Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Инженерная Трехмерные эпителиальной ткани Встроенные в внеклеточной матрицы

Published: July 10, 2016 doi: 10.3791/54283
Automatic Translation
1, 1,2
1Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2Molecular Biology, Princeton University

Summary

Эта рукопись описывает мягкую технику литографии на основе спроектировать единые массивы трехмерных (3D) эпителиальные ткани определенной геометрии, окруженными внеклеточного матрикса. Этот метод поддается широкое разнообразие типов клеток и экспериментальных контекстах и ​​позволяет высокопроизводительного скрининга одинаковых повторностях.

Introduction

Развитие разветвленных эпителиальных тканей, известных как морфогенеза ветвления, регулируется клеточными происхождения, физических и экологических факторов. В молочной железе, морфогенеза ветвления представляет собой итерационный процесс, посредством которого направляется коллективная миграция клеток создает древовидную архитектуру. Первым шагом является первичное образование бутон из молочных протоков, а затем ветви инициации и удлинения 1,2. Вторжение ветвей в окружающую строму индуцируется систематическом высвобождении стероидных гормонов в период полового созревания. Новые первичные почки затем начать с концов существующих ветвей, и этот процесс продолжает создавать эпителиальный дерево 3. Хотя многие важные биохимические сигналы были идентифицированы, полное понимание клеточных биологических механизмов, которые ведут этот сложный процесс развития в настоящее время отсутствует. Кроме того, механистические исследования влияния конкретных киев трудно разобрать из эксперименты в естественных условиях, так как точные пространственно - временные возмущения и измерения часто не представляется возможным.

Трехмерные (3D) методы культивирования, такие как целые культуры органов, первичных органоидов и моделей клеточных культур, являются полезными инструментами для систематического изучения механизмов , лежащих в основе ткани морфогенеза 4-6. Они могут быть особенно полезны для определения влияния конкретных факторов по отдельности, такие , как механические силы и биохимические сигналы, на различные клеточные поведения, включая миграцию, пролиферацию и дифференцировку. 6 сконструированные модели клеточных культур, в частности, легко включить возмущение отдельных клеток и их микроокружения.

Одной из таких моделей культура использует подход на основе микротехнологий для конструирования модели молочных желез эпителиальные ткани с контролируемой 3D-структуры, которые последовательно и воспроизводимо образуют ветви, которые мигрируют в совокупности, когда индуцированное с аppropriate факторы роста. Основным преимуществом данной модели является возможность точного манипулирования и измерения воздействия физических и биохимических факторов, таких как закономерности механических напряжений, с высокой статистической достоверностью. Этот метод, вместе с компьютерного моделирования, уже используется для определения относительных вкладов физических и биохимических сигналов в руководстве нормального развития молочных эпителиальных тканей и других разветвленных эпителий 7-11. Представленные здесь подробные протокол для построения этих моделей тканей, которые могут быть легко распространены на другие типы клеток и внеклеточного матрикса (ECM), гели, и который служит в качестве потенциального инструмента для тестирования терапевтических средств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Приготовление растворов

