyse-Software-Pakete sind mit einem frei verfügbaren Registrierung Plugin.
- Verwenden, um jedes Bild in einem Stapel als Vorlage für die Ausrichtung des nächsten Bildes, so dass die Bilder in dem gesamten Stapel werden durch Ausbreitung ausgerichtet sind. Schließlich Overlay (Projekt) werden die Bilder in der ausgerichteten Bildstapel auf mittlere Intensität anhand eines einzelnen Bildes mit einer Pixelfrequenz Karte zu bilden. Dieses Bild kann dann farblich gekennzeichnet sein Bildbearbeitungssoftware der Wahl 10,11 verwenden.
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Representative Results
Allgemeines Schema von mammaepithelialen Gewebe Mikro
Eine allgemeine schematische Darstellung der Mikrofabrikationsverfahren des experimentellen Arbeitsablauf umreißt in Abbildung 1 dargestellt ist. Das Ergebnis ist ein Array von Epithelgewebe identischer Geometrie und den Abstand, der in einer ECM - Gel vollständig eingebettet sind. Ein repräsentatives Experiment verwendet EpH4 Maus-Mamma-Epithelzellen kultiviert in einem Gel von bovinem Typ I bei einer Konzentration von 4 mg / ml Kollagen. Um die höchste Qualität von technischen Geweben zu gewährleisten, skizzierte die Techniken in dem Protokoll sollten genau verfolgt werden. Die Figuren 2A und 2B zeigen niedrige und hohe Vergrößerung Ansichten von Anordnungen von rechteckigen Vertiefungen , die in eine Art geformt wurden , I - Kollagen - Gel vor der Zellaussaat. Die Form der Vertiefungen ist durch die Form der Merkmale auf dem Silizium-Master bestimmt. Es ist wichtig, th zu hebene PDMS - Form vom Kollagen gerade nach oben , um nicht die Hohlraumgeometrie zu verfälschen. 2C zeigt rechteckige Vertiefungen in einer Typ - I - Gel - Kollagen , das mit Brustepithelzellen gefüllt wurden (überschüssigen Zellen wurden , um die Oberfläche des Kollagens abgewaschen). In diesem Beispiel jeweils 200 & mgr; m x 50 & mgr; m rechteckige Vertiefung enthält etwa 80-100 Zellen.
Zugabe von Wachstumsfaktoren induziert Morphogenese
24 Stunden nach der Aussaat, können die Gewebe mit Wachstumsfaktoren wie HGF oder EGF kultiviert und über mehrere Tage behandelt zu modellieren Morphogenese Verzweigung. Typischerweise Zweige schon 4 Stunden nach Wachstumsfaktor - Stimulation zu bilden beginnen. 3A zeigt repräsentative Ergebnisse aus rechteckigen Brustepithelzellen Gewebe innerhalb eines Typ - I - Gel 24 Stunden nach dem Mikrofabrikationsverfahren Kollagen, wonach cells haben an das Kollagen und miteinander verklebt. Keine Verzweigungen werden vor der Wachstumsfaktor - Zugabe beobachtet. 3B zeigt eine repräsentative Rechteckgewebe , das 24 Stunden nach der Zugabe von HGF bei 10 ng / ml unterzogen wurde Verzweigung. In diesem Fall treten Verzweigungen an den Enden der Gewebe (im Gegensatz zu der Mitte gegenüber ), wo die Zellen den höchsten mechanischen Belastungen 9 auftreten. Mehrere Gewebe identischer Ausgangsgeometrie in dem gleichen Gel kann dann abgebildet werden, um Bevölkerung Mittelwerte der Zweigstelle und Astlänge bestimmen, Hochdurchsatzanalyse zu ermöglichen.
Immunfluoreszenzanfärbung Proteinlokalisierung zu visualisieren
Immunfluoreszenzfärbung der Gewebe - Arrays im Kulturmodell ermöglicht es uns , Proteinlokalisierung innerhalb eines Gewebes mit hoher statistischer Sicherheit zu bestimmen. 4A zeigt Vertresentativen Ergebnisse aus einer Verzweigung gefärbten rechteckigen mammaepithelialen Gewebe für focal adhesion kinase (FAK). Erstellen von Frequenz Karten von Geweben von identischer Geometrie können die mittlere räumliche Lokalisierung von Proteinen von Interesse in den Geweben zu visualisieren verwendet werden, die auch als Verzweiger Aktivität zur Lokalisierung von anderen Proteinen verglichen werden können. 4B zeigt eine Frequenzkarte von durchschnittlich FAK Färbung für 50 Gewebe zeigt FAK Anreicherung an den kurzen Enden der rechteckigen Gewebe, wo in der Regel tritt Verzweigung.
Abbildung 1. Schematische umreißt die Mikrofabrikationsverfahren. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Bilder während der Mikrofabrikationsprozess genommen. (A) Low und (B) und hoher Vergrößerung Phasenkontrastbilder von rechteckigen Hohlräumen in Kollagen Typ I eine elastomere PDMS - Form erstellt wurden. (C) Cavities von (A) und (B) werden mit Brustepithelzellen gefüllt. Maßstabsbalken, 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. mikrofabrizierten Gewebe allerdings Verzweigung Morphogenese. (A) Phasenkontrastbild eines repräsentativen rechteckigen Gewebe 24 Stunden nach der Mikrofertigung . (B) Phasenkontrast - Bild eines Wiederpresentative rechteckigen Gewebe, das 24 Stunden nach der Zugabe von HGF bei 10 ng / ml unterzogen wurde gestartet Verzweigung. Weiße Pfeile zeigen neu Zweige gebildet. Maßstabsbalken, 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Immunfluoreszenzfärbung mikrofabrizierter Gewebe. (A) Immunfluoreszenzfärbung für FAK in einem mammaepithelialen Gewebe nach der Verzweigung Initiation. (B) eine Frequenzverteilung der durchschnittlichen FAK - Färbung in 50 Geweben. Maßstabsbalken, 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse aus dem NIH (HL118532, HL120142, CA187692), der David & Lucile Packard Foundation, der Camille & Henry Dreyfus-Stiftung unterstützt wird, und der Burroughs Welcome Fund. ASP wurde teilweise durch eine Charlotte Elizabeth Procter ehrende Fellowship unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
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