Summary
이 원고는 3 차원 (3D)의 균일 한 배열 세포 외 기질에 둘러싸여 정의 형상의 상피 조직을 설계 할 수있는 소프트 리소그래피 기반 기술을 설명합니다. 이 방법은 세포 형태 및 실험 문맥 다양한 의무가 있고 동일한 복제의 높은 처리량의 선별을 허용한다.
Introduction
분지 형태 형성으로 알려진 분 지형 상피 조직의 발달이 세포 유래 물리적 및 환경 인자에 의해 조절된다. 유선에서, 형태 형성을 분기하는 집단 세포 이동이 나무와 같은 구조를 작성하는 가이드를 통해 반복적 인 과정이다. 첫 번째 단계는 분기 개시 신도 1,2- 다음 유관에서 기본 봉오리 형성된다. 주변의 기질에 분기의 침략은 사춘기에서 스테로이드 호르몬의 전신 릴리스에 의해 유도된다. 새 차 싹은 기존 지점의 끝에서 시작하고,이 프로세스는 상피 나무 (3)를 작성하고 있습니다. 많은 중요한 생화학 적 신호가 확인되었지만, 이러한 복잡한 발육 과정은 부족 안내 세포 생물학적 메커니즘의 포괄적 이해. 또한, 특정 단서의 영향에 대한 역학적 연구 체험관에서 해체하기가 어렵습니다생체 내에서 사항은, 같은 정확한 시공간 섭동과 측정은 자주 할 수 없습니다.
이러한 전체 기관 배양 차 organoids 및 세포 배양 모델로서 3 차원 배양 기술은, 체계적 조직 형태 형성 4-6 기본 메커니즘을 연구에 유용한 도구이다. 이러한 이동, 증식 및 분화를 비롯한 세포 다양한 행동에 기계적 힘 생화학 적 신호로서, 각각의 특정 요인의 영향을 결정하는데 특히 유용 할 수있다. 6 설계된 세포 배양 모델 특히 용이 섭동을 사용 각 셀 자신의 미세.
그러한 배양 모델은 A로 유도 할 때 일관성과 재현성 총칭 이전 브랜치를 형성 제어 3D 구조 모델 유방 상피 조직을 설계하는 미세 - 기반 접근 방식을 사용ppropriate 성장 인자. 모델의 주요 이점은 정확하게 조작하고 높은 통계적 신뢰도 기계적 응력 패턴, 물리적 및 생화학 적 요인의 효과를 측정 할 수있다. 이 기술은 함께 전산 모델링 이미 유선 상피 조직 및 다른 지형 7-11 상피의 정상적인 발전이 지침 물리적 및 생화학 적 신호의 상대적 기여도를 결정하는데 사용되었다. 여기서 설명하는 것은 용이 세포 외 기질 (ECM) 겔의 다른 형태로 확장 될 수있는 이러한 모델 조직을 만들기위한 구체적인 프로토콜 및 치료제의 시험을위한 잠재적 수단으로 작용한다.
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Protocol
솔루션 1. 준비
- 인슐린의 5 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 하였다 (용매 100 ㎖에 500 mg의 인슐린) O DH이 5mm의 염산 (HCL)과 분말 인슐린 스톡을 희석. 증류수 100 ㎖로 농축 염산 50 μl를 첨가하여 용매 100 ㎖ (DH 2 O)를 준비한다.
- PBS의 1X 용액을 제조하기 위해, 멸균 조건 하에서 DH 2 O로 배일 10 배 인산 완충 용액 (PBS) 원액을 희석.
- 다음으로, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 탄성 중합체 용액을 제조 하였다 : 1 (w : w)의 비율로 10의 경화제와 함께 PDMS의 예비 중합체를 혼합한다.
- 다음과 같이 세포 배양 배지를 준비 : 재고 둘 베코의 변형 이글 중간의 500 ml의 : 식품 혼합물이 F-12 (DMEM는 / F-12), (10) 살균 소 태아 혈청의 ㎖ (FBS), 겐타 마이신 시약 500 μL 및 추가 5 ㎎ / ㎖의 인슐린 500 μL.
- W (1 % 추가 1X PBS 용액에서 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 제조: BSA 분말 V) 솔루션은 PBS를 1 배에서 철저하게 혼합합니다.
- 추가 I 콜라겐 중화 소 타입의 4 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 50 μL 배 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) 완충액, 30 ㎕의 0.1 N 수산화 나트륨 (NaOH) 30 ㎕의 세포 배양 배지, 주식 콜라겐 400 μL 냉장 1.5 ML의 microcentrifuge 관에. 위아래로 피펫 팅에 의해 천천히 섞는다; 거품을 도입하지 마십시오. 모든 거품을 제거하려면, 간단히 4 ℃에서 혼합물을 원심 분리기.