  1. Для приготовления 5 мг / мл раствора инсулина а, разбавить порошкового инсулина запас с 5 мМ соляной кислоты (HCl) в дН 2 O (500 мг инсулина в 100 мл растворителя). Подготовьте 100 мл растворителя путем добавления 50 мкл концентрированной HCl в 100 мл дистиллированной воды (Dh 2 O).
  2. Для того, чтобы сделать 1x раствор PBS, разбавленных в 10 раз фосфатным буферным солевым раствором (PBS) маточного раствора до 1х с дН 2 O в стерильных условиях.
  3. Готовят полидиметилсилоксана (PDMS) эластомерный раствор следующим образом: смешивают форполимера PDMS вместе с отвердителем в соотношении 10: 1 (вес W).
  4. Готовят среду для культивирования клеток следующим образом: до 500 мл исходного Дульбекко в модификации Дульбекко: Питательная смесь F-12 (DMEM / F-12), добавляют 10 мл стерильной эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 500 мкл гентамицина реагента и 500 мкл 5 мг / мл инсулина.
  5. Для приготовления 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в растворе 1X PBS, добавляют 1% (мас: V) раствор БСА порошка к 1X PBS, и тщательно перемешать.
  6. Для приготовления 4 мг / мл раствора нейтрализованного бычьего типа I коллагена a, добавить 50 мкл 10х сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) буфера, 30 мкл 0,1 N раствор гидроксида натрия (NaOH), 30 мкл клеточной культуральной среды, и 400 мкл стоковой коллагена к охлажденной 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Смешайте медленно с помощью пипетки вверх и вниз; избегать введения пузырьков. Чтобы удалить пузырьки, коротко центрифугируют смесь при температуре 4 ° С.
  7. Приготовьте Фиксирующий раствор разбавлением 16% параформальдегид 1: 4 (по объему) в 1X PBS.
  8. Приготовьте раствор ядра маркировки путем разбавления в наличии ядра маркировки раствор 1: 1000 (по объему) в 1x PBS.
  9. Готовят 0,3% фосфатным буферном растворе и раствор детергента (PBST) путем смешивания 1x PBS с 0,3% (по объему) моющего средства.
  10. Подготовка блокирующего буфера путем разбавления козьей сыворотки 1:10 (по объему), в 0,3% PBST.
  11. Подготовка первичного раствора антител для конкретного интересующего белка путем разбавления ПОИмэри антитела (например, кролика против фокусного адгезионная киназа (ФСП)) 1: 200 (по объему) в блокирующем буфере.
  12. Готовят вторичный раствор антител путем разбавления флуоресцентного зонда-антитела, конъюгированного (например, козы к антителам кролика) 1: 1000 (об: об) в блокирующем буфере.

2. Получение эластомерных Марки для 3D Micropatterning

Примечание: эластомерные штампы сделаны с PDMS.

  1. Сделайте раствор PDMS при том же соотношении, как описано в пункте 1.3 и тщательно перемешать. Поместите смесь в вакуумной камере в течение 15-30 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха, которые были введены во время процесса смешивания.
  2. Налейте раствор дегазированной в пластиковую взвешивать лодку или чашку Петри, содержащую мастер кремния, который литографически узорной с особенностями желаемой геометрии. Для достижения наилучших результатов лечения решение PDMS при 60 ° С в течение ~ 12 ч.
    Примечание: Мастера кремния высоко настраиваемый; этот протокол использует прямоугольные структуры с размерами 50мкм х 200 мкм х 50 мкм на расстоянии 200 мкм друг от друга. Мастера кремния могут быть изготовлены с использованием стандартных методов фотолитографии. Вкратце, на основе эпоксидной смолы фоторезиста методом центрифугирования покрытием поверх кремниевой пластины. Маска с подробным желаемые функции штамп помещается в верхней части фоторезиста покрытием пластин, который затем подвергают воздействию УФ-излучения. Желаемые характеристики не блокированы маске подвергаются воздействию света и фоторезист в этих местах становится сшитый, в то время как остальная часть фоторезиста покрытия растворима и может быть смыта.
  3. После того, как ПДМС затвердеет вокруг желаемых функций на мастер кремния, удалите PDMS и мастер из пластикового контейнера. Аккуратно отделить PDMS от кремниевой пластины и удалить избыток PDMS со всего отпечатанные компоненты, используя чистую лезвия бритвы.
  4. Теперь отрежьте PDMS узорной с впечатывается особенностями в отдельные прямоугольные штампы (~ 8 мм х 5 мм) с лезвием бритвы. Храните эти функции стороной вверх в НКУ100 мм диаметр чашки Петри.
  5. Кроме того, используйте раствор PDMS, описанный в шаге 1.3, чтобы сделать опоры для прямоугольных штампов.
  6. С помощью устройства для нанесения покрытия спина, распространение ~ 2-3 г раствора PDMS ровным слоем на 100-мм диаметра чашки Петри и вылечить PDMS в течение ~ 12 ч при 60 ° С, как в пункте 2.1. Затем, используя лезвие бритвы, вырезать тонкий слой PDMS на прямоугольники (~ 5 мм х 2 мм).
    Примечание: Две опоры необходимы для каждого PDMS штампа сделали в шаге 2.3. Опоры могут быть сохранены в 100 мм чашки Петри диаметром, который содержит PDMS штампы.
  7. До того, как PDMS штампы и опоры могут быть использованы для культивирования клеток, стерилизуют путем погружения в 70% этанола и сухой с использованием аспиратора в шкафу биологической безопасности (капот культуре клеток).

