Summary
Dette manuskriptet beskriver en myk litografi-baserte teknikk for å konstruere ensartede rekker av tre-dimensjonale (3D) epitelvev med definert geometri som er omgitt av ekstracellulær matriks. Denne metoden er mottagelig for et bredt spekter av celletyper og eksperimentelle sammenhenger og gir mulighet for high-throughput screening av identiske replikater.
Introduction
Utviklingen av forgrenede epitelvev, kjent som forgrening morfogenese, reguleres av celle-stammer, fysiske og miljømessige faktorer. I melkekjertlene, forgrening morfogenese er en iterativ prosess der styres kollektivt cellemigrering skaper et tre-lignende arkitektur. Det første trinnet er primære knoppen formasjon fra melkekanalene, etterfulgt av gren initiering og forlengelse 1,2. Invasjonen av grenene i det omkringliggende stroma er forårsaket av den systemiske utgivelsen av steroidhormoner i puberteten. Nye primære knopper deretter starter fra endene av eksisterende grener, og denne prosessen fortsetter å skape en epitelial treet 3. Selv om mange viktige biokjemiske signaler har blitt identifisert, en helhetlig forståelse av celle biologiske mekanismer som styrer dette komplekset utviklingsprosess for tiden mangler. Videre mekanistiske studier på påvirkning av spesifikke signaler er vanskelig å dekonstruere fra opplementer i vivo, som presise tid og rom forstyrrelser og målinger er ofte ikke mulig.
Tre-dimensjonale (3D) dyrkningsteknikker, slik som helhet organkultur, primære organoids, og cellekulturmodeller, er nyttige verktøy for systematisk å undersøke mekanismene bak vev morfogenese 4-6. Disse kan være spesielt nyttig for å bestemme innflytelsen av bestemte faktorer hver for seg, slik som mekaniske krefter og biokjemiske signaler, på en rekke celle atferd, inkludert migrering, proliferasjon og differensiering. 6 Engineered cellekultur modeller, særlig lett gjøre det mulig for forstyrrelse av individuelle celler og deres mikromiljø.
En slik kultur modellen bruker en microfabrication basert tilnærming til ingeniør modell mammary epitelvev med kontrollert 3D-struktur som konsekvent og reproduserbart danner grener som vandrer sammen når indusert med enppropriate vekstfaktorer. Den store fordelen med modellen er evnen til nøyaktig å manipulere og måle effekten av fysiske og biokjemiske faktorer, slik som mønstre av mekaniske påkjenninger, med høy statistisk sikkerhet. Denne teknikken, sammen med beregnings modellering, har allerede blitt brukt for å bestemme de relative bidrag fra fysiske og biokjemiske signaler i veiledning av den normale utvikling av melke epitelvev og andre forgrenede epitel 7-11. Presenteres her er et detaljert protokoll for å bygge disse modell vev, som lett kan utvides til andre typer av celler og ekstracellulær matriks (ECM) geler, og som tjener som en potensiell verktøy for testing av terapeutiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Solutions
- For å fremstille en 5 mg / ml oppløsning av insulin, fortynne den pulveriserte insulin lager med 5 mM saltsyre (HCl) i dH 2 O (500 mg insulin i 100 ml løsemiddel). Fremstille 100 ml væske ved å tilsette 50 ul konsentrert HCI til 100 ml destillert vann (dH 2 O).
- For å gjøre en 1x oppløsning av PBS, fortynne 10x fosfat-bufret saltvann (PBS) forrådsoppløsning for å 1x med dH 2 O under sterile betingelser.
- Klargjør polydimetylsiloksan (PDMS) elastomer løsning som følger: Bland PDMS forpolymer sammen med herdemidlet i et 10: 1 (w: w) forhold.
- Fremstille cellekulturmediet som følger: Til 500 ml lager Dulbeccos modifiserte Eagle-medium: Nutrient Blanding F-12 (DMEM / F-12), tilsett 10 ml sterilt føtalt bovint serum (FBS), 500 pl av gentamicin-reagens, og 500 ul av 5 mg / ml insulin.