- 4 (V : V) 1X PBS에서 16 % 파라 포름 알데히드 1을 희석하여 정착 솔루션을 준비합니다.
- 1,000 (절 : v)의 주식 핵 라벨링 솔루션 1을 희석하여 핵 라벨링 솔루션을 준비 1X PBS에서.
- 세제 : 0.3 % (V V)와 1X PBS를 혼합하여 0.3 %의 인산 완충 생리 식염수 및 세제 (PBST) 솔루션을 준비합니다.
- 에서 0.3 % PBST : 염소 혈청을 1시 10분 (절 V)를 희석하여 버퍼를 차단 준비합니다.
- PRI 희석하여 관심있는 특정 단백질에 대한 일차 항체 용액을 준비(예를 들어, 토끼 항 초점 부착 키나아제 (FAK)) 메리 항체 1 : 200 (V : V) 버퍼를 차단한다.
- (: V V)를 차단 완충액에서 1000 (예를 들어, 염소 항 - 토끼 1) 형광 프로브 컨쥬 게이트 항체를 희석하여 차 항체 용액을 제조 하였다.
3D의 미세화에 대한 탄성 스탬프 2. 준비
참고 : 탄성 스탬프는 PDMS로 만들어집니다.
- 단계 1.3에 기재된 바와 같이 동일한 비율로 PDMS 용액을 철저히 혼합한다. 혼합 과정 중에 도입 된 공기 방울을 제거하기 위해 15 ~ 30 분 동안 진공 챔버에서 혼합물을 놓는다.
- 보트 또는 리소그래피 원하는 형상의 기능을 패턴 화 실리콘 마스터를 포함하는 페트리 접시의 무게를 플라스틱으로 탈기 솔루션을 붓는다. 최상의 결과를 위해 12 시간 ~ 60 ° C에서 PDMS 용액을 경화.
참고 : 실리콘 마스터가 매우 사용자 정의 할 수 있습니다; 이 프로토콜은 50의 크기로 직사각형 구조를 사용μm의 X 200 μm의 × 50 μm의 200 μm의 이격. 실리콘 마스터는 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여 제조 될 수있다. 간단히, 에폭시 계 포토 레지스트를 실리콘 웨이퍼의 상부에 스핀 코팅된다. 원하는 스탬프 기능을 상세히 마스크 후 UV 광에 노출 된 포토 레지스트 - 코팅 된 웨이퍼의 상부에 배치된다. 마스크에 의해 차단되지 바람직한 특징은 광에 노출되며, 포토 레지스트 코팅의 나머지 가용이며 씻겨 수 있지만 이러한 위치에서의 포토 레지스트는 가교 결합된다. - PDMS가 실리콘 마스터에서 원하는 기능 주위 경화 후, 플라스틱 컨테이너에서 PDMS 마스터를 제거한다. 조심스럽게 실리콘 웨이퍼에서 PDMS를 분리하고 깨끗한 면도날을 사용하여 인쇄 된 기능 주위에서 초과 PDMS를 제거합니다.
- 지금 면도날 개별 사각형 우표에 각인 기능 (~ 8 mm × 5-mm)로 패턴 화 PDMS를 잘라. CLE 이러한 기능 측면까지 보관100 mm 직경의 페트리 접시.
- 또한, 직사각형 스탬프 받침을 단계 1.3에 기재된 PDMS 용액을 사용한다.
- 스핀 코터를 사용하여 100 mm 직경의 페트리 접시에 균일하게 PDMS 용액 ~ 2-3g 확산 단계 2.1에서와 같이 60 ℃에서 ~ 12 시간에 대한 PDMS 치료. 그리고, 면도날을 사용하여, 사각형으로 PDMS의 얇은 레이어 (~ 5mm × 2 mm)를 자른다.
참고 : 두 지원 단계 2.3에서 만든 각 PDMS 스탬프 필요합니다. 지지체는 PDMS 스탬프를 들어 100 mm 직경의 배양 접시에 저장 될 수있다. - PDMS 스탬프와 지지체는 세포 배양에 사용되기 전에하는 바이오 캐비닛 흡입기 (세포 배양 후드)를 이용하여 70 % 에탄올에 침지하고 건조하여 멸균.
3D 상피 조직 3. 준비
- 바이오 안전성 캐비닛에서 각 우표의 상단에 PBS에 1 % BSA의 약 50 μl를 한 방울을 추가합니다. 미니 4 ° C에서 우표 덮여 방울을 배치4 시간의 엄마는 BSA가 도장의 표면에 흡착되도록합니다.
- PDMS의 우표에서 대기음 BSA 솔루션입니다.
- 각 세척 후 흡입, 세포 배양 배지 (스탬프 당 세척 당 50 μL가 충분합니다)로 두 번 우표의 표면을 세척 할 것.
- 곡선 스테인레스 스틸 핀셋을 사용하여 멸균 PDMS 스탬프와 지원을 처리합니다. 각각 스탬프를 PDMS의 바이오 안전성 캐비닛에서 한 35 mm 직경의 조직 배양 접시를 배치. 각각의 접시에서 PDMS 스탬프의 길이보다 약간 작은 거리에 의해 분리 된 두 개의 PDMS 지원을 누워.
- 핀셋을 사용하여, 많은 원형 유리 커버 슬립 살균 (직경 15mm를, # 1) 70 % 에탄올을 이용하여 PDMS 스탬프가 같다. 핀셋으로 그들을 누른 상태에서 커버 슬립에서 초과 액체를 기음. 별도의 100 mm 직경의 페트리 접시에 세척 된 커버를 저장합니다.
- ~ 콜라겐 액 50 μL 균일 코팅의 표면은 PDMS 스탬프 디스펜스.
- 픽업각 콜라겐 코팅 PDMS는 핀셋 스탬프와 부드럽게 반전. PDMS의 상단의 반전 스탬프를 낮추하는 35 mm 직경의 조직 배양에 배치 지지체 콜라겐은 스탬프와 조직 배양 접시의 바닥 사이되도록 걸려. 30 분 동안 37 ° C에서 요리를 품어.
- 원형 커버 슬립 각각에 ~ 나머지 콜라겐 혼합물을 50 μL 분주하고 30 분 동안 37 ° C에서 그들을 부화 (이후,이 완전히 콜라겐을 캡슐화 설계 조직 위에 배치 될 것이다).
- 40 % 컨 플루 ~에서 상피 세포 (예. EpH4 마우스 유선 상피 세포)를 포함하는 100-mm 직경의 조직 배양 접시를 가져옵니다. 세포 배양 배지를 흡인하고 1X PBS 10 ㎖로 한번 세척 하였다. 세포에 트립신 2 ML을 추가하고 5 ~ 10 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 조직 배양 접시 트립신으로 세포를 포함하는 접시에서 나머지 부착 세포를 분리 신선한 배지 8 ㎖에 추가. 피펫으로 부드럽게 혼합하고 5 분 동안 100 × g에서 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 세포 혼합물을 이동합니다.
- 원추형 튜브의 상등액을 흡인하고 세포 배양 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 세포, 혈구 계산을 사용하여 상기 현탁액의 농도를 결정한다. 106 -10 107 세포 / ㎖ ~ 최종 농도를 얻기 위해 현탁액 볼륨을 조정한다.
- 인큐베이터에서 겔화 콜라겐 샘플을 제거합니다. 핀셋 사용하여 부드럽게 성형 콜라겐에서 그들을 분리하고이를 폐기 똑바로 위로 PDMS 스탬프를 들어 올립니다.
- 원하는 형상의 몰드 공동을 포함하는 각 콜라겐 겔의 표면 상 ~ 농축 세포 현탁액 30 μL 분주. 부드럽게 요리의 측면을 흔들면서하는 공동 내에 정착 셀을 촉진하는쪽으로 동안 10X / 0.25 NA 목표와 시야 현미경으로 세포를 관찰한다. 공동는 ~ 5 분 이내에 작성해야한다.
- 연구에, 공동 각국에서 초과 세포를 가져 가십시오 옆으로 각 조직 배양 접시를 기울여 부드럽게 콜라겐 겔의 표면에 세포 배양 배지 μL 400 ~ 분배. 각 세척 사이에 현미경 콜라겐 젤을 확인 액체를 대기음 및 세척을 1-2 번 더 반복한다.
- 과량의 세포가 콜라겐 주형의 셀 채워진 공동 주위에서 삭제 한 후, 15 분 동안 37 ℃에서 세포 배양 용 인큐베이터에 조직 배양 접시를 배치했다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 부드럽게 콜라겐 코팅 클래스 커버 슬립을 반전하고, 커버 슬립의 콜라겐이 세포 채워진 캐비티 위에 캡을 형성하도록 셀 가득 콜라겐 금형의 상단에 배치합니다. 15 분 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션.
- 콜라겐 뚜껑이 셀 채워진 콜라겐 금형에 부착 한 후, 겔 위에 유리 커버 슬립 위에 천천히 ~ 2-2.5 ㎖의 세포 배양 배지를 분배. 문화 1~3일 37 ° C에서 샘플.
노트:24 시간 후 초기 시드, 상피 조직은 예컨대 상피 성장 인자 (EGF) 또는 분지를 유도하는 간세포 성장 인자 (HGF)와 같은 성장 인자로 처리 될 수있다.
4. 면역 형광 및 이미지 분석
- 조직 배양 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하고, 세포 - 함유 겔을 커버하기에 충분한 고정 제 용액을 추가한다. 200 rpm에서 진탕 기에서 15 분간 실온에서 인큐베이션 요리.
- 상기 고정 제를 흡인 1X PBS로 조직 배양 접시를 채우고, 200 rpm에서 진탕 기에서 실온에서 15 분 동안 배양한다. 세 총 세척 두 번 반복합니다.
- 조직 배양 접시에서 대기음 PBS와 훽스트 솔루션으로 대체 : 핵 레이블을합니다. 15-20 분 동안 실온에서 인큐베이션. FAK 또는 항체 검출 또 다른 마커 얼룩, 4.5 단계로 건너 뜁니다.
- 핵 라벨 솔루션을 기음과 세포 함유 g을 씻어단계 4.2에서와 같이 1X PBS로 3 회 ELS. 스테인드 샘플을 더 사용할 때까지 4 ℃에서 1X PBS에 저장 될 수있다.
- , 대기음 PBS 조직 배양 접시에서 0.3 % PBST 300 ㎕를 추가하고 실온에서 15 분 동안 샘플을 부화 : 목적 단백질에 대해 염색한다.
- 상기 PBS를 흡인 블로킹 완충액과 겔을 포함하고, ~ 실온에서 4 시간 동안 진탕 (200 RPM)에서 배양한다.
- 대기음 블로킹 완충액 차 항체 용액과 겔을 포함하고, 4 ℃에서 하룻밤 동안 200 rpm에서 진탕 배양한다.
- 일차 항체 용액을 흡인 0.3 % PBST 용액을 추가하고, 실온에서 30 분 동안 200 rpm에서 진탕 배양한다. PBST를 기음과 3-4 시간 동안 매 30 분을 반복합니다.
- 반복 4.7 및 4.8, 이차 항체 용액으로 배양이 시간 단계를 반복합니다. 이차 항체 광표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 조직 배양 접시를 감싸. FINA 후리터의 세척, 염색 샘플을 추가로 사용할 때까지 4 ° C에서 1X PBS에 저장할 수 있습니다.
- 샘플을 시각화하기 위해, 상피 조직의 중간면에 초점을 맞춘 10X / 0.30 NA 목표를 사용합니다.
- 세포 핵, UV 조명 아래 10X / 0.30 NA 목표를 사용하여 핵 마커로 표지 이미지 고정 샘플을 시각화합니다.
- 거꾸로 형광 현미경에 10X / 0.30 NA 목표를 사용하여 관심의 단백질, 이미지 스테인드 샘플을 시각화합니다.
- 동일한 초기 형상의 다수의 조직 (보통 50 개 이상)의 단백질 염색 빈도 맵을 작성하려면, 먼저 반입 표준 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지들의 각각은 (재료 참조), 8 비트 그레이 스케일로 변환한다.
- 이러한 이미지 임계 값, 그레이 스케일 컷오프 지점을 정의하여 바이너리 (즉, 하프 톤 / 흑백)로 변환; 임계 값 아래 그레이 스케일 값은 검정색되고, 임계 값 위의 사람들은 흰색이된다. 그런 다음, 결합하나의 이미지 스택에 각 이진 이미지의 각.
- 다음에, 적층 된 이미지를 등록 (즉, 일치하거나 일치) 분석 소프트웨어. 많은 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 무료로 사용할 수 등록 플러그인이 함께 제공됩니다.
- 다음 이미지의 정렬을위한 템플릿으로 스택 각 이미지를 사용하여, 전체 스택의 이미지는 전파에 의해 정렬되도록. 마지막으로, 오버레이 (프로젝트) 평균 강도에 기초하여 상기 화상 정렬 스택의 이미지는 픽셀 주파수지도와 단일 이미지를 형성한다. 이 이미지는 색으로 구분 선택 10, 11의 이미지 편집 소프트웨어를 사용 할 수 있습니다.