3. Подготовка 3D эпителиальной ткани

  1. В шкафу биологической безопасности, добавить каплю приблизительно 50 мкл 1% BSA в PBS в верхней части каждого штампа. Поместите капельку покрытую марки при 4 ° С для минимама 4 ч, чтобы гарантировать, что БСА адсорбируется на поверхности штампа.
  2. Отберите БСА раствор из марок PDMS.
  3. Промыть поверхности штампов дважды с клеточной культуральной среды (50 мкл на каждую промывку за штампом должно быть достаточно), аспирацией после каждой промывки.
  4. Ручка простерилизованные PDMS штампы и опоры, используя изогнутые пинцет из нержавеющей стали. В кабинете биологической безопасности, выкладываем один 35-мм диаметра блюдо культуры ткани для каждого PDMS штамп. В каждом блюде, сложить два PDMS опор, расположенных на расстоянии чуть меньше, чем длина марок PDMS.
  5. С помощью пинцета, стерилизуют, как много круговых покровные стекла (15 мм в диаметре, # 1), поскольку есть PDMS марки с использованием 70% этанола. Аспирируйте лишнюю жидкость из покровные, держа их с помощью пинцета. Хранить промытые покровные в отдельном 100-мм диаметра чашки Петри.
  6. Разлить ~ 50 мкл смеси коллагена, чтобы равномерно покрыть поверхность каждого PDMS штампа.
  7. Подбиратькаждый коллаген покрытием PDMS штамп с пинцетом и аккуратно переверните их. Понизить инвертированные марки на верхней части опоры PDMS выложен в 35-мм диаметра тканевой культуры вогнутое таким образом, что коллаген между штампом и нижней части блюдо культуры ткани. Инкубируйте блюда при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
  8. Разливают ~ 50 мкл оставшейся коллагеновой смеси на каждую из кольцевых покровные (позже, они будут размещены в верхней части сконструированных тканей, чтобы полностью инкапсулировать их в коллаген) и инкубировать их при 37 ° С в течение 30 мин.
  9. Получают 100-мм диаметра тканевой культуры блюду, содержащей эпителиальные клетки (напр. EpH4 мышь эпителиальные клетки молочных желез) на ~ 40% сплошности. Аспирируйте среда для культивирования клеток и мыть один раз с 10 мл 1X PBS. Добавляют 2 мл трипсина к клеткам и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 5-10 мин.
  10. Добавить 8 мл свежей культуральной среды для культуры ткани Петри, содержащую клетки обрабатывали трипсином, отсоединение все оставшиеся прилипшие клетки из чашки, Осторожно перемешать с помощью пипетки и переместить клеточной смеси в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 100 & bull; g в течение 5 мин.
  11. Аспирируйте супернатант из конической трубки, и ресуспендируют осадок клеток в среде для культивирования клеток. С помощью гемоцитометра подсчитывают число клеток для определения концентрации суспензии. Отрегулируйте объем суспензии для получения конечной концентрации ~ 10 6 -10 7 клеток / мл.
  12. Удалить гелеобразных образцов коллагена из инкубатора. С помощью пинцета, осторожно поднимите PDMS штампы прямо вверх, чтобы отделить их от отформованного коллагена и отказаться от них.
  13. Разливают ~ 30 мкл концентрированной суспензии клеток на поверхность каждого коллагеновым гелем, содержащим формованные полости желаемой геометрии. Обратите внимание на клетки под микроскопом светлопольному с целью Н.А. 10X / 0.25, осторожно встряхивая гарниров в сторону , чтобы продвинуть ячейку отстаивания внутри полостей. Полости должны быть заполнены в течение ~ 5 мин.
  14. Для галить избыток клеток вокруг полости, наклон каждой ткани культуры блюдо на бок и аккуратно дозировать ~ 400 мкл среды для культивирования клеток на поверхности коллагеновый гель. Аспирируйте жидкость и повторите для стирки 1-2 раза больше, проверяя коллагеновые гели под микроскопом между каждым мытьем.
  15. После того, как избыток клетки были удалены из вокруг ячейки заполненные полости в пресс-форме коллагена, место для культуры ткани посуды в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 15 мин. Затем, с помощью пинцета, осторожно инвертируют коллаген покрытием покровные класса и поместить их на верхней части ячейки заполненные коллагеном формы таким образом, что коллаген из покровных образует колпачок на клеточных заполненных полостей. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение 15 мин.
  16. После того, как коллагеновые колпачки присоединились к клеточной заполненные коллагеном плесени, дозировать ~ 2-2,5 мл культуральной среды клеток медленно над покровным стеклом в верхней части гелей. Культура образцов при температуре 37 ° С в течение 1-3 дней.
    Заметка:24 ч после первоначального посева, эпителиальные ткани можно лечить с помощью факторов роста, таких как эпидермальный фактор роста (EGF) или фактор роста гепатоцитов (HGF), чтобы вызвать ветвление.