- For å fremstille 1% bovint serumalbumin (BSA) i 1 x PBS-oppløsning, tilsett 1% (vekt: V) løsning av BSA pulver til 1x PBS og bland godt.
- For å fremstille en 4 mg / ml oppløsning av nøytralisert bovin type I kollagen, tilsett 50 pl 10x Hanks balanserte saltløsning (HBSS) buffer, 30 pl 0,1 N natriumhydroksyd (NaOH), 30 pl cellekulturmedium, og 400 ul lager kollagen til en avkjølt 1,5 ml mikrosentrifugerør. Bland sakte ved å pipettere opp og ned; unngå å introdusere bobler. For å fjerne noen bobler, kort sentrifuger blandingen ved 4 ° C.
- Forbered en fiksativ løsning ved å fortynne 16% paraformaldehyde 1: 4 (v: v) i 1x PBS.
- Forbered en atomkjerner merking løsning ved å fortynne aksje kjerner merking løsning 1: 1000 (v: v) i 1x PBS.
- Fremstille en 0,3% fosfat-bufret saltvann og vaskemiddel (PBST) løsning ved å blande 1 x PBS med 0,3% (v: v) vaskemiddel.
- Forbered blokkering buffer ved å fortynne geit serum 01:10 (v: v) i 0,3% PBST.
- Forbered en primær antistoff løsning for et bestemt protein av interesse ved å fortynne priMary antistoff (for eksempel kanin anti-fokal adhesjonskinase (FAK)) 1: 200 (v: v) i blokkeringsbuffer.
- Fremstille et sekundært antistoff løsning ved fortynning av en fluorescerende probe-konjugert antistoff (for eksempel geit-anti-kanin) 1: 1000 (v: v) i blokkeringsbuffer.
2. Utarbeidelse av Elastomere stempler for 3D Micropatterning
Merk: Elastomere frimerker er laget med PDMS.
- Lag en PDMS løsning på samme forhold som beskrevet i trinn 1,3 og bland godt. Plasser blandingen i et vakuumkammer for 15-30 min for å fjerne eventuelle luftbobler som ble innført under blandeprosessen.
- Hell avgasset oppløsning inn i en plast veie båt eller petriskål inneholdende en silikonhoved som er litografisk mønster med noen av ønsket geometri. For best resultat, kurere PDMS løsning ved 60 ° C i ~ 12 timer.
Merk: silisium mestere kan tilpasses; denne protokollen bruker rektangulære strukturer med dimensjoner på 50mikrometer x 200 mikrometer x 50 mikrometer avstand 200 mikrometer fra hverandre. De silisium mestere kan gjøres ved hjelp av standard fotolitografi teknikker. I korthet, en epoksy-basert fotoresist spinn-belagt på toppen av en silisiumskive. En maske med informasjon om de ønskede stempel funksjonene er plassert på toppen av fotoresist-belagt skive, som deretter utsettes for UV-lys. De ønskede funksjoner som ikke er blokkert av masken blir utsatt for lys og fotoresisten på disse stedene blir tverrbundet, mens resten av fotoresistente belegget er oppløselig, og kan bli vasket bort. - Etter at PDMS er herdet rundt de ønskede funksjoner på silisium master, fjerne PDMS og herre fra plastbeholderen. Nøye skille PDMS fra silikonplaten og fjerne overflødig PDMS fra rundt trykt funksjoner ved hjelp av et rent barberblad.
- Nå kuttes de PDMS mønstrede med trykt funksjoner i individuelle rektangulære stempler (~ 8 mm x 5 mm) med et barberblad. Oppbevar disse funksjonen side opp i en cleen 100-mm-diameter petriskål.
- I tillegg bruker den PDMS løsning som er beskrevet i trinn 1,3 for å gjøre bærere for de rektangulære stempler.
