Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54540
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1, 4, 1,5
1Davee Department of Neurology and Clinical Neurosciences, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Center for Molecular Innovation and Drug Discovery, Northwestern University, 3Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 4High Throughput Analysis Laboratory, Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, 5Department of Physiology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

وقد تم التعرف على التفاعل بين القنوات HCN وحدة فرعية المعاونة لها كهدف العلاجية في اضطراب اكتئابي. هنا، وهي طريقة القائم على الاستقطاب مضان لتحديد مثبطات جزيء صغير من هذا التفاعل البروتين البروتين، ويرد.

Abstract

يتم التعبير عن دوري (HCN) قنوات بوابات النوكليوتيدات تنشيط فرط بتواجد مطلق في جميع أنحاء الدماغ، حيث أنها تعمل على تنظيم استثارة الخلايا العصبية. وينظم توزيع التحت خلوية من هذه القنوات في الخلايا العصبية الهرمية من منطقة قرن آمون CA1 من tetratricopeptide التي تحتوي على تكرار Rab8b التفاعل البروتين (TRIP8b)، وهي فرعية مساعدة. خروج المغلوب الجيني للHCN المسام تشكيل مفارز أو TRIP8b، سواء تؤدي إلى زيادة في المضادة للاكتئاب مثل السلوك، مما يشير إلى أن الحد من وظيفة من القنوات HCN قد يكون من المفيد لعلاج اكتئابي اضطراب (MDD). على الرغم من الاهتمام كبيرة العلاجية، ويتم التعبير عن قنوات HCN أيضا في القلب، حيث أنها تنظم النظمية. للتحايل على القضايا بعيدا عن الهدف المرتبطة بسد قنوات HCN القلب، واقترحت مختبرنا مؤخرا استهداف تفاعل البروتين البروتين بين HCN وTRIP8b من أجل تعطيل تحديدا HCN وظيفة القناة في الدماغ.TRIP8b يربط المسام HCN تشكيل مفارز في موقعين التفاعل متميزة، على الرغم من هنا يتم التركيز على التفاعل بين تكرار tetratricopeptide (TPR) مجالات TRIP8b وC ذيل محطة من HCN1. في هذا البروتوكول، وصفا وسعت من طريقة لتنقية TRIP8b وتنفيذ شاشة إنتاجية عالية للتعرف على مثبطات جزيء صغير من التفاعل بين HCN وTRIP8b، يوصف. طريقة لفحص عالية الإنتاجية يستخدم لالإسفار الاستقطاب (اف ب) المستندة إلى الفحص لمراقبة ربط جزء TRIP8b كبير إلى أحد عشر الموسومة fluorophore الأمينية الببتيد حمض المقابلة لمحطة ذيل HCN1 مئوية. هذه الطريقة تسمح للمركبات 'ضرب' الكشف عن هويته بناء على التغير في استقطاب الضوء المنبعث. ثم يتم إجراء فحوصات التحقق للتأكد من أن 'ضرب' المركبات ليست مصطنعة.

Introduction

وأعرب (HCN) قنوات بوابات النوكليوتيدات دوري تنشيط فرط في القلب والجهاز العصبي المركزي حيث أنها تلعب دورا هاما في تنظيم غشاء استثارة 1. قد تورطت قنوات HCN في التسبب في اضطراب اكتئابي (MDD) 2، مما أدى إلى عدة مجموعات أقترح أن الحد HCN قناة ظيفة دواء قد يكون فعالا لعلاج جديدة لMDD 3. ومع ذلك، تستهدف بشكل مباشر قنوات HCN ليس قابلا للتطبيق بسبب دورها الهام في العمل إمكانية القلب 4. ايفابرادين، وافقت ادارة الاغذية والعقاقير الوحيدة HCN قناة خصم، ويستخدم لعلاج قصور القلب لإحداث تأثير بطيء القلب 5. على هذا النحو، هناك حاجة لوكلاء الصيدلانية التي تحد من HCN وظيفة القناة حصريا في الجهاز العصبي المركزي.

Tetratricopeptide أكرر التي تحتوي على Rab8b التفاعل البروتين (TRIP8b) هو SPECI الدماغالمرورية فرعية المساعدة من القنوات HCN التي تسيطر على التعبير السطحية وتوطين قنوات HCN 6،7. خروج المغلوب الجيني للTRIP8b يؤدي إلى الحد من القنوات HCN الدماغ 7 دون أن يؤثر ذلك التعبير HCN في قلب 8. ومن المثير للاهتمام، TRIP8b الفئران خروج المغلوب تنفق أقل وقت متحرك على المهمة مهمة السباحة القسري وتعليق الذيل 7، وهما تستخدم عادة اختبارات الكشف عن فعالية المضادة للاكتئاب 9-11. وتشير هذه النتائج أنه بدلا من استهداف مباشر قنوات HCN مع خصم جزيء صغير من وظيفة قناة HCN، وتعطيل التفاعل بين TRIP8b وHCN قد تكون كافية لإنتاج مضادات الاكتئاب مثل السلوك.

TRIP8b يربط HCN في موقعين ملزمة متميزة. المجال ملزم النوكليوتيدات الحلقية (CNBD) من HCN يتفاعل مع المجال المحافظ في محطة N TRIP8b تقع إلى المجالات TPR من TRIP8b 12،13. على الرغم من أن بقايا من CNBD التي تشارك في هذاالتفاعل تم تعيين 14، لم يتم تضييق منطقة TRIP8b التي تشارك أسفل إلى أبعد من-80-الأحماض الأمينية جزء 13. يحدث التفاعل الثاني بين tetratricopeptide تكرار (TPR) مجالات TRIP8b وC ثلاثي الببتيد من محطة HCN ( 'SNL "في HCN1، HCN2، وHCN4، ولكن" ANM "في HCN3) 3،12. التركيب البلوري حلها مؤخرا 15 من هذا التفاعل C ذيل كشف التشابه الهيكلي الكبير للتفاعل بين مستقبلات استيراد peroxisomal، peroxin 5 (PEX5)، والشركاء التفاعل فيها، تتضمن نوع 1 peroxisomal تستهدف تسلسل (PTS1) 16.

على الرغم من أن كلا الموقعين التفاعل المطلوب من أجل وظيفة قناة HCN، والتفاعل بين المجالات TPR من TRIP8b وC محطة ثلاثي الببتيد من HCN1 بمثابة موقع ملزم المهيمن وينظم التعبير سطح HCN. لذلك، وقد تم اختيار هذا التفاعل كموقع الاستهداف في هذه الدراسة.للفترة المتبقية من المخطوطة، عندما يتم إشارة إلى التفاعل بين TRIP8b وHCN، وهذا هو التفاعل الذي يتم المشار إليها. ولخص هذا التفاعل بشظية للذوبان عالية من TRIP8b المقابلة لمحطة لها C المحفوظة التي تحتوي على مجالات TPR اللازمة لربط C الذيل من محطة HCN (بقايا 241-602 من 1A-4 الإسوية من TRIP8b) 3.

من أجل تطوير شاشة إنتاجية عالية لتحديد جزيئات صغيرة قادرة على تعطيل هذا التفاعل، والاستقطاب مضان (FP) القائم على الفحص كان يعمل 17. ويستند الاستقطاب مضان على الإثارة ليجند الموسومة fluorophore مع الضوء المستقطب، وقياس درجة الاستقطاب في مضان المنبعثة 18. في وجود شريك ملزمة، يتم تقييد الحركة الدورانية ليجند الفلورسنت والضوء المستقطب ينبعث 19. في حالة عدم وجود شريك ملزم، رانه الحركة الدورانية ليجند يؤدي إلى انبعاث الضوء استقطابها.

في البروتوكول المرفق، يتم تقديم وسيلة لتنقية N الموسومة محطة (6xHis) TRIP8b (241-602) باستخدام حمض النيكل Nitrilotriacetic (ني NTA) الخرز. كان يعمل بروتوكول مماثل لتنقية الجلوتاثيون-S ترانسفراس (GST) -tagged C محطة 40 الأحماض الأمينية من HCN1 (HCN1 C40) المستخدمة في الخطوة 7 من البروتوكول. لاعتبارات الفضاء، تم حذف وصفا مفصلا لهذا الإجراء.

في الخطوات من 2 إلى 7 من البروتوكول، وقدم فحص سير العمل عالية الإنتاجية (انظر الشكل 1). تفاعلات البروتين البروتين هي هدف بالغ الصعوبة لارتفاع فحص الإنتاجية وننصح القراء للبحث عن موارد إضافية حول هذا الموضوع 20.

الخطوات 2 و 3 من الإجراء تميز تقارب في المختبر من TRIP8b تنقيته (241-602) بناء FOرا فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) -tagged أحد عشر الببتيد من الأحماض الأمينية الموافق الذيل C محطة من HCN1 (HCN1 FITC). وبناء على التركيب البلوري للTRIP8b-HCN معقد 15، وهذا جزء حمض أميني أحد عشر كافية لإنتاج ملزم مع TRIP8b (241-602). في الخطوة 2، يتم قياس K د من التفاعل من قبل المعايرة TRIP8b (241-602) في تركيز ثابت من HCN1 FITC. في الخطوة 3، ومعاير نسخة الخالي من الملصقات من الببتيد HCN المستخدمة في الخطوة 2 إلى تركيز ثابت من كل من TRIP8b (241-602) وHCN1 FITC لفحص إذا العلامة FITC يتداخل مع ملزمة. هذه التجارب ضرورية لاختيار التركيزات المناسبة من TRIP8b (241-602) وHCN1 FITC المستخدمة في شاشة إنتاجية عالية.

فرضية الشاشة عالية الإنتاجية هو أن جزيء صغير قادر على تعطيل التفاعل بين (241-602) TRIP8b وHCN1 FITC سوف تنتج ديسمبرrease في الضوء المستقطب. في الخطوة 4، يتم حساب عامل Z للمقايسة 21 لتركيز معين من TRIP8b (241-602) وHCN1 FITC للتأكد من أن الاختبار هو المناسب لفحص إنتاجية عالية (الخطوة 5). الخطوات 6 و 7 فحوصات التحقق للتأكد من أن يضرب المحددة في الشاشة الرئيسية إنتاجية عالية يعملون عن طريق تعطيل التفاعل بين TRIP8b (241-602) وHCN1 FITC وليس من خلال آلية غير محددة. في الخطوة 6، carboxytetramethylrhodamine (طمرة) -labeled HCN1 الببتيد (HCN1 طمرة) هي المستخدمة في فحص مضان الاستقطاب خلاف مماثل لتصفية مركبات الفلورسنت التي تؤثر سلبا على فحص FP باستخدام علامة FITC. خطوة 7 تستخدم أكبر HCN1 C محطة جزء (HCN1 C40) ويعمل فحص قرب القائم على حبة، والتي تقوم على 'الأنفاق' من الأكسجين القميص من حبة المانحة إلى حبة متقبل إلى ما يقرب من واحد آخر من خلال التفاعل البروتينات 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تنقية TRIP8b (241-602) البروتين

  1. تحويل البلازميد التي تحتوي على TRIP8b (241-602) في بكتيريا تعبير البروتين ناقلات pGS21 3 إلى E. المختصة القولونية للتعبير البروتين وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. لوحة 300 ميكرولتر من الثقافة على لوريا مرق (LB) -agar مع 5 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول والأمبيسلين. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
  2. في اليوم التالي، واختيار مستعمرة واحدة لتطعيم 50 مل LB مع 50 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول والأمبيسلين. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة (مع الهز).
  3. إضافة ثقافة 50 مل الى 1 لتر من LB مع 50 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز.
  4. وبمجرد أن الثقافة قد وصلت إلى OD 600 قراءة 0،8-1،2، تغيير درجة حرارة الحاضنة إلى 18 درجة مئوية وإضافة IPTG (الآيزوبروبيل بيتا-D-Thiogalactoside) إلى التركيز النهائي من 1 ملم. السماح للتعبير البروتين المضي قدما لمدة 16 ساعة.
  5. تدور باستمرار E. القولونية في 6000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير البكتيريا. بعد إزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي، والحفاظ على البكتيريا على الجليد لمدة المتبقية من هذا الإجراء. Resuspend والبكتيريا في 36 مل من الاحتياطي ومع 0.25 ملم من الفلورايد phenylmethanesulfonyl (PMSF).
  6. يصوتن البكتيريا معلق على الجليد باستخدام الترباس شقة لمدة 5-10 دقائق، بالتناوب بين 30 ثانية 'على' و 30 ثانية "خارج" في عالية الطاقة.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة إضافية إذا طاف ليست واضحة بعد.
  8. تطبيق طاف على عمود من 2 حبات مل ني NTA. احتضان لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف.
  9. السماح للمواد غير منضم إلى تدفق من خلال العمود ويغسل مع 500 مل من ألف الاحتياطي
  10. غسل العمود مع 250 مل من الاحتياطي B.
  11. غسل العمود مع 125 مل من الاحتياطي وتستكمل مع 5 ملي ايميدازول.
  12. أزل البروتين جيئة وذهابام العمود مع 20 مل شطف العازلة.
  13. إضافة بروتين مزال لغسيل الكلى كاسيت (الوزن الجزيئي قطع - 10 كيلو دالتون) باستخدام حقنة. Dialyze البروتين لمدة 60 دقيقة في 4 L الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية.
  14. نقل كاسيت غسيل الكلى إلى 4 الجديدة L دلو من برنامج تلفزيوني الباردة. Dialyze البروتين لمدة 16 ساعة في 4 درجة مئوية.
  15. في صباح اليوم التالي، والتحقق من تركيز البروتين باستخدام Coomassie عدة البروتين فحص باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تركيز البروتين باستخدام مكثف البروتين، باتباع إرشادات الشركة المصنعة، وإذا لوحظ تركيز أقل من 40 ميكرومتر. قسامة والتجميد في -80 درجة مئوية لمدة التخزين.

2. صغيرة الحجم الإسفار الاستقطاب الفحص لوصف التفاعل من شظايا البروتين اثنين

  1. ذوبان الجليد 200 ميكرولتر من 40 ميكرومتر TRIP8b (241-602) وإضافته إلى أنبوب 1.5 مل. إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى 11 إضافية 1.5 مل أنابيب.
  2. أداء التخفيفات المسلسل عن طريق نقل 100 ميكرولتر من TRIP8b (241-602) من الأنبوب الأصلي إلى أنبوب القادم في هذه السلسلة، pipetting صعودا وهبوطا، وتكرار هذه العملية. هذا وسوف تنتج سلسلة من 12 نقطة من التخفيفات 2-أضعاف من TRIP8b (241-602) تتراوح ،01-40 ميكرومتر.
  3. إعداد مزيج الرئيسي 650 ميكرولتر من 0.1 ميكرومتر HCN1 FITC (6.5 ميكرولتر من قسامة 10 ميكرومتر) و 2 ملي Dithiothreitol (DTT) في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: مزيج الرئيسي هو 2X.
  4. انشاء 12 الجديدة 1.5 مل أنابيب. إضافة 50 ميكرولتر من مزيج الرئيسي يحتوي على HCN1 FITC لكل أنبوب، ثم إضافة 50 ميكرولتر من كل من التخفيفات المسلسل 12.
    ملاحظة: هذا سيولد 12 الأنابيب، تحتوي كل منها على 0.05 ميكرومتر HCN1 FITC ونصف تركيز TRIP8b (241-602) من التخفيف المتسلسل الأصلي.
  5. إضافة سلسلة التخفيف إلى لوحة الفحص، 30 ميكرولتر لكل بئر، في ثلاث نسخ. استخدام منخفضة ملزمة الصلبة السوداء 384 لوحة جيدا.
  6. تدور لوحة وأو 2 دقيقة في 900 x ج في RT.
  7. قراءة لوحة باستخدام قارئ صفيحة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. قياس الاستقطاب مضان باستخدام المعلمات القياس التالية: 485 نانومتر الإثارة، 530 الانبعاث نانومتر، 505 مرآة مزدوج اللون نانومتر، و 100 مللي ثانية الوقت التكامل.
  8. رسم القيم الاستقطاب (MP) مقابل (241-602) تركيز على مقياس لوغاريتمي من TRIP8b. احتواء البيانات مع المعادلة هيل لتحديد تقارب (K د) من TRIP8b (241-602) لالببتيد HCN1 المسمى.
    ملاحظة: لإعداد التخفيفات المسلسل، ويمكن أيضا لوحة متعددة جيدا أن تستخدم بدلا من الأنابيب.

3. دراسة التفاعل البروتين البروتين عن طريق التحكم الإيجابي

  1. إضافة 200 ميكرولتر من الببتيد HCN1 الخالي من الملصقات (200 ميكرومتر) إلى أنبوب 1.5 مل. إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني إلى 11 إضافية 1.5 مل أنابيب. أداء التخفيفات المسلسل عن طريق نقل 100 ميكرولتر من الأنبوب الذي يحتوي 200 ميكرولتر من الببتيد إلى الأنبوب الأول100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. تكرار هذه العملية لتوليد 12 الأنابيب مع 2 التخفيفات أضعاف من الببتيد HCN1 الخالي من الملصقات.
  2. إعداد مزيج الرئيسي 650 ميكرولتر من 0.2 ميكرومتر HCN1 FITC و 4 ميكرومتر TRIP8b (241-602).
    ملاحظة: هذا هو الحل 2X.
  3. إضافة 50 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى 12 الجديدة 1.5 مل أنابيب.
  4. إضافة 50 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي إلى أنبوب 1.5 مل.
  5. تحميل السوداء 384 بئر وحة microtiter في ثلاث نسخ، بإضافة 30 ميكرولتر لكل بئر.
  6. أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 2 دقيقة في 900 x ج في RT.
  7. قراءة لوحة باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية قادرة على تنظيم الأسرة. استخدام نفس الإعدادات كما هو موضح في الخطوة 2.7.
  8. حساب تقارب من الببتيد الخالي من الملصقات لTRIP8b (241-602) باستخدام المعادلة تشنغ Prusoff: K د 1 = IC 50 / (1 + [L] / ك د 2)، حيث K د 1 يمثل تقارب من ليس لها علامة يتم تحديد الببتيد لTRIP8b (241-602)، وجيم 50 في الخطوة السابقةوتمثل قدرة يجند الخالي من الملصقات لتهجير يجند المسمى، [L] هو تركيز يجند المسمى في الخطوة 3.2 و K د 2 هو تقارب من TRIPb (241-602) ليجند المسمى.

4. تقييم الفحص الأداء (حساب Z عامل)

  1. إعداد مزيج الرئيسي بجعل حل 12 مل من العازلة FP مع 2 ميكرومتر TRIP8b (241-602)، 50 نانومتر HCN1 FITC، و1 ملم DTT في FP العازلة.
    ملاحظة: وهذا يتطلب 60 ميكرولتر من 40 ميكرومتر TRIP8b (241-602)، 60 ميكرولتر من 10 ميكرومتر HCN1 FITC، و1،080 ميكرولتر من FP العازلة.
  2. إضافة 30 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى كل بئر من أسود 384 بئر وحة microtiter.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من 1 ملم الخالي من الملصقات الببتيد HCN1 إلى 192 بئرا لتكون بمثابة مراقبة إيجابية.
  4. إضافة 1 ميكرولتر من العازلة FP إلى 192 بئرا لتكون بمثابة سيطرة سلبية.
  5. أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 2 دقيقة في 900 x ج في RT.
  6. قراءة لوحة باستخدام ميلالقارئ croplate.
  7. حساب معامل Z لفحص باستخدام المعادلة التالية: Z = 1-3 * (σ نقاط البيع -σ NEG) / (μ NEG -μ نقاط البيع) حيث نقاط البيع σ σ وNEG هي الانحرافات المعيارية من الآبار الإيجابية والسلبية السيطرة ، ونقاط البيع ميكرون وNEG ميكرون تمثل متوسط إشارات في الآبار الإيجابية والسلبية السيطرة.

شاشة 5. عالية الإنتاجية

  1. ذوبان الجليد aliquots من TRIP8b (241-602) وHCN1 FITC والاحتفاظ بها على الجليد.
  2. إعداد 10 مل من TRIP8b (2 ميكرومتر) وHCN1 FITC (50 نانومتر) في المخزن FP.
  3. الاستغناء عن 25 ميكرولتر من الخليط في كل بئر من أدنى ملزم 384 بئر وحة microtiter السوداء باستخدام ماصة.
  4. لفحص المكتبة، إضافة مركبات في كل بئر من الأعمدة 3-22 (40 ميكرومتر تركيز النهائي لكل منها) باستخدام معالج السائل الصوتية.
    ملاحظة: نظرا لrelativelذ بلغ معدل منخفض لاحظ مع هذا الاختبار، وكان يتم تجميع اثنين من مركبات مختلفة في بئر واحد. تم اختبار المركبين من كل بئر نشط في وقت لاحق على حدة لتحديد أي الممنوحة النشاط.
  5. إضافة 100 نيكولا لانغ من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى كل بئر من الأعمدة 1 و 23 من كل لوحة تحكم سلبية.
  6. إضافة الخالي من الملصقات الببتيد HCN1 في كل بئر من الأعمدة 2 و 24 من كل لوحة الضوابط الإيجابية.
  7. احتضان لوحات في RT لمدة 2 ساعة. قراءة لوحات أو احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة قبل القراءة.
  8. قياس الاستقطاب مضان على قارئ لوحة. استخدام نفس الإعدادات كما هو موضح في الخطوة 2.7.
  9. حساب في المئة عن طريق تثبيط تطبيع الإشارات باستخدام متوسط ​​الضوابط الإيجابية والسلبية من كل لوحة إلى 100٪. استخدام المعادلة XN = 100٪ * ((X NEG - X) / (X NEG - X نقاط البيع)) حيث X N هو تثبيط في المئة تطبيع الموافق إشارة X، X نقاط البيع NEG هو إشارة من آبار المراقبة السلبية.

6. التأكيد من الفعالية عن طريق الكلمات الدلالية طمرة-HCN الببتيد

  1. التحقق من صحة يضرب مع أكثر من 50٪ تثبيط استخدام المسمى طمرة-HCN1 الببتيد (HCN1 تمرة).
    1. إعداد مزيج الرئيسي من 12 مل من 2 ميكرومتر TRIP8b (241-602) و 50 نانومتر عازلة HCN1 طمرة في تنظيم الأسرة.
    2. الاستغناء عن 25 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل بئر من أسود 384 بئر وحة microtiter.
    3. نقل التخفيفات المسلسل من كل المركبات النشطة في آبار منها. جعل اثنين من التخفيفات أضعاف بحيث تركز كل ضرب يتراوح من 0.2 ميكرومتر إلى 200 ميكرومتر.
    4. لردود الفعل السلبية السيطرة، ونقل 100 نيكولا لانغ من DMSO في كل بئر. لمراقبة إيجابية إضافة 100 نيكولا لانغ من تخفيفه بشكل متسلسل الببتيد HCN1 الخالي من الملصقات مع التركيز النهائي تتراوح بين 200μM إلى 0.1μM.
    5. احتضان لوحة في RTلمدة 2 ساعة. قراءة لوحات أو احتضان لمدة 16 ساعة عند 4 ° C قبل القراءة.
    6. قياس الاستقطاب مضان (MP) باستخدام المعلمات القياس التالية: 535 نانومتر الإثارة. 580 نانومتر الانبعاثات. 535 مرآة مزدوج اللون نانومتر و 20 مللي ثانية الوقت التكامل.
    7. حساب IC 50 القيم من المناسب تركيز البيانات FP تعتمد كل مجمع باستخدام أربعة معلمة نموذج الانحدار غير الخطية 23.

7. التحقق من صحة الجرعة والاستجابة من الفحص القرب تستند الخرزة،

  1. ذوبان الجليد 1 قسامة من TRIP8b صاحب الموسومة (241-602) (صاحب-TRIP8b) وضريبة السلع والخدمات الموسومة HCN1 (GST- HCN1 C40) بروتينات اندماج والاحتفاظ بها على الجليد.
  2. الجمع بين صاحب-TRIP8b مع GST-HCN1 C40 في المخزن فحص بتركيزات من 400 نانومتر صاحب-TRIP8b و 40 نانومتر GST HCN1 C40. إعداد 300 ميكرولتر من الخليط لكل مجمع لفحصها.
    يتم تشغيل المركبات في ثلاث نسخ في 11 تركيزات مختلفة بالإضافة إلى DM: مذكرةSO التحكم (أي مركب).
  3. لآبار المراقبة، وإعداد 30 ميكرولتر من صاحب-TRIP8b (200 نيوتن متر) من دون ضريبة السلع والخدمات، HCN1C40 ثم إعداد حدة 30 ميكرولتر من GST-HCN1C40 (20 نانومتر) من دون صاحب-TRIP8b العازلة في الفحص.
  4. لكل مجمع لفحصها، إضافة 7 ميكرولتر من صاحب-TRIP8b: خليط GST-HCN1 C40 (المعد في الخطوة 7.2 أعلاه) إلى 36 بئرا من لوحة باستخدام ماصة 16 قناة. لاختبار مركب واحد، وترتيب 12 تركيزات مختلفة في صفوف القاعدة ومكررات ثلاثة في الأعمدة 1-3. إضافة 7 ميكرولتر من محلول صاحب-TRIP8b (المعد في 7.3) إلى أعمدة 1-3 الصف M و 7 ميكرولتر من حل GST-HCN1 C40 (المعد في 7.3) إلى أعمدة 1-3 من N. صف باختصار أجهزة الطرد المركزي لوحة ل ضمان السوائل هي في الجزء السفلي من كل بئر ولإزالة أي فقاعات.
  5. الاستغناء عن مركبات ضرب لفحصها في لوحة بحيث تركز كل ضرب يتراوح من 200 ميكرومتر (في الصف أ) وصولا إلى 0.1 ميكرومتر (في الصف K). الاستغناء عن وبلغ حجم التداولDMSO في صفوف LN يطابق كمية من مركب الاستغناء في صفوف حزب العدالة والتنمية.
  6. يهز لوحة لمدة 2 دقيقة واحتضان لمدة 2.5 ساعة عند RT.
  7. تمييع الخرز القابل مكافحة GST 01:50 العازلة مع الفحص.
  8. إضافة 3.5 ميكرولتر من الخرز القابل المخفف إلى كل بئر من لوحة مع ماصة 16 قناة وتخلط بواسطة pipetting بلطف لتجنب خلق فقاعات.
  9. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
  10. تمييع الخرز المانحة النيكل كلات 01:50 العازلة مع الفحص. لا تعرض الخليط إلى الضوء.
  11. إضافة 3.5 ميكرولتر من الخرز المانحة المخفف إلى كل بئر من لوحة مع ماصة 16 قناة وتخلط بواسطة pipetting بلطف لتجنب خلق فقاعات.
  12. احتضان لوحة لمدة 1.5 ساعة على RT في الظلام.
  13. قراءة في قارئ لوحة. استخدام قارئ لوحة مع المعلمات القياس التالية: 40 ميللي ثانية الإثارة مرة، 100 مرة الانبعاثات مللي ثانية، 0.1 مم الارتفاع الكشف.
  14. حساب IC 50 القيم التي كتبها بيانات مناسبة لمجموعة شرق افريقياح مركب باستخدام أربعة معلمة نموذج الانحدار غير الخطية 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتجنب قضايا حق المؤلف مع المنشور السابق، تم استخدام مسبار الموسومة طمرة-HCN1 طمرة لتوليد أرقام 2 و 3. لاحظ أن هذا الاستبدال لم تسهم في إحداث فرق ملموس في النتائج، وبروتوكولات مماثلة لتلك المبينة أعلاه مع HCN1 FITC. لتقييم تفاعل مع HCN1 طمرة، TRIP8b (241-602) كان معاير الى تركيز ثابت من HCN1 طمرة باستخدام بروتوكول موضح في الخطوة 2 (الشكل 2). بعد ذلك، تم إجراء التجربة هو موضح في الخطوة 3 ومعاير الخالي من الملصقات HCN1 الببتيد إلى تركيز ثابت من TRIP8b (241-602) وHCN1 طمرة (الشكل 3).

للتحقق من أن الفحص كان مناسبة لفحص عالية الإنتاجية، تم فحص أدائها المقبل بواسطة بروتوكول في الخطوة 4؛ وعامل Z 0.تم الحصول على 89، مشيرا إلى أن الفحص كان على استعداد لفحص إنتاجية عالية (الشكل 4). ثم تم عرض مكتبة جزيء صغير 20000 مركب من الإجراءات الموضحة في الخطوة 5. ثم تم اختبار جميع المركبات التي لديها نسبة تثبيط فوق 50٪ في فحص FP الثاني مع HCN1 طمرة (الخطوة 6). وأخيرا، تم اختبار الفعالية أكد على مقربة الفحص القائمة على حبة (الخطوة 7، الشكل 5). واحد مركب ضرب، NUCC-5953، تم تحديد نتيجة هذه التجارب.

شكل 1
الشكل 1: HTS سير العمل التخطيطي واصفا سير العمل لارتفاع فحص الإنتاجية. عائدات الرسم من الأعلى إلى الأسفل، مع كل مثلث يمثل خطوة في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: K د من التفاعل البروتين البروتين (A) تخطيطي يظهر التجربة هو موضح في الخطوة 2. كما TRIP8b (241-602) ومعاير إلى تركيز ثابت من HCN1 طمرة، المجالات TPR من TRIP8b (باللون الرمادي) مأزق لالببتيد حمض أميني 11 (باللون الأسود، مع 'SNL "محطة الضوء). (ب) وتركيز TRIP8b (241-602) يزيد، وتصبح أكثر الجزيئات HCN1 طمرة زيادات المربوطة والاستقطاب (K D = 0.320.01μM). أشرطة الخطأ دلالة على الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3) الرقم 3: معاير IC 50 من تحكم إيجابي (A) تخطيطي التظاهر النموذج التجريبي للخطوة 3. كما الخالي من الملصقات الببتيد HCN1 الى تركيز ثابت من TRIP8b (241-602) وHCN1 طمرة، تم تهجير الببتيد المسمى. (ب) لاحظ أن إشارة النقصان كما تركز زيادات HCN1 غير المسماة، مشيرا إلى تشريد HCN1 طمرة (IC 50 = 1.070.08μM). أشرطة الخطأ دلالة على الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
نتائج ممثل النتائج من HTS (A) من ارتفاع الشوري الإنتاجية: الرقم 4. يقوم reen باستخدام بروتوكول موضح في الخطوة 5. كل نقطة على الرسم البياني تمثل مركب واحد. يتم تحديد إحداثيات X و Y من تثبيط في المئة في كل شوط. (ب) نتائج من الشاشة تآمرت مع الضوابط الإيجابية والسلبية (انظر أسطورة). متوسط ​​تثبيط في المئة لكل منهما المجمع (عبر اثنان أشواط للمقايسة) المرسومة على المحور Y. (C) نتائج من التجارب FP التأكيدي باستخدام HCN1 الببتيد المسمى طمرة. ثم استخدمت مركبات تظهر أكبر من 50٪ تثبيط في الخطوة 5 في الخطوة 6. كما في الفقرة (أ)، والعاشر ويتم تحديد الإحداثيات Y من تثبيط في المئة في اثنان أشواط من الفحص. مستنسخة من هان وآخرون. 3. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

40 / 54540fig5.jpg "/>
الرقم 5: القرب الفحص القائمة على حبة (A) تخطيطي يظهر قرب الفحص القائمة على حبة. TRIP8b (241-602) يحتوي على N محطة hexahistidine العلامة التي تربط النيكل كلات الخرز المانحة (دائرة مع المشارب). HCN1 C40 يحتوي على N ضريبة السلع والخدمات النهائية العلامة التي تربط حبات متقبل. عندما أحضر إلى القرب من التفاعل من المجالات TPR من TRIP8b وC ثلاثي الببتيد محطة من HCN1، الإثارة حبة المانحة من 680 نانومتر ضوء الطول الموجي وتنتج الأكسجين القميص. هذا القميص نقل الأكسجين إلى طاقة متقبل الخرز داخل دائرة نصف قطرها محدد ويؤدي إلى انبعاث الضوء. (ب) المعايرة زيادة تركيزات ضرب مجمع (NUCC-5953) في تركيز ثابت من TRIP8b (241-602) وHCN1 C40. مستنسخة من هان وآخرون. 3. أشرطة الخطأ دلالة على الانحراف المعياري.الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بسبب إمكاناتها كهدف علاجي في MDD 24، كان هناك اهتمام كبير في النهج الدوائية التي تعادي HCN وظيفة القناة في الجهاز العصبي المركزي (4). ومع ذلك، فقد تعثرت هذه الجهود من خلال الدور الهام للقنوات HCN في pacemaking القلب وخطر عدم انتظام ضربات القلب 25. نحن مسبب أن تعطيل التفاعل بين HCN والدماغ فرعية المساعدة المحددة لها، TRIP8b 8، قد تكون كافية لإنتاج الآثار المضادة للاكتئاب مثل دون التأثير على قنوات HCN القلب 3. وقد تعززت هذه الفرضية عن طريق ملاحظة أن الفئران التي تفتقر TRIP8b يظهرون سلوكا المضادة للاكتئاب مثل 7. يمكن أن يستهدف هذا التفاعل تصبح نموذجا جديدا لعلاج MDD.

بروتوكول مفصلة لتحديد مثبطات جزيء صغير من التفاعل بين المجالات TPR من TRIP8b وC محطة ثلاثي الببتيد من HCN1 هوعرضت أعلاه. لتسهيل التطبيق العام، فإننا هنا وصف المنطق لدينا والتي أدت إلى تطوير هذا الاختبار. على الرغم من أن TRIP8b تربط لمفارز HCN في موقعين، ركزنا على التفاعل بين المجالات TPR من TRIP8b وC الذيل من محطة HCN. لتوضيح الهيكلي لهذا التفاعل من قبل البلورات بالأشعة السينية كشفت جيب عميق شكلتها المجالات TPR من TRIP8b حول محطة C من HCN 15. يحدث ثاني التفاعل TRIP8b-HCN بين امتداد 80 الأحماض الأمينية من TRIP8b (الموجود N محطة إلى المجالات TPR) والنوكليوتيدات نطاق دوري ملزم من HCN. يحدث هذا التفاعل عبر العديد من الأحماض الأمينية المختلفة لكل من البروتين ويشكل سطح منتشر مع عدد أقل من التفاعلات بين الجزيئات واضحة المعالم (26). وبناء على هذه الملاحظات الهيكلية، نحن مسبب أن التفاعل بين المجالات TPR من TRIP8b ومحطة C من HCN أكثر عرضة للتعطيل من قبل inhi جزيء صغيرbitor.

في البداية، تم استخدام جزء كبير من TRIP8b في مقايسة على أساس افتراض أن بناء أطول قد يكون المواقع التنظيمية تفارغي وتزيد من فرصة للنجاح. وقد استخدمت كامل طول TRIP8b في البداية، ولكن كان هذا النهج محدودة من البروتين التجميع، وتدهور، والحساسية لتجميد أذاب دورات. وفي وقت لاحق، وهما الحجم انتقالية تربط بين TRIP8b يبني، وهي أطول واحد (بقايا 219-602) واحدة أقصر (بقايا 259-602)، تم اختبار أمام بناء وسيطة (بقايا 241-602) وقد تم اختيار. على الرغم من أن كل من truncations أربعة المذكورة أعلاه تحتوي على المجالات ذات الصلة نظام الحماية المؤقت للربط إلى محطة C من HCN، لم يكن سوى استنساخ طول المتوسط ​​(241-602) مستقرة بما فيه الكفاية لاستخدامها في فحوصات الفرز. على وجه الخصوص، كنا قادرين على الحصول على كميات كبيرة من البروتين بعد تنقية بواسطة ني 2+ تقارب اللوني من دون خطوات انفصال إضافية.

بعد تختارونهجي جزء مناسب من TRIP8b وHCN، نحن مصممون المقبل تقارب من الببتيد HCN1 المسمى لTRIP8b (241-602). وكقاعدة عامة، يمكن إجراء القياس الدقيق إلا إذا كان تركيز يجند يقل كثيرا عنه K D الشريك ملزم 28. في حالتنا، كنا 50 نانومتر من الببتيد HCN1 المسمى للتجربة في الخطوة 2، وحصل على K D من 0.320.01μM. لاعتبارات تصميم أكثر التجريبية بشأن تفاعلات البروتين البروتين، والقراء وأشار إلى واحدة من العديد من الاستعراضات ممتازة على الموضوع 27-30.

وبمجرد أن تحدد K D من الببتيد HCN1 المسمى لTRIP8b (241-602)، ونحن بعد ذلك تحديد إذا كانت التسمية نفسها يتداخل مع ملزمة. في الخطوة 3، حصلنا على قيمة IC 50 من 1.070.08 ميكرومتر المعايرة الببتيد HCN1 الخالي من الملصقات الى تركيز ثابت من TRIP8b (241-602) لتهجير الببتيد المسمى. جنبا إلى جنب مع K D لل وصفت الببتيد لTRIP8b (241-602)، وتطبيق المعادلة تشنغ Prusoff، فإننا ثم يقدر تقارب من الببتيد الخالي من الملصقات لTRIP8b (241-602)، وK D = 0.93μM. هذا هو في وثيقة الاتفاق مع تقارب من TRIP8b (241-602) لالببتيد المسمى، ويشير إلى أن وصفها الببتيد لم تؤثر بشكل كبير تقارب لTRIP8b. سمة هامة من سمات شاشة أساس الاستقطاب ومضان هي إشارة ممتازة إلى نسبة الضوضاء كما هو مبين من قبل عامل Z 0.89. مع غيرها من المعالم نفسه، وأملى على حجم التغير في إشارة FP بحجم الشريك ملزم (TRIP8b (241-602)) وحجم يجند المسمى fluorophore. لوحظ تغير في الاستقطاب (44-224 MP) مع 11 الأمينية يجند حمض الببتيد بين دولها الحرة والمرتبطة مع ~ 42 كيلو دالتون TRIP8b (241-602) بروتين كاف لإنتاج التفاعل الهادف ويوفر مجموعة ديناميكية كافية لفحص المكتبة.

ntent "> واحدة من التحديات من أي الإنتاجية العالية فحص فحص وتمييز صحيح 'ضرب' المركبات من تغييرات مصطنعة في شدة الإشارة. وفي شاشات القائم على الاستقطاب مضان، فإنه من الشائع للعديد من المركبات إما تتفاعل مباشرة مع fluorophore أو يتألق على خاصة بهم. وللتغلب على هذه القضايا، وصفت إجراء الفحص على مرحلتين باستخدام اثنين fluorophores متميزة أعلاه. يقلل هذا الإجراء من احتمال أن المركبات الفلورية والمركبات تتفاعل مباشرة مع fluorophore سوف تقدم خلال عملية الفرز، بالإضافة إلى ربط fluorophore ، بعض المركبات بمثابة "تجميع" في المختبر، وتؤدي إلى تغييرات غير محددة في إشارة مضان الاستقطاب. ويعتقد أن هذه المركبات لتشكيل المنظفات الحساسة الهياكل micellar وتمنع تفاعلات البروتين البروتين 31،32. وللتخفيف من هذه الآثار، فمن المهم أن المخزن المؤقت مضان الاستقطاب المستخدمة في ارتفاعبروتوكول فحص الخرج المبينة أعلاه تشمل المنظفات (تريتون)، على الرغم من التحقق من صحة إضافية مع المنظفات الأخرى ينبغي النظر فيها.

وتجدر الإشارة إلى أن هناك العديد من القيود الهامة من إجراءات الفحص المذكورة أعلاه. على الرغم من أن TRIP8b يربط HCN في موقعين، الشاشة المذكورة أعلاه تبحث فقط موقع التفاعل واحدة ولن تحديد الجزيئات الصغيرة التي تستهدف التفاعل CNBD. وبالمثل، لن يتم التعرف على المركبات التي تعدل allosterically TRIP8b ملزمة لHCN من خلال التفاعل مع TRIP8b في منطقة محطة N كما يضرب. كل من هذه الاعتبارات هي نتيجة لاستخدام جزء TRIP8b أصغر (انظر أعلاه)، والتي تضمن استنساخ في فحوصات الفرز المبينة في هذا الإجراء. من أجل تجنب هذه القيود، يمكن توجيه الجهود المستقبلية في استخدام شاشة خلية القاعدة دمج الكامل HCN طول وTRIP8b يبني 33،34. هذا النوع من الشاشة قد تعتمد على ر عاليةhroughput الطرق الكهربية من أجل تحديد مركبات قادرة على تعطيل التفاعل بين HCN وTRIP8b، والحد من حرية تعبير من القنوات HCN على سطح الخلية. من المذكرة والنهج مثل هذه يجب أن يشمل مكافحة شاشات للتأكد من أن جزيئات صغيرة لم يحد مباشرة HCN وظيفة القناة كما الخصوم، لأن ذلك قد يؤدي إلى آثار الهدف خارج في الجسم الحي.

على الرغم من HCN1، HCN2، وHCN4 جميعا محفوظ 'SNL "الببتيد C المحطة، وبقايا N محطة لهذا ثلاثي الببتيد تختلف إلى حد كبير، ومن المرجح تؤثر على تقارب ملزمة TRIP8b. وهذا يثير احتمال أن جزيء صغير ضرب الحصول عليها عن طريق الشاشة أو مصممة على أساس مركبات ضرب أخرى قد توفر HCN الإسوي خصوصية في تعطيل التفاعل TRIP8b-HCN. في الشاشة الأصلية، وقد تم تحديد NUCC-5953 كأول جزيء صغير قادر على تعطيل التفاعل بين TRIP8b وHCN1 3. الع المستقبلك مع هذا الاختبار قد تحدد مثبطات إضافية جزيء صغير مع الخصائص الكيميائية مرغوب فيه لتطوير الأدوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ni-NTA agarose  Qiagen 30210
Dialysis cassette  ThermoFisher 66456
Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside  Sigma-Aldrich I5502 - 1 gr
384-Well Black plate  Corning 3820
Proxiplate  Perkin-Elmer  6008289
Anti-GST Acceptor beads  Perkin-Elmer  6760603C
NiChelate Perkin-Elmer  AS101D
pGS21-a Genscript SD0121
PMSF Sigma-Aldrich 10837091001
Coomassie Kit ThermoFisher 23200
Protein concentrator ThermoFisher 88527
Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader Perkin-Elmer  #2300-001M
BL21 (DE3) Competent Cells Agilent 200131

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
  2. Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).
  3. Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
  4. Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
  5. Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
  6. Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
  7. Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
  8. Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
  9. Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
  10. Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
  11. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  12. Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
  13. Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
  14. Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
  15. Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
  16. Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
  17. Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
  18. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  19. Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
  20. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
  23. Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
  24. Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
  25. Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
  26. DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
  27. Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
  28. Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
  29. Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  30. Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
  31. Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
  32. McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
  33. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  34. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 117، وفحص عالية الإنتاجية، واكتشاف المخدرات، وتفاعلات البروتين البروتين، مضان الاستقطاب، HCN، TRIP8b
طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M.,… More

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M., Schiltz, G. E., Ismail, Q. A., Cheng, X., Luan, C. H., Chetkovich, D. M. Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b. J. Vis. Exp. (117), e54540, doi:10.3791/54540 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter