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Bioengineering

इंजीनियरिंग तीन आयामी उपकला ऊतकों कोशिकी मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड

Published: July 10, 2016 doi: 10.3791/54283
Automatic Translation
1, 1,2
1Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2Molecular Biology, Princeton University

Summary

यह पांडुलिपि एक नरम लिथोग्राफी आधारित तीन आयामी (3 डी) की वर्दी सरणियों परिभाषित ज्यामिति की उपकला ऊतकों बाह्य मैट्रिक्स से घिरा इंजीनियर करने के लिए तकनीक का वर्णन करता है। इस विधि प्रकार की कोशिकाओं और प्रयोगात्मक संदर्भों की एक विस्तृत विविधता के लिए उत्तरदायी है और समान प्रतिकृति के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है।

Introduction

branched उपकला ऊतकों, morphogenesis शाखाओं में बंटी के रूप में जाना के विकास, सेल व्युत्पन्न, शारीरिक, और पर्यावरणीय कारकों द्वारा विनियमित है। स्तन ग्रंथि में, शाखाओं में बंटी morphogenesis चलने का एक प्रक्रिया है जो निर्देशित के माध्यम से सामूहिक सेल प्रवास एक पेड़ की तरह वास्तुकला बनाता है। पहला कदम दुग्ध नलिकाओं से प्राथमिक कली गठन, शाखा दीक्षा और बढ़ाव 1,2 द्वारा पीछा किया। आसपास के स्ट्रोमा में शाखाओं का आक्रमण यौवन पर स्टेरॉयड हार्मोन के प्रणालीगत रिलीज से प्रेरित है। न्यू प्राथमिक कलियों तो मौजूदा शाखाओं की छोर से आरंभ, और इस प्रक्रिया को एक उपकला पेड़ 3 बनाने के लिए जारी है। हालांकि कई महत्वपूर्ण जैव रासायनिक संकेतों पहचान की गई है, कि इस जटिल विकास की प्रक्रिया वर्तमान में कमी है मार्गदर्शन सेल जैविक तंत्र के लिए एक व्यापक समझ। इसके अलावा, विशिष्ट संकेतों के प्रभावों पर यंत्रवत अध्ययनों के अनुभव से deconstruct करने के लिए मुश्किल हो जाता हैविवो में बयान, के रूप में सटीक spatiotemporal perturbations और माप अक्सर संभव नहीं हैं।

इस तरह पूरे अंग संस्कृति, प्राथमिक organoids, और सेल संस्कृति मॉडल के रूप में तीन आयामी (3 डी) संस्कृति तकनीक, व्यवस्थित तंत्र ऊतक morphogenesis 4-6 अंतर्निहित की जांच के लिए उपयोगी उपकरण हैं। ये ऐसे यांत्रिक बलों और जैव रासायनिक संकेतों के रूप में व्यक्तिगत रूप से विशिष्ट कारकों के प्रभाव का निर्धारण करने, सहित प्रवास, प्रसार, और भेदभाव सेल व्यवहार की एक किस्म के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। 6 इंजीनियर सेल संस्कृति मॉडल, विशेष रूप से, आसानी से गड़बड़ी सक्षम व्यक्ति की कोशिकाओं और उनके microenvironment के।

ऐसा ही एक संस्कृति मॉडल नियंत्रित 3 डी संरचना के साथ मॉडल स्तन उपकला ऊतकों जब एक साथ प्रेरित है कि लगातार और reproducibly शाखाओं कि सामूहिक रूप से विस्थापित फार्म इंजीनियर को एक microfabrication आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करता हैppropriate वृद्धि कारक है। मॉडल का प्रमुख लाभ ठीक हेरफेर और इस तरह के यांत्रिक तनाव के पैटर्न, उच्च सांख्यिकीय विश्वास के साथ के रूप में शारीरिक और जैव रासायनिक कारकों के प्रभाव को मापने की क्षमता है। इस तकनीक को एक साथ कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग के साथ, पहले से ही स्तन उपकला ऊतकों और अन्य शाखाओं epithelia 7-11 के सामान्य विकास के मार्गदर्शन में शारीरिक और जैव रासायनिक संकेतों के रिश्तेदार योगदान निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यहाँ प्रस्तुत इन मॉडल के ऊतकों, जो आसानी से कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) जैल के अन्य प्रकारों के लिए बढ़ाया जा सकता है के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है, और जो चिकित्सा विज्ञान के परीक्षण के लिए एक संभावित उपकरण के रूप में कार्य करता है।

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Protocol

1. समाधान की तैयारी

  1. एक 5 मिलीग्राम / मिलीलीटर इंसुलिन का समाधान तैयार करने के लिए, पाउडर इंसुलिन शेयर 5 मिमी हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ DH 2 में (विलायक 100 मिलीलीटर में मिलीग्राम इंसुलिन 500) पतला हे। 100 मिलीलीटर आसुत जल 100 मिलीलीटर के लिए केंद्रित एचसीएल के 50 μl जोड़कर विलायक (DH 2 हे) तैयार करें।
  2. पीबीएस के एक 1x समाधान बनाने के लिए, बाँझ शर्तों के तहत DH 2 हे के साथ 1x करने के लिए 10x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) शेयर समाधान पतला।
  3. इस प्रकार के रूप polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer समाधान तैयार: 1 (डब्ल्यू: डब्ल्यू) अनुपात एक 10 में इलाज एजेंट के साथ मिलकर PDMS prepolymer मिश्रण।
  4. इस प्रकार के रूप में सेल संस्कृति के माध्यम से तैयार: शेयर Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम के 500 मिलीलीटर के लिए: पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (DMEM / F-12), बाँझ भ्रूण गोजातीय सीरम के 10 मिलीलीटर (एफबीएस), जेंटामाइसिन अभिकर्मक के 500 μl, और जोड़ने 5 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन के 500 μl।
  5. डब्ल्यू 1x पीबीएस समाधान में 1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) तैयार करने के लिए, 1% जोड़ने (: V) बीएसए पाउडर का समाधान पीबीएस 1x और मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।
  6. एक 4 मिलीग्राम / निष्प्रभावी गोजातीय प्रकार मैं कोलेजन की मिलीलीटर समाधान तैयार करने के लिए, जोड़ने के 50 μl 10x हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) बफर, 30 μl 0.1 एन सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH), 30 μl सेल संस्कृति के माध्यम से, और शेयर कोलेजन के 400 μl एक ठंडा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे-धीरे मिश्रण; बुलबुले शुरू करने से बचें। किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए, संक्षेप में 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण अपकेंद्रित्र।
  7. 4 (v: v) 1x पीबीएस में 16% paraformaldehyde गिराए 1 से एक लगानेवाला समाधान तैयार है।
  8. शेयर नाभिक लेबलिंग समाधान 1 गिराए द्वारा एक नाभिक लेबलिंग समाधान तैयार: 1,000 (v: v) 1x पीबीएस में।
  9. डिटर्जेंट: 0.3% (वी वी) के साथ 1x पीबीएस के मिश्रण से एक 0.3% फॉस्फेट बफर खारा और डिटर्जेंट (PBST) समाधान तैयार है।
  10. में 0.3% PBST: बकरी सीरम गिराए 1:10 (V v) द्वारा बफर अवरुद्ध तैयार करें।
  11. प्राथमिक गिराए द्वारा ब्याज की एक विशेष प्रोटीन के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयारमैरी एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, खरगोश विरोधी फोकल आसंजन काइनेज (FAK)) 1: 200 (वी: v) अवरुद्ध बफर में।
  12. (: V v) बफर अवरुद्ध में 1,000: एक फ्लोरोसेंट जांच संयुग्मित एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, बकरी विरोधी खरगोश) 1 गिराए द्वारा एक माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार है।

3 डी micropatterning के लिए Elastomeric टिकटों की 2. तैयारी

नोट: Elastomeric टिकटों PDMS साथ बना रहे हैं।

  1. 1.3 चरण में वर्णित के रूप में उसी अनुपात में एक PDMS समाधान करें और अच्छी तरह मिला लें। किसी भी हवाई बुलबुले कि मिश्रण प्रक्रिया के दौरान शुरू किए गए थे दूर करने के लिए 15-30 मिनट के लिए एक निर्वात चैम्बर में मिश्रण रखें।
  2. नाव या पेट्री एक सिलिकॉन मास्टर कि पत्थर के छापे से छापने से वांछित ज्यामिति की सुविधाओं के साथ नमूनों है युक्त पकवान तौलना एक प्लास्टिक में degassed समाधान डालो। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, के लिए ~ 12 घंटा 60 डिग्री सेल्सियस पर PDMS समाधान का इलाज।
    नोट: सिलिकॉन स्वामी अत्यधिक विकसित कर रहे हैं; इस प्रोटोकॉल 50 के आयामों के साथ आयताकार संरचनाओं का उपयोग करता हैमाइक्रोन x 200 माइक्रोन x 50 माइक्रोन 200 माइक्रोन अलग स्थान दिया। सिलिकॉन स्वामी मानक photolithography तकनीक का उपयोग किया जा सकता है। संक्षेप में, एक epoxy आधारित photoresist एक सिलिकॉन वेफर के शीर्ष पर स्पिन में लिपटे है। वांछित डाक टिकट सुविधाओं का ब्यौरा एक मुखौटा photoresist लेपित वेफर, जो तब पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में है के शीर्ष पर रखा गया है। वांछित सुविधाओं मुखौटा द्वारा अवरुद्ध नहीं प्रकाश के संपर्क में हैं और इन स्थानों पर photoresist crosslinked हो जाता है, जबकि photoresist कोटिंग के शेष घुलनशील है और दूर धोया जा सकता है।
  3. बाद PDMS सिलिकॉन मास्टर पर वांछित सुविधाओं के आसपास ठीक हो गया है, प्लास्टिक के कंटेनर से PDMS और मास्टर को हटा दें। ध्यान से सिलिकॉन वेफर से PDMS अलग है और एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग अंकित सुविधाओं के चारों ओर से अतिरिक्त PDMS को हटा दें।
  4. अब PDMS अंकित एक धार के साथ अलग-अलग आयताकार टिकटों में सुविधाओं (~ 8 मिमी x 5 मिमी) के साथ नमूनों में कटौती। दुकान एक CLE में इन सुविधा साइड-अपएक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश।
  5. इसके अतिरिक्त, PDMS समाधान 1.3 चरण में वर्णित का उपयोग आयताकार टिकटों के लिए समर्थन करने के लिए।
  6. एक स्पिन coater का प्रयोग, फैल एक 100 मिमी व्यास पेट्री डिश पर PDMS समाधान समान रूप से ~ 2-3 जी और 2.1 कदम के रूप में 60 डिग्री सेल्सियस पर ~ 12 घंटे के लिए PDMS इलाज। फिर, एक रेजर ब्लेड का उपयोग, आयत में PDMS की पतली परत (~ 5 मिमी x 2 मिमी) काटा।
    नोट: दो का समर्थन करता प्रत्येक PDMS 2.3 कदम में किए गए टिकट के लिए आवश्यक हैं। समर्थन करता है 100 मिमी व्यास पेट्री डिश है कि PDMS टिकटों शामिल है में संग्रहित किया जा सकता है।
  7. इससे पहले PDMS टिकटों और समर्थन करता है सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक Aspirator (सेल संस्कृति हुड) का उपयोग कर 70% इथेनॉल और सूखे में विसर्जन के द्वारा बाँझ।

3. 3 डी उपकला ऊतकों की तैयारी

  1. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, प्रत्येक टिकट के शीर्ष करने के लिए पीबीएस में 1% बीएसए के लगभग 50 μl की एक बूंद जोड़ें। एक मिनी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर छोटी बूंद टिकटों कवर की जगह4 घंटा की मां सुनिश्चित करने के लिए कि बीएसए स्टाम्प की सतह के लिए adsorbs।
  2. PDMS टिकटों से महाप्राण बीएसए समाधान।
  3. टिकटों की सतहों प्रत्येक धोने के बाद श्वास, सेल संस्कृति के माध्यम से (स्टांप प्रति धोने प्रति 50 μl के लिए पर्याप्त होना चाहिए) के साथ दो बार धोएं।
  4. निष्फल PDMS टिकटों और समर्थन करता है घुमावदार स्टेनलेस स्टील चिमटी का उपयोग संभाल लेना। एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, प्रत्येक स्टाम्प PDMS के लिए एक 35 मिमी व्यास टिशू कल्चर पकवान बाहर करना। हर डिश में, एक दूरी PDMS टिकटों की लंबाई की तुलना में थोड़ा कम द्वारा अलग दो PDMS समर्थन लेट गया।
  5. चिमटी का प्रयोग, के रूप में कई परिपत्र कांच coverslips बाँझ (व्यास में 15 मिमी, # 1) के रूप में वहाँ 70% इथेनॉल का उपयोग PDMS टिकटों हैं। जबकि उन्हें चिमटी के साथ पकड़े coverslips से अतिरिक्त तरल aspirate। एक अलग 100 मिमी व्यास पेट्री डिश में धोया coverslips स्टोर।
  6. बांटना ~ कोलेजन मिश्रण के 50 μl समान रूप से कोट प्रत्येक की सतह स्टाम्प PDMS करने के लिए।
  7. पिक अपप्रत्येक कोलेजन लेपित PDMS चिमटी के साथ टिकट और धीरे से उन्हें पलटना। PDMS के शीर्ष पर उल्टे टिकटों लोअर 35 मिमी व्यास टिशू कल्चर में बाहर रखी समर्थन dished ऐसी है कि कोलेजन टिकट और टिशू कल्चर डिश के तल के बीच है। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन सेते हैं।
  8. बांटना ~ शेष कोलेजन मिश्रण के 50 μl परिपत्र coverslips में से प्रत्येक पर 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते (बाद में, इन इंजीनियर के ऊतकों के शीर्ष उन्हें पूरी तरह से कोलेजन में encapsulate करने पर रखा जाएगा)।
  9. एक 100 मिमी व्यास टिशू कल्चर ~ 40% confluency उपकला कोशिकाओं (उदा। EpH4 माउस स्तन उपकला कोशिकाओं) युक्त पकवान प्राप्त करते हैं। सेल संस्कृति के माध्यम Aspirate और पीबीएस 1x 10 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें। कोशिकाओं को trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  10. टिशू कल्चर, trypsinized कोशिकाओं से युक्त पकवान से किसी भी शेष पक्षपाती कोशिकाओं को हटाए डिश के लिए ताजा संस्कृति के माध्यम से 8 मिलीलीटर जोड़ें। pipetting द्वारा धीरे मिक्स और 5 मिनट के लिए 100 × छ पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र सेल मिश्रण ले जाते हैं।
  11. शंक्वाकार ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला Aspirate और सेल संस्कृति माध्यम में सेल गोली resuspend। , एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती निलंबन की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए। ~ 10 6 -10 7 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए निलंबन मात्रा समायोजित करें।
  12. इनक्यूबेटर से gelled कोलेजन नमूने निकालें। चिमटी का प्रयोग, धीरे उन्हें ढाला कोलेजन से अलग कर उन्हें त्यागने के लिए PDMS टिकटों उठा सीधे ऊपर की तरफ।
  13. प्रत्येक कोलेजन वांछित ज्यामिति की ढाला गुहाओं युक्त जेल की सतह पर बांटना ~ केंद्रित सेल निलंबन के 30 μl। एक 10X / 0.25 एनए उद्देश्य के साथ एक brightfield खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करते हुए धीरे व्यंजन पक्ष मिलाते सेल गुहाओं भीतर बसने को बढ़ावा देने के लिए पक्ष की। गुहाओं ~ 5 मिनट के भीतर भरा जाना चाहिए।
  14. अनुसंधान करने के लिएCavities, चारों ओर से अतिरिक्त कोशिकाओं निकालें अपने पक्ष पर प्रत्येक टिशू कल्चर पकवान झुकाव और धीरे कोलेजन जेल की सतह पर 400 बांटना ~ सेल संस्कृति के माध्यम μl। तरल प्रत्येक धोने के बीच में खुर्दबीन के नीचे कोलेजन जैल जाँच Aspirate और धोने 1-2 बार दोहराएँ।
  15. अतिरिक्त कोशिकाओं के आसपास कोलेजन सांचे में सेल से भरे गुहाओं से साफ हो गया है के बाद, 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में टिशू कल्चर व्यंजन जगह है। फिर, चिमटी का प्रयोग, धीरे कोलेजन लेपित वर्ग coverslips पलटना और सेल से भरे कोलेजन नए नए साँचे कि इस तरह के coverslips से कोलेजन सेल से भरे गुहाओं पर एक टोपी रूपों के शीर्ष पर उन्हें जगह है। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
  16. एक बार जब कोलेजन टोपियां सेल से भरे कोलेजन ढालना का पालन किया है, जैल के शीर्ष पर गिलास coverslip के साथ धीरे धीरे बांटना ~ 2-2.5 मिलीलीटर सेल संस्कृति के माध्यम से। संस्कृति 1-3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने हैं।
    ध्यान दें:प्रारंभिक बोने के बाद 24 घंटे, उपकला ऊतकों ऐसे epidermal वृद्धि कारक (EGF) या hepatocyte वृद्धि कारक (HGF) शाखाओं में प्रेरित करने के रूप में वृद्धि कारकों के साथ इलाज किया जा सकता है।

4. Immunofluorescence और छवि विश्लेषण

  1. टिशू कल्चर व्यंजन से सेल संस्कृति के माध्यम Aspirate और सेल युक्त जैल को कवर करने के लिए पर्याप्त लगानेवाला समाधान जोड़ें। 200 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बर्तन सेते हैं।
  2. लगानेवाला Aspirate, 1x पीबीएस के साथ टिशू कल्चर व्यंजन को भरने, और 200 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। तीन की कुल washes के लिए दो बार दोहराएँ।
  3. टिशू कल्चर पकवान से महाप्राण पीबीएस और Hoechst समाधान के साथ बदलें: नाभिक लेबल करने के लिए। 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। FAK या किसी अन्य के मार्कर है कि एंटीबॉडी के साथ detectable है के लिए दाग के लिए, 4.5 चरण पर जाएं।
  4. परमाणु लेबलिंग समाधान Aspirate और सेल युक्त जी धोने4.2 चरण में के रूप में 1x पीबीएस के साथ तीन बार एल्स। सना हुआ नमूने आगे उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है।
  5. ब्याज की एक प्रोटीन के लिए दाग: महाप्राण पीबीएस टिशू कल्चर व्यंजन से, 0.3% PBST के 300 μl जोड़ने के लिए, और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना सेते हैं।
  6. पीबीएस Aspirate, बफर अवरुद्ध साथ जैल कवर, और ~ 4 ​​घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक प्रकार के बरतन (200 आरपीएम) पर सेते हैं।
  7. महाप्राण अवरुद्ध बफर, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ जैल कवर, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर में 200 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर सेते हैं।
  8. , प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान Aspirate 0.3% PBST समाधान जोड़ने, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 200 rpm पर एक प्रकार के बरतन पर सेते हैं। PBST Aspirate और 3-4 घंटे के लिए हर 30 मिनट दोहराएँ।
  9. दोहराएँ 4.7 और 4.8, इस बार माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के साथ incubating कदम। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ चादर टिशू कल्चर व्यंजन माध्यमिक एंटीबॉडी की photobleaching रोकने के लिए। वित्तीय और प्रक्रियात्मक पहलुओं के बादएल धोने, दाग नमूने आगे उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x पीबीएस में संग्रहित किया जा सकता है।
  10. नमूनों की कल्पना करने के लिए, एक 10X / 0.30 एनए उद्देश्य उपकला ऊतकों की midplane पर ध्यान केंद्रित का उपयोग करें।
  11. सेल नाभिक, एक परमाणु मार्कर एक 10X / 0.30 एनए उद्देश्य यूवी रोशनी के तहत प्रयोग के साथ लेबल की छवि तय नमूने कल्पना।
  12. ब्याज की एक प्रोटीन, छवि एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर एक 10X / 0.30 एनए उद्देश्य का उपयोग के लिए दाग नमूने कल्पना।
  13. समान प्रारंभिक ज्यामिति के कई ऊतकों (आमतौर पर 50 या अधिक) के प्रोटीन धुंधला की आवृत्ति नक्शे बनाने के लिए, पहले आयात मानक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों के प्रत्येक (सामग्री देखें) और उन्हें 8-बिट स्केल कन्वर्ट करने के लिए।
  14. सीमा के लिए इन छवियों, एक स्केल कटऑफ बिंदु को परिभाषित करने से बाइनरी (यानी, आंशिक रंग / काला और सफेद) के लिए उन्हें बदलने; सीमा से नीचे स्केल मूल्यों काले हो जाते हैं, और सीमा से ऊपर उन सफेद हो जाते हैं। फिर, गठबंधनएक एकल छवि ढेर में अलग-अलग द्विआधारी छवियों के प्रत्येक।
  15. अगले, खड़ी छवियों रजिस्टर (यानी, संरेखित या उन्हें मैच) विश्लेषण सॉफ्टवेयर में। कई छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध पंजीकरण प्लगइन के साथ आते हैं।
    1. अगले छवि के संरेखण के लिए एक टेम्पलेट के रूप में एक ढेर में प्रत्येक छवि का उपयोग करें, पूरी ढेर में छवियों प्रचार से गठबंधन कर रहे हैं कि इस तरह के। अंत में, ओवरले (परियोजना) गठबंधन छवि ढेर में छवियों औसत तीव्रता के आधार पर एक पिक्सेल आवृत्ति नक्शे के साथ एक एकल छवि बनाने के लिए। इस छवि को तो कलर-कोडेड चुनाव 10,11 की छवि संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग हो सकता है।

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Representative Results

स्तन उपकला ऊतक microfabrication के जनरल योजनाबद्ध

Microfabrication प्रक्रिया प्रयोगात्मक कार्य प्रवाह रूपरेखा का एक सामान्य योजनाबद्ध चित्र 1 में दिखाया गया है। अंतिम परिणाम समान ज्यामिति और रिक्ति की उपकला ऊतकों है कि पूरी तरह से एक ईसीएम जेल के भीतर एम्बेडेड रहे हैं की एक सरणी है। एक प्रतिनिधि प्रयोग EpH4 माउस स्तन उपकला गोजातीय प्रकार मैं 4 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में कोलेजन की एक जेल में संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग करता है। इंजीनियर के ऊतकों के उच्चतम गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीकों को बारीकी से पालन किया जाना चाहिए। आंकड़े 2A और 2 बी शो आयताकार कुओं की सरणियों कि एक प्रकार में ढाला गया है की कम और उच्च बढ़ाई विचारों मैं जेल सेल बोने से पहले कोलेजन। कुओं के आकार सिलिकॉन मास्टर पर सुविधाओं के आकार से निर्धारित होता है। यह वीं उठाने के लिए महत्वपूर्ण हैगुहा ज्यामिति बिगाड़ना ई PDMS मोल्ड सीधे कोलेजन से ऊपर के रूप में तो नहीं है। चित्रा -2 सी एक प्रकार में आयताकार कुओं चलता रहा है कि जेल (अतिरिक्त कोशिकाओं कोलेजन की सतह से धोया गया है) स्तन उपकला कोशिकाओं के साथ भर दिया गया है कोलेजन। इस उदाहरण में, प्रत्येक 200 माइक्रोन x 50 माइक्रोन आयताकार अच्छी तरह से लगभग 80-100 सेल शामिल हैं।

वृद्धि कारकों के अलावा morphogenesis लाती

बोने के बाद 24 घंटे, ऊतकों में वृद्धि कारकों HGF या EGF के रूप में इस तरह के और कई दिनों में सुसंस्कृत morphogenesis शाखाओं में मॉडल करने के साथ इलाज किया जा सकता है। आमतौर पर, शाखाओं के रूप में जल्दी वृद्धि कारक उत्तेजना के बाद 4 घंटे के रूप में आकार लेने लगते हैं। चित्रा 3A मैं microfabrication प्रक्रिया के बाद 24 घंटे के जेल कोलेजन, एक प्रकार के भीतर आयताकार स्तन उपकला ऊतकों से प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है जो सेल के बादरास कोलेजन के लिए और एक दूसरे का पालन किया है। कोई शाखाओं वृद्धि कारक अलावा पहले मनाया जाता है। चित्रा 3 बी एक प्रतिनिधि आयताकार ऊतक कि 10 एनजी / एमएल पर HGF के अलावा के बाद 24 घंटे के शाखाओं में आया है पता चलता है। इस मामले में, शाखाओं के ऊतकों के समाप्त होता है (के रूप में मध्य के खिलाफ) है, जहां कोशिकाओं उच्चतम यांत्रिक तनाव 9 अनुभव पर होते हैं। एक ही जेल में समान प्रारंभिक ज्यामिति के कई ऊतकों तो शाखा स्थान और शाखा लंबाई की जनसंख्या का औसत निर्धारित करने के लिए, उच्च throughput विश्लेषण सक्रिय करने के imaged किया जा सकता है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रोटीन स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए

संस्कृति मॉडल में ऊतक सरणियों के immunofluorescence धुंधला हमें उच्च सांख्यिकीय विश्वास के साथ एक ऊतक के भीतर प्रोटीन स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है। चित्रा -4 ए प्रतिनिधि से पता चलता हैफोकल आसंजन काइनेज (FAK) के लिए दाग एक शाखाओं में बंटी आयताकार स्तन उपकला ऊतक से सरीखे परिणाम है। समान ज्यामिति के ऊतकों की आवृत्ति नक्शे बनाने के ऊतकों के भीतर ब्याज की प्रोटीन है, जो अन्य प्रोटीन का स्थानीयकरण के साथ ही शाखाओं में बंटी गतिविधि के लिए तुलना की जा सकती की औसत स्थानिक स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 4 बी आयताकार ऊतकों, जहां शाखाओं में आम तौर पर होता है की दोनों छोरों पर FAK संवर्धन दिखा 50 ऊतकों के लिए औसत FAK धुंधला की एक आवृत्ति नक्शे से पता चलता।

आकृति 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध microfabrication प्रक्रिया रूपरेखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


चित्रा 2. microfabrication प्रक्रिया के दौरान लिया छवियाँ। (ए) कम और (बी) और प्रकार में आयताकार गुहाओं की उच्च वृद्धि के चरण विपरीत छवियों मैं एक elastomeric PDMS मोल्ड का उपयोग कर बनाया कोलेजन। (सी) (ए) और (बी) से Cavities स्तन उपकला कोशिकाओं के साथ भर रहे हैं। स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. microfabricated ऊतकों morphogenesis शाखाओं में से गुजरना। (ए) microfabrication के बाद एक प्रतिनिधि आयताकार ऊतक 24 घंटा के चरण विपरीत छवि। (बी) के एक पुनः के पहले चरण विपरीत छविpresentative आयताकार ऊतक कि 10 एनजी / एमएल पर HGF के अलावा के बाद 24 घंटे शाखाओं में से गुजरना शुरू कर दिया है। व्हाइट तीर नवगठित शाखाओं संकेत मिलता है। स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा microfabricated ऊतकों की 4. Immunofluorescence धुंधला हो जाना। (ए) इम्यूनोफ्लोरेसेंस शाखा दीक्षा के बाद एक स्तन उपकला ऊतक में FAK के लिए धुंधला हो जाना। (बी), 50 ऊतकों में औसत FAK धुंधला की एक आवृत्ति नक्शा। स्केल सलाखों, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Acknowledgments

यह काम एनआईएच (HL118532, HL120142, CA187692), डेविड और Lucile Packard फाउंडेशन, केमिली और हेनरी Dreyfus फाउंडेशन, और बरोज से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था आपका स्वागत फंड। एएसपी एक शेर्लोट एलिजाबेथ प्रोक्टर माननीय फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives Sylgard 184
PDMS curing agent Ellsworth Adhesives Sylgard 184
Lithographically patterned silicon master self-made N/A
Plastic weigh boat Fisher Scientific 08-732-115
100-mm-diameter Petri dishes BioExpress D-2550-2
Ethyl Alcohol 200 Proof Pharmco-Aaper 111000200 Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O
Razor blade American Safety Razor 620179
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) Hyclone SH30023FS
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150H
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) Life Technologies 14185-052
Insulin Sigma Aldrich I6634-500MG
Gentamicin Life Technologies 15750-060
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific BP399-500
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 221465-500G
Bovine type I collagen (non-pepsinized) Koken IAC-50
Albumin from bovine serum (BSA) Sigma Aldrich A-7906
Curved stainless steel tweezers Dumont 7
35-mm-diameter tissue culture dishes BioExpress T-2881-6
15 ml conical tubes BioExpress C-3394-2
1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube USA Scientific 1615-5500
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter Bellco Glass Inc. Special order
0.05% 1x Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
Paraformaldehyde VWR 100503-916
Triton X-100 Perkin Elmer N9300260 Detergent
HGF Sigma Aldrich H 9661 Resuspended in dH2O at 50 mg/ml
Rabbit anti-mouse FAK antibody Life Technologies AMO0672
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Life Technologies A-11034
Adobe Photoshop Adobe N/A Used for color-coding pixel frequency maps.
FIJI (ImageJ) NIH N/A Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images.

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 113 micropatterning बायोमैकेनिक्स आणविक जीव विज्ञान ऊतक इंजीनियरिंग ऊतक ज्यामिति morphogenesis शाखाओं में बंटी
इंजीनियरिंग तीन आयामी उपकला ऊतकों कोशिकी मैट्रिक्स के भीतर एम्बेडेड
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Piotrowski-Daspit, A. S., Nelson, C. … More

Piotrowski-Daspit, A. S., Nelson, C. M. Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix. J. Vis. Exp. (113), e54283, doi:10.3791/54283 (2016).

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