- Ved hjelp av en spinne-belegger, spredt ~ 2-3 g av PDMS oppløsningen jevnt på en 100-mm-diameter petriskål og kurere PDMS til ~ 12 timer ved 60 ° C som i trinn 2.1. Deretter, ved hjelp av et barberblad, skjæres det tynne laget av PDMS i rektangler (~ 5 mm x 2 mm).
Merk: To bærere er nødvendig for hvert PDMS stempel laget i trinn 2,3. Bærerne kan være lagret i det 100 mm-diameter petriskål som inneholder PDMS frimerker. - Før PDMS stempler og bærere kan anvendes for cellekultur, sterilisere ved nedsenking i 70% etanol og tørr ved hjelp av en aspirator i et biosikkerhet kabinett (cellekultur hette).
3. Utarbeidelse av 3D epitelvev
- I et skap biosikkerhet, tilsette en dråpe på ca. 50 ul av 1% BSA i PBS til toppen av hvert stempel. Plasser den dråpe dekket stempler ved 4 ° C i en minimum av 4 timer for å sikre at BSA adsorberes til overflaten av stempelet.
- Sug BSA løsning fra PDMS frimerker.
- Vask overflatene av stemplene to ganger med cellekulturmedium (50 ul per vask pr stempel bør være tilstrekkelig), aspirere etter hver vask.
- Håndter steriliserte PDMS frimerker og støtter bruker buede rustfritt stål pinsett. I en biosikkerhet kabinett, legge ut en 35-mm-diameter vev kultur parabolen for hver PDMS stempel. I hver tallerken, legg ned to PDMS støtter atskilt med en avstand som er litt mindre enn lengden på PDMS frimerker.
- Ved hjelp av pinsett, sterilisere så mange sirkulære dekkglass (15 mm i diameter, # 1) som det er PDMS frimerker som bruker 70% etanol. Aspirer overflødig væske fra Dekk mens du holder dem med pinsett. Lagre de vaskede objektglassene i en separat 100-mm-diameter petriskål.
- Dispensere ~ 50 ul av kollagen blandingen til jevnt å belegge overflaten av hvert stempel PDMS.
- Plukke opphver kollagen-belagt PDMS stemple med pinsett og forsiktig snu dem. Senke inverterte frimerker på toppen av PDMS støtter lagt ut i 35-mm-diameter vevskultur konkav slik at kollagenet som er mellom stempelet og bunnen av vevskulturskål. Inkuber rettene ved 37 ° C i 30 minutter.
- Dispensere ~ 50 ul av den gjenværende kollagen blanding på hver av de sirkulære Dekkglass (senere, disse vil bli plassert på toppen av de konstruerte vev til fullstendig å kapsle disse inn i kollagen) og inkubere dem ved 37 ° C i 30 minutter.
- Få tak i en 100-mm-diameter vev kultur tallerken med epitelceller (ex. EpH4 mus mammary epitelceller) på ~ 40% konfluens. Aspirer cellekulturmediet og vaskes en gang med 10 ml 1 x PBS. Tilsett 2 ml trypsin til cellene og inkuberes ved 37 ° C i 5-10 min.
- Tilsett 8 ml friskt kulturmedium til vevskultur-skål inneholdende celler trypsinert, løsne eventuelle gjenværende adherente celler fra fatet. Bland forsiktig ved pipettering og flytte celleblandingen til en 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 100 x g i 5 min.
- Aspirer supernatanten fra den koniske rør og cellepelleten suspenderes i cellekulturmedium. Ved hjelp av et hemocytometer, telle cellene for å bestemme konsentrasjonen av suspensjonen. Juster volumet suspensjonen for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 10 ~ 6 -10 7 celler / ml.
- Fjern de gelerte kollagen prøver fra inkubatoren. Ved hjelp av pinsett, forsiktig løfte PDMS frimerker rett oppover for å løsne dem fra den støpte kollagen og kast dem.
- Dispensere ~ 30 pl av den konsentrerte cellesuspensjon på overflaten av hver kollagen gel inneholdende formede hulrom med ønsket geometri. Observer cellene under et lysfelt mikroskop med en 10X / 0,25 NA mål mens forsiktig risting retter side til side for å fremme celle bosetting inne i hulrommene. Hulrommene fylles i ~ 5 min.
- til rEDra overskytende celler fra rundt hulrommene, vipper hver vevskulturskål på sin side og forsiktig dispensere ~ 400 pl cellekulturmedium over overflaten av kollagen gel. Suge væske og gjenta vaske 1-2 ganger, kontroll av kollagen gelene under mikroskop mellom hver vask.
- Etter at det overskytende celler er blitt fjernet fra hele cellefylte hulrom i formen kollagen, plasserer vevskulturskåler i en cellekulturinkubator ved 37 ° C i 15 min. Deretter, ved hjelp av pinsett, forsiktig invertere kollagen-belagt klassen Dekk og plassere dem på toppen av cellefylte kollagen former slik at kollagen fra dekk danner et lokk over cellen fylte hulrom. Prøvene inkuberes ved 37 ° C i 15 min.
- Når hettene kollagen har klebet til cellen fylt kollagen mugg, dispensere ~ 2-2,5 ml cellekulturmedium langsomt over dekkglass på toppen av gelene. Culture prøvene ved 37 ° C i 1-3 dager.
notat:24 timer etter innledende såing, kan epitelvev bli behandlet med vekstfaktorer så som epidermal vekstfaktor (EGF) eller hepatocytt vekstfaktor (HGF) for å indusere forgrening.
4. immunfluorescens og bildeanalyse
- Aspirer cellekulturmediet fra vevet kulturskåler og legger nok fiksativ løsning for å dekke celleholdige geler. Inkuber rettene ved romtemperatur i 15 min på en rister ved 200 rpm.
- Aspirer fiksativ, fylle vevskulturskåler med 1 x PBS, og inkuber ved romtemperatur i 15 min på en rister ved 200 rpm. Gjenta to ganger for tre totalt vasker.
- Å merke kjerner: Aspirer PBS fra vevet kultur fatet og erstatte med Hoechst løsning. Inkuber ved romtemperatur i 15-20 min. Å farge for FAK eller annen markør som er synlig med antistoffer, hopp til trinn 4.5.
- Aspirer atom merking løsningen og vask den celle-inneholdende gels tre ganger med 1 x PBS som beskrevet i trinn 4.2. Farget prøvene kan lagres i 1 x PBS ved 4 ° C inntil videre anvendelse.
- For å farge for et protein av interesse: Aspirer PBS fra vevet kulturskåler, tilsett 300 ul 0,3% PBST, og inkuber prøven ved romtemperatur i 15 min.
- Aspirer PBS, dekke geler med blokkeringsbuffer og inkuber på en ristemaskin (200 rpm) ved romtemperatur i ~ 4 timer.
- Aspirer blokkeringsbuffer, dekke geler med primær antistoffløsning, og inkuberes på en ristemaskin ved 200 rpm over natten ved 4 ° C.
- Aspirer primær antistoffløsning, tilsett 0,3% PBST løsning, og inkuberes på en rystemaskin ved 200 opm ved romtemperatur i 30 min. Aspirer PBST og gjenta hvert 30 min i 3-4 timer.
- Gjenta trinn 4,7 og 4,8, denne gang inkubasjon med det sekundære antistoff oppløsningen. Pakk vevskulturskåler med aluminiumsfolie for å forhindre fotobleking av det sekundære antistoff. Etter final vask, kan fargede prøvene oppbevares i 1 x PBS ved 4 ° C inntil videre anvendelse.
- For å visualisere prøvene, bruk en 10X / 0,30 NA objektiv fokusert på midtplanet av epitelvev.
- For å visualisere cellekjerner, bilde fast prøver merket med et kjernefysisk markør ved hjelp av en 10X / 0,30 NA mål under UV-belysning.
- For å visualisere prøvene farget for et protein av interesse, bilde ved hjelp av et 10X / 0,30 NA objektiv på et invertert fluorescens mikroskop.
- For å lage frekvens kart protein farging av flere vev (vanligvis 50 eller flere) med identisk innledende geometri, først import hvert av bildene ved hjelp av standard programvare for bildeanalyse (se Materials) og konvertere dem til 8-bits gråtoner.
- Å terskel disse bildene, konvertere dem til binære (dvs. halvtone / svart og hvit) ved å definere et gråtonebilde cutoff punkt; gråtone verdier under terskelen blir svart, og de over terskelen blir hvite. Deretter kombinerehver av de enkelte binære bilder til et enkelt bilde stabel.
- Deretter registrere stablet bilder (dvs. justere eller matche dem) i analyseprogramvare. Mange bildeanalyse programvarepakker kommer med en fritt tilgjengelig registrering plugin.
- Bruk hvert bilde i en stabel som en mal for justering av det neste bildet, slik at bildene i hele stabelen er på linje med forplantning. Til slutt, for å overlay (prosjekt) bildene i justert bildestakk basert på middels intensitet danne et enkelt bilde med en piksel frekvens kartet. Dette bildet kan da være fargekodet hjelp av programvare for valg 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generelt skjematisk av mammary epitelvev microfabrication
En generell skjematisk av microfabrication prosedyre som beskriver den eksperimentelle arbeidet strømningen er vist i figur 1. Sluttresultatet er en matrise av epitelvev med identisk geometri og avstanden som er fullstendig integrert i en ECM-gel. Et representativt eksperiment benytter EpH4 mouse mammary epitel-celler dyrket i en gel av bovin type I kollagen i en konsentrasjon på 4 mg / ml. For å sikre den høyeste kvaliteten av konstruerte vev, bør de teknikkene som er beskrevet i protokollen følges nøye. 2A og 2B viser lav og høy forstørrelse utsikt over matriser av rektangulære brønner som er støpt inn i en type I kollagen gel før celle seeding. Formen av brønnene blir bestemt av formen på funksjonene til silisium masteren. Det er viktig å løfte the PDMS mugg rett opp fra kollagen for ikke å forvrenge hulrommet geometri. Figur 2C viser rektangulære brønner i en type I kollagen-gel som er blitt fylt med mammary epitelceller (skytende celler har blitt vasket av overflaten av kollagen). I dette eksempel inneholder hver 200 um x 50 um rektangulær vel ca. 80-100 celler.
Tilsetning av vekstfaktorer induserer morfogenese
24 timer etter såing, kan vev bli behandlet med vekstfaktorer så som EGF eller HGF og dyrket over flere dager for å modellere forgrening morfogenese. Vanligvis grenene begynner å dannes så tidlig som 4 timer etter stimulering vekstfaktor. Figur 3A viser representative resultater fra rektangulære mammary epitelvev i en type I kollagen-gel 24 timer etter microfabrication prosedyre, hvoretter cells har klebet til kollagen og til hverandre. Det er ingen grener er observert før vekstfaktor tilsetningen. Figur 3B viser et representativt rektangulær vev som har gjennomgått en forgrening 24 timer etter tilsetningen av HGF ved 10 ng / ml. I dette tilfellet, grener forekommer ved endene av vev (i motsetning til midten), hvor cellene opplever den høyeste mekaniske påkjenninger 9. Flere vev av identisk innledende geometri i den samme gelen kan så avbildes for å bestemme populasjons gjennomsnitt av gren plassering og gren lengde, slik at high-throughput-analyse.
Immunfluorescens farging for å visualisere protein lokalisering
Immunfluorescens farging av vev arrays i kulturmodell tillater oss å bestemme protein lokalisering i en vev med høy statistisk sikkerhet. Figur 4A viser reprerepresentanten resultater fra en forgrening rektangulær mammary epitelvev farget for fokale vedheft kinase (FAK). Oppretting av frekvens kartene over vev med identisk geometri kan anvendes for å visualisere den gjennomsnittlige romlige lokalisering av proteiner av interesse i vev, som kan sammenlignes med lokalisering av andre proteiner, så vel som forgrenings aktivitet. Figur 4B viser en frekvens kart over gjennomsnittet FAK farging for 50 vev viser FAK berikelse på kortenden av rektangulære vev, hvor forgrening vanligvis oppstår.
Figur 1. Skjematisk skisserte microfabrication prosedyren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bilder som er tatt under microfabrication prosessen. (A) Lav og (B) og høy forstørrelse fase kontrast av rektangulære hulrom i type I kollagen opprettet ved hjelp av en elastomer PDMS mold. (C) Hulrom fra (A) og (B) er fylt med mammary epitelceller. Skala barer, 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Microfabricated vev gjennomgår forgrening morphogenesis. (A) Phase kontrast bilde av en representant rektangulær vev 24 timer etter microfabrication. (B) Fase-kontrast bilde av en represen rektangulær vev som har begynt å gjennomgå forgrening 24 timer etter tilsetningen av HGF ved 10 ng / ml. Hvite piler indikerer nydannede grener. Skala barer, 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Immunfluorescens farging av microfabricated vev. (A) Immunofluorescens farging for FAK i en mammary epitelvev etter initiering gren. (B) En frekvens kart over gjennomsnittet FAK farging i 50 vev. Skala barer, 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David & Lucile Packard Foundation, Camille & Henry Dreyfus Foundation, og Burroughs Velkommen fondet. ASP ble støttet delvis av en Charlotte Elizabeth Procter honorific Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
- Affolter, M., et al. Tube or not tube: remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Dev Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K signaling in the regulation of branching morphogenesis. Biosystems. 109 (3), 403-411 (2012).
- Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201 (2006).
- Fata, J. E., et al. The MAPK(ERK-1,2) pathway integrates distinct and antagonistic signals from TGFalpha and FGF7 in morphogenesis of mouse mammary epithelium. Dev Biol. 306 (1), 193-207 (2007).
- Ip, M. M., Darcy, K. M. Three-dimensional mammary primary culture model systems. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 1 (1), 91-110 (1996).
- Lo, A. T., Mori, H., Mott, J., Bissell, M. J. Constructing three-dimensional models to study mammary gland branching morphogenesis and functional differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 103-110 (2012).
- Nelson, C. M., Vanduijn, M. M., Inman, J. L., Fletcher, D. A., Bissell, M. J. Tissue geometry determines sites of mammary branching morphogenesis in organotypic cultures. Science. 314 (5797), 298-300 (2006).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Endogenous patterns of mechanical stress are required for branching morphogenesis. Integr Biol (Camb). 2 (9), 424-434 (2010).
- Gjorevski, N., Nelson, C. M. Mapping of mechanical strains and stresses around quiescent engineered three-dimensional epithelial tissues. Biophys J. 103 (1), 152-162 (2012).
- Gjorevski, N., Piotrowski, A. S., Varner, V. D., Nelson, C. M. Dynamic tensile forces drive collective cell migration through three-dimensional extracellular matrices. Sci Rep. 5, 11458 (2015).
- Zhu, W., Nelson, C. M. PI3K regulates branch initiation and extension of cultured mammary epithelia via Akt and Rac1 respectively. Dev Biol. 379 (2), 235-245 (2013).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Hirai, Y., et al. Epimorphin functions as a key morphoregulator for mammary epithelial cells. J Cell Biol. 140 (1), 159-169 (1998).
- Pavlovich, A. L., Manivannan, S., Nelson, C. M. Adipose stroma induces branching morphogenesis of engineered epithelial tubules. Tissue Eng Part A. 16 (12), 3719-3726 (2010).