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Representative Results
유방 상피 조직의 미세 일반 회로도
실험적인 작업 흐름을 요약 한 미세 가공 절차의 일반 개략도가도 1에 도시되어있다. 결과적으로 완전히 ECM 겔에 포함되는 동일 형상 및 간격의 상피 조직의 배열이다. 대표적인 실험 I가 4 ㎎ / ㎖의 농도로 소 콜라겐 겔 타입의 배양 EpH4 마우스 유방 상피 세포를 사용한다. 설계 조직의 최고 품질을 보장하기 위해, 프로토콜에 설명 된 기술은 밀접하게 따라야한다. 유형으로 성형 된 사각형 우물의 배열도 2A와 2B 쇼 낮은 높은 배율의 뷰 내가 세포 파종하기 전에 젤 콜라겐. 웰의 형상은 실리콘 마스터 기능의 형상에 의해 결정된다. 이 일을 들어하는 것이 중요하다똑바로 콜라겐의 전자 PDMS 몰드 캐비티의 형상이 왜곡되지 않도록.도 2c는 타입 직사각형 웰을 도시 I는 (과잉 세포가 콜라겐의 표면을 세정 한) 유방 상피 세포 충전 된 겔 콜라겐. 이 예에서, 각 200 μm의 × 50 μm의 구형도는 약 80-100 세포가 포함되어 있습니다.
성장 인자를 첨가하는 형태 형성을 유도
24시간 시딩 한 후, 조직은 형태 형성 분지 모델링 HGF 또는 EGF 같은 몇 일간 배양 한 성장 인자로 처리 될 수있다. 일반적으로, 분기 조기 성장 인자 자극 후 4시간으로 형성하기 시작한다. 그림 3a는 내가 24 시간 미세 시술 후 젤 콜라겐 유형 내에서 직사각형의 유방 상피 조직 대표 결과를 보여주고있는 CEL 후LS는 콜라겐과 서로 접착 하였다. 어떠한 분기 성장 인자를 첨가하기 이전에 관찰되지 않는다.도 3b는 10 ng를 / ㎖의 HGF를 첨가 한 후 24 시간 분파 행한 대표적인 직사각형 조직을 나타낸다. 이 경우, 가지 세포가 높은 기계적 응력 9 경력 (중반 대조적으로) 조직의 단부에서 발생한다. 동일한 초기 겔 동일 형상의 다수의 조직을 다음 높은 처리량 분석을 가능 지점 위치 및 분기 길이 인구 평균을 결정하는 묘화 될 수있다.
면역 형광 염색법은 단백질 지방화를 시각화
문화 모델의 조직 배열의 면역 형광 염색법은 우리가 높은 통계 신뢰와 조직 내에서 단백질의 현지화를 확인할 수 있습니다. 그림 4a는 파트 :를 보여줍니다초점 부착 키나제 (FAK)에 대한 스테인드 분기 직사각형의 유방 상피 조직에서 대의 적 결과. 동일 형상의 조직 빈도 맵을 생성하는 다른 단백질의 현지화뿐만 아니라 분지 활성과 비교할 수있는 조직 내에서 관심있는 단백질의 평균 공간 지역화를 시각화 할 수있다. 도 4b는 일반적으로 발생 분기 직사각형 조직의 짧은 끝에서 FAK 농축을 보여주는 50 조직에 대한 평균 FAK 염색의 주파수지도를 보여줍니다.
그림 1. 도식 미세 가공 과정을 개설. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 미세 공정 중에 찍은 사진. (A) 저와 (B) 및 형식 직사각형 공동의 고배율 위상차 이미지는 나는 탄성 PDMS 몰드를 사용하여 만든 콜라겐. (A) 및 (B)에서 (C) 공동 부 유선 상피 세포로 채워진다. 스케일 바, 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 미세 조직 형태 형성 분기 거칩니다. 미세 후 대표 직사각형 조직 24 시간의 (A) 위상 콘트라스트 이미지입니다. (B) 재의 상 대비 이미지10 ng를 / ㎖의 HGF를 첨가 한 후 24 시간 분파 받아야 시작 presentative 직사각형 조직. 흰색 화살표는 새로 형성된 지점을 나타냅니다. 스케일 바, 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
미세 조직의 그림 4. 면역 형광 염색법. 분기 개시 후 유방 상피 조직에서 FAK에 대한 (A) 면역 형광 염색법. (B) (50) 조직의 평균 FAK 얼룩의 주파수지도. 스케일 바, 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Acknowledgments
이 작품은 NIH (HL118532, HL120142, CA187692), 데이비드 & 루실 패커드 재단, 카밀 & 헨리 드레퓌스 재단과 버로우즈에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다 기금에 오신 것을 환영합니다. ASP는 샬롯 엘리자베스 프록터 경어 원정대에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