4. Иммунофлуоресценции и анализ изображений

  1. Аспирируйте среда для культивирования клеток из культуральных чашек ткани и добавить достаточное количество раствора для покрытия фиксаторный клеточные содержащие гели. Инкубируйте блюда при комнатной температуре в течение 15 мин на шейкере со скоростью 200 оборотов в минуту.
  2. Аспирируйте закрепитель, заполнить посуду культуры ткани с 1х PBS, и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин на качалке при 200 оборотах в минуту. Повторите два раза в течение трех полных стирок.
  3. Для маркировки ядер: аспирация PBS от блюдо культуры ткани и заменить раствором Hoechst. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15-20 мин. Для того, чтобы окрасить для ФСП или другого маркера, который может быть обнаружено с помощью антител, перейдите к шагу 4.5.
  4. Аспирируйте решение ядерной маркировки и мыть клеток, содержащих гELS три раза 1x PBS, как в шаге 4.2. Запятнанные образцы могут храниться в 1X PBS при 4 ° С до дальнейшего использования.
  5. Для того, чтобы окрасить для белка , представляющего интерес: аспирата PBS с чашек культуры ткани, добавляют 300 мкл 0,3% PBST, и инкубировать образца при комнатной температуре в течение 15 мин.
  6. Аспирируйте PBS, покрывают гели с блокирующим буфером и инкубировать на вибраторе (200 оборотов в минуту) при комнатной температуре в течение ~ 4 ч.
  7. Отберите блокирующий буфер, покрывают гели с раствором первичного антитела и инкубировать на вибраторе при 200 оборотах в минуту в течение ночи при температуре 4 ° С.
  8. Аспирируйте раствор первичного антитела, добавляют 0,3% раствор PBST, и инкубируют на качалке при 200 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение 30 мин. Аспирируйте PBST и повторять каждые 30 мин в течение 3-4 ч.
  9. Повторите шаги 4.7 и 4.8, на этот раз инкубирования с раствором вторичного антитела. Заверните посуду культуры ткани с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотообесцвечивания вторичного антитела. После FINAл мыть, окрашивали образцы могут храниться в 1X PBS при 4 ° С до дальнейшего использования.
  10. Для визуализации образцов используйте объектив 10X / 0.30 NA сосредоточены на средней плоскости эпителиальных тканей.
  11. Для визуализации клеточных ядер, изображения фиксированных образцов , меченных ядерного маркера с использованием объектива 10X / 0.30 NA под действием УФ - освещения.
  12. Чтобы визуализировать образцы окрашивали для интересующего белка, изображения с использованием объектива 10х NA / 0,30 на инвертированный флуоресцентный микроскоп.
  13. Для создания частотных карт белка окрашивания тканей нескольких (как правило, 50 или более) одинаковой начальной геометрии, первый импорт каждого из изображений с использованием стандартного программного обеспечения для анализа изображений (см Материалы) и конвертировать их в 8-битной градации серого.
  14. Для того, чтобы пороговое значение этих изображений, преобразовать их в двоичный (т.е., полутона / черно-белый), определив в оттенках серого точку среза; в оттенках серого значения ниже порогового значения становятся черными, а те, выше порога становится белым. Затем объединитькаждый из отдельных двоичных изображений в единый стек изображений.
  15. Затем регистрируют сложенных изображения (то есть, выровнять или сопоставить их) в программном обеспечении анализа. Многие пакеты программного обеспечения для анализа изображений приходят с свободно доступной регистрации плагина.
    1. Используйте каждое изображение в стеке в качестве шаблона для выравнивания следующего изображения, таким образом, что изображения во всем стеке выровнены распространением. И, наконец, наложение (проект) изображения в выровненном стека изображений на основе средней интенсивности, чтобы сформировать единое изображение с картой частоты пикселя. Это изображение может затем быть маркирован для редактирования изображений программное обеспечение выбора 10,11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Общая схема молочных желез микротехнологий эпителиальной ткани

Общая схема процедуры микроструктур с изложением экспериментальной работы потока показана на рисунке 1. Конечный результат представляет собой массив из эпителиальных тканей одинаковой геометрии и расстояния, которые полностью заложенным в геле ECM. Представитель эксперимент использует EpH4 мышиной молочной железы эпителиальные клетки, культивированные в геле бычьего типа коллагена в концентрации 4 мг / мл. Для того, чтобы обеспечить высокое качество инженерных тканей, методики , изложенные в протоколе следует внимательно. Фигуры 2А и 2В показаны виды с низким и высоким увеличением массивов прямоугольных скважин , которые были отлитых в тип коллагена гель до начала посева клеток. Форма лунках определяется формой характеристик на мастер кремния. Важно, чтобы поднять юе PDMS плесень прямо из коллагена , чтобы не деформировать геометрию полости. Рисунок 2C показывает прямоугольные скважины в типа I коллагеновый гель , которые были заполнены с эпителиальных клеток молочных желез (избыточные клетки были смывается с поверхности коллагена). В этом примере каждый 200 мкм х 50 мкм прямоугольной формы хорошо содержит приблизительно 80-100 клеток.

Добавление факторов роста индуцирует морфогенез

Через 24 часа после высева, ткани могут быть обработаны с факторами роста, такими как HGF или EGF и культивированного в течение нескольких дней, чтобы смоделировать морфогенеза ветвления. Как правило, ветви начинают формироваться еще в 4 часа после стимуляции фактора роста. На фиг.3А показаны репрезентативные результаты из прямоугольных молочных желез эпителиальные ткани типа I. коллагеновый гель через 24 часа после процедуры микроструктур, после чего челLs присоединились к коллагену и друг к другу. Нет ветви не наблюдается до того фактора роста. На фиг.3В показана репрезентативная прямоугольное ткани, подвергшийся ветвление через 24 часа после добавления HGF в концентрации 10 нг / мл. В этом случае ветви возникают на концах тканей (в отличие от середины), где клетки испытывают самую высокую механическую нагрузку 9. Множественные ткани одинаковой начальной геометрии в том же самом геле затем могут быть отображены для определения популяции средние ветви местоположения и длины ветви, что позволяет высокопроизводительного анализа.

Иммунофлуоресценции окрашивание визуализировать локализацию белка

Иммунофлуоресценции окрашивание массивов тканей в модели культуры позволяет определить локализацию белка в ткани с высокой статистической достоверности. Рисунок 4A показывает представиставитель результаты ветвящегося прямоугольной молочной эпителиальной ткани окрашивали фокальной адгезии киназы (FAK). Создание частотных карт тканей одинаковой геометрии можно использовать для визуализации средней пространственной локализации представляющих интерес белков в тканях, которые можно сравнить с локализацией других белков, а также разветвлений активностью. Рисунок 4B показывает частоту карты среднего окрашивания FAK на 50 тканей , показывающих FAK обогащение на коротких концах прямоугольных тканей, где ветвящихся обычно происходит.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема с изложением процедуры микротехнологий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2. Изображения , полученные в ходе процесса микротехнологий. (A) и низкого (В) и большим увеличением фазового контраста изображения прямоугольных полостей типа коллагена , созданные с использованием эластомерного PDMS плесень. (С) Полости из (А) и (В) заполнены эпителиальных клеток молочных желез. Шкала баров, 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. микроизготовленном ткани подвергаются морфогенеза ветвления. (А) фазового контраста изображения репрезентативного прямоугольной ткани через 24 часа после микротехнологий. (B) фазового контраста изображения переделегированияпрямоугольная ткань интуитивный, который начал испытывать ветвление через 24 ч после добавления HGF в концентрации 10 нг / мл. Белые стрелки указывают на вновь сформированные ветви. Шкала баров, 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Иммунофлуоресценции окрашивание тканей микроизготовленном. (А) Иммунофлуоресценции окрашивание ФСП в эпителиальной ткани молочной после начала ветвления. (В) Частота карта среднего окрашивания FAK в 50 тканях. Шкала баров, 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана грантами NIH (HL118532, HL120142, CA187692), Паккарда Фонда Дэвида и Люсиль, в Камиллы и Генри Дрейфуса Foundation, и Берроуза Добро пожаловать фонда. ASP была частично поддержана на Шарлотте Элизабет Procter почетная стипендий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives Sylgard 184
PDMS curing agent Ellsworth Adhesives Sylgard 184
Lithographically patterned silicon master self-made N/A
Plastic weigh boat Fisher Scientific 08-732-115
100-mm-diameter Petri dishes BioExpress D-2550-2
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200 Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O
Razor blade American Safety Razor 620179
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) Hyclone SH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150H
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14185-052
Insulin Sigma Aldrich I6634-500MG
Gentamicin Life Technologies 15750-060
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399-500
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 221465-500G
Bovine type I collagen (non-pepsinized) Koken IAC-50
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich A-7906
Curved stainless steel tweezers Dumont 7
35-mm-diameter tissue culture dishes BioExpress T-2881-6
15 ml conical tubes BioExpress C-3394-2
1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube USA Scientific 1615-5500
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter Bellco Glass Inc. Special order
0.05% 1x Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Paraformaldehyde VWR 100503-916
Triton X-100 Perkin Elmer N9300260 Detergent
HGF Sigma Aldrich H 9661 Resuspended in dH2O at 50 mg/ml
Rabbit anti-mouse FAK antibody Life Technologies AMO0672
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Life Technologies A-11034
Adobe Photoshop Adobe N/A Used for color-coding pixel frequency maps.
FIJI (ImageJ) NIH N/A Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
  2. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
  3. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
  4. Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
  5. Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
  6. Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
  7. Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
  8. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
  9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
  10. Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
  11. Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
  12. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  13. Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
  14. Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).

Tags

Биоинженерия выпуск 113 Micropatterning биомеханики молекулярной биологии тканевой инженерии геометрия тканей морфогенеза ветвления
Инженерная Трехмерные эпителиальной ткани Встроенные в внеклеточной матрицы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Piotrowski-Daspit, A. S., Nelson, C. … More

Piotrowski-Daspit, A. S., Nelson, C. M. Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (113), e54283, doi:10.3791/54283 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter