Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Published: November 11, 2016 doi: 10.3791/54540
Automatic Translation
*1, *1, 2, 3, 1, 1, 4, 1,5
1Davee Department of Neurology and Clinical Neurosciences, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Center for Molecular Innovation and Drug Discovery, Northwestern University, 3Department of Pharmacology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 4High Throughput Analysis Laboratory, Department of Molecular Biosciences, Northwestern University, 5Department of Physiology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University
* These authors contributed equally

Summary

De interactie tussen HCN kanalen en hun ondersteunende subunit is geïdentificeerd als een therapeutisch doel in depressieve stoornis. Hier wordt een fluorescentie-polarisatie- methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van dit eiwit-eiwit interactie, gepresenteerd.

Abstract

-Hyperpolarization cyclisch-nucleotide-gated (HCN) kanalen zijn een rode draad door de hersenen, waar ze functioneren om de prikkelbaarheid van neuronen reguleren uitgedrukt. De subcellulaire verdeling van deze kanalen in piramidale neuronen in de hippocampus CA1 gebied wordt geregeld door tetratricopeptide-repeat bevattende Rab8b interactie eiwit (TRIP8b), een extra subunit. Genetische knockout HCN porievormende subeenheden of TRIP8b, beide leiden tot een toename antidepressivum-achtige gedrag, wat suggereert dat het beperken van de werking van HCN kanalen bruikbaar voor de behandeling van depressieve stoornis (MDD) kan zijn. Ondanks aanzienlijk therapeutisch belang zijn HCN kanalen ook tot uiting in het hart, waar ze reguleren ritmiek. Af-target problemen geassocieerd met cardiale blokkeren HCN kanalen omzeilen, heeft ons lab onlangs voorgesteld gericht op de eiwit-eiwit interacties tussen HCN en TRIP8b teneinde specifiek verstoren HCN kanaal functie in de hersenen.TRIP8b bindt aan HCN porievormende subeenheden op twee verschillende interactie sites, maar hier ligt de nadruk op de interactie tussen de tetratricopeptide repeat (TPR) domeinen van TRIP8b en de C-terminale staart van HCN1. In dit protocol, een geëxpandeerde beschrijving van een werkwijze voor het zuiveren TRIP8b en uitvoeren van een hoge doorvoer screen aan kleinmoleculige remmers van de interactie tussen HCN en TRIP8b identificeren beschreven. Werkwijze voor high throughput screening gebruikt een fluorescentie polarisatie (FP) gebaseerde assay te controleren de binding van een groot fragment TRIP8b een fluorofoor-gelabeld elf aminozuur peptide dat overeenkomt met de HCN1 C terminale staart. Deze methode maakt treffer verbindingen te identificeren gebaseerd op de verandering in de polarisatie van het uitgezonden licht. Validatie testen worden dan uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de 'hit' verbindingen zijn niet kunstmatig.

Introduction

-Hyperpolarization cyclisch-nucleotide-gated (HCN) kanalen worden uitgedrukt in het hart en het centrale zenuwstelsel waar ze een belangrijke rol in het reguleren membraan prikkelbaarheid 1 spelen. HCN kanalen zijn geïmpliceerd bij de pathogenese van depressieve stoornis (MDD) 2, die verschillende groepen heeft geleid tot voorstellen beperken HCN kanaalfunctie farmacologisch effectief als een nieuwe behandeling voor MDD 3 kan zijn. Echter direct gericht HCN kanalen niet levensvatbaar vanwege hun belangrijke rol in de cardiale actiepotentiaal 4. Ivabradine, de enige FDA goedgekeurde HCN kanaal antagonist wordt gebruikt voor de behandeling van hartfalen een Bradycardie 5 produceren. Als zodanig is er een behoefte aan farmacologische middelen die HCN kanaalfunctie uitsluitend in het centrale zenuwstelsel te beperken.

Tetratricopeptide herhaal-bevattende Rab8b interactie eiwit (TRIP8b) is een brein specific extra subunit van HCN kanalen die de oppervlakte-expressie en lokalisatie van HCN kanalen 6,7 regelt. Genetische knock-out van TRIP8b zorgt voor een vermindering van de hersenen HCN kanalen 7 zonder dat HCN expressie in het hart 8. Interessant TRIP8b knockout muizen besteden minder tijd onbeweeglijk over de gedwongen zwemmen taak en staart schorsing taak 7, twee veelgebruikte screening tests voor de antidepressieve werking 9-11. Deze resultaten suggereren dat in plaats van direct targeting HCN kanalen met een klein molecuul antagonist van HCN kanalen functie verstoren van de interactie tussen TRIP8b en HCN kan voldoende zijn om antidepressivum-achtige gedrag produceren.

TRIP8b bindt aan HCN in twee verschillende bindingsplaatsen. De cyclische nucleotide bindend domein (CNBD) HCN samenwerkt met een geconserveerd domein van TRIP8b gelegen N terminal naar de TPR-domeinen van TRIP8b 12,13. Hoewel de resten van de CNBD die betrokken zijn bij dezeinteractie zijn in kaart gebracht 14 is TRIP8b regio die betrokken is niet ingeperkt voorbij een-80-aminozuurfragment 13. Een tweede interactie plaatsvindt tussen de tetratricopeptide repeat (TPR) domeinen van TRIP8b en de C-terminale tripeptide van HCN ( 'SNL' in HCN1, HCN2 en HCN4, maar 'ANM in HCN3) 3,12. Het onlangs opgelost kristalstructuur 15 van deze C staart interactie onthulde aanzienlijke structurele gelijkenis met de interactie tussen de peroxisomale import receptor, peroxin 5 (Pex5), en de interactie partners, met type 1 peroxisomale targeting sequenties (PTS1) 16.

Hoewel beide interactieplaatsen zijn vereist voor HCN kanaalfunctie, de interactie tussen de TPR-domeinen van TRIP8b en de C-terminale tripeptide van HCN1 dient als de dominante bindingsplaats en reguleert HCN oppervlakte-expressie. Daarom werd deze interactie gekozen als targeting site in deze studie.Voor de rest van het manuscript Wanneer verwezen wordt naar de interactie tussen TRIP8b en HCN, is deze interactie die wordt aangeduid. Deze interactie wordt herinnerd aan een sterk oplosbaar fragment van TRIP8b overeenkomstig zijn geconserveerde C eind bevattende de TPR-domeinen nodig zijn voor binding van het C-terminale staart van HCN (residuen 241-602 van de 1a-4 isovormen van TRIP8b) 3.

Om een hoge doorvoer screen kleine moleculen die het ontwrichten van de interactie kaart te brengen, een fluorescentie polarisatie (FP) gebaseerde assay werd toegepast 17. Fluorescentiepolarisatie is gebaseerd op de excitatie van een fluorofoor-gelabeld ligand met gepolariseerd licht, en het meten van de mate van polarisatie van de uitgezonden fluorescentie 18. In aanwezigheid van een bindingspartner, wordt de rotatiebeweging van de fluorescerende ligand beperkt en gepolariseerd licht uitgezonden 19. Bij gebrek aan een bindingspartner, thij rotatiebeweging van de ligand leidt tot de emissie van gedepolariseerde licht.

In de bijgevoegde protocol, wordt een werkwijze voor het zuiveren van N-terminale tag (6xHis) TRIP8b (241-602) middels nikkel-Nitrilotriazijnzuur (Ni-NTA) kralen gepresenteerd. Een soortgelijk protocol werd toegepast om de glutathion-S-transferase (GST) gemerkte C-terminale 40 aminozuren van HCN1 (HCN1 C40) toegepast in stap 7 van het protocol zuiveren. Voor ruimte overwegingen, een gedetailleerde beschrijving van deze procedure werd weggelaten.

In de stappen 2 tot en met 7 van het protocol, is een high throughput screening workflow gepresenteerd (zie figuur 1). Eiwit-eiwit interacties zijn een notoir moeilijk doelwit voor high throughput screening en de lezers worden geadviseerd om te zoeken naar extra middelen op het onderwerp 20.

Stap 2 en 3 van de procedure te karakteriseren de in vitro affiniteit van het gezuiverde TRIP8b (241-602) te construeren fora fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) gemerkte elf aminozuur peptide dat overeenkomt met de C-terminale staart van HCN1 (HCN1 FITC). Gebaseerd op de kristalstructuur van de TRIP8b HCN-complex 15 Deze elf aminozuur segment voldoende is om binding met TRIP8b (241-602). In stap 2 wordt de Kd van de interactie gemeten door titratie TRIP8b (241-602) in een vaste concentratie van HCN1 FITC. In stap 3 wordt een ongemerkt versie van de HCN peptide in stap 2 getitreerd in een vaste concentratie van zowel TRIP8b (241-602) en FITC HCN1 te onderzoeken of de FITC tag interfereert met binding. Deze experimenten zijn essentieel voor het selecteren van de geschikte concentraties van TRIP8b (241-602) en HCN1 FITC gebruikt bij de hoge doorvoer screen.

Het uitgangspunt van de high throughput scherm is dat een klein molecuul in staat is het verstoren van de interactie tussen TRIP8b (241-602) en HCN1 FITC zal een december producerenrease in gepolariseerd licht. In stap 4 wordt de Z-factor van de test berekende 21 voor een bepaalde concentratie van TRIP8b (241-602) en FITC HCN1 dat de bepaling geschikt zijn voor high throughput screening (stap 5) is. Stappen 6 en 7 zijn validatie testen om te bevestigen dat de klappen die in de primaire hoge doorvoer screen handelen door het verstoren van de interactie tussen TRIP8b (241-602) en HCN1 FITC plaats van via een niet-specifieke mechanisme. In stap 6, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) -gemerkte HCN1 peptide (HCN1 TAMRA) wordt gebruikt in een overigens identieke fluorescentie polarisatie assay fluorescerende verbindingen die de FP test met het FITC tag compromis filteren. Stap 7 gebruikt een groter HCN1 C terminale fragment (HCN1 C40) en maakt gebruik van een bead based proximity assay die is gebaseerd op het 'tunneling' van singlet zuurstof uit een donor kraal een acceptor kraal bracht dicht bij elkaar door interagerende proteïnen 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Zuivering van TRIP8b (241-602) Protein

  1. Transformeer de plasmide dat TRIP8b (241-602) in de bacteriële eiwit expressievector pGS21 3 in competente E. coli voor eiwitexpressie volgens de instructies van de fabrikant. Plaat 300 pl van de kweek op Luria Broth (LB) -agar met 5 ug / ml chlooramfenicol en ampicilline. Incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende 16 uur.
  2. De volgende dag, kies een enkele kolonie voor het enten van 50 ml LB met 50 ug / ml chlooramfenicol en ampicilline. Incubeer de kweek bij 37 ° C gedurende 16 uur (onder schudden).
  3. Voeg 50 ml cultuur 1 L LB met 50 ug / ml ampicilline. Incubeer bij 37 ° C onder schudden.
  4. Zodra de kweek een OD 600 lezing van 0,8-1,2 heeft bereikt, verandert de temperatuur van de incubator op 18 ° C en voeg IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactoside) tot een eindconcentratie van 1 mM. Eiwitexpressie laten verlopen gedurende 16 uur.
  5. Spin down de E. coli bij 6000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C om de bacteriën te pelleteren. Na verwijdering van de buizen uit de centrifuge, houdt de bacteriën op ijs gedurende de rest van de procedure. Resuspendeer de bacteriën in 36 ml buffer A met 0,25 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF).
  6. Ultrasone trillingen de geresuspendeerde bacteriën op het ijs met een platte bout voor 5-10 min, afwisselend 30 sec 'aan' en 30 sec 'off' op hoog vermogen.
  7. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Centrifugeer gedurende nog 15 min als de supernatant is nog niet duidelijk.
  8. Breng de supernatant op een kolom van 2 ml Ni-NTA-parels. Incubeer gedurende 60 minuten bij 4 ° C onder voorzichtig schommelen.
  9. Zodat het gebonden materiaal door de kolom te stromen en wassen met 500 ml buffer A.
  10. Was de kolom met 250 ml buffer B.
  11. Was de kolom met 125 ml buffer A aangevuld met 5 mM imidazol.
  12. Elueer het eiwit weerm de kolom met 20 ml elutiebuffer.
  13. Voeg het geëlueerde eiwit aan een dialyse cassette (molecuulgewicht cutoff - 10 kDa) met een injectiespuit. Dialyseer het eiwit gedurende 60 min in 4 liter koude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C.
  14. Verplaats de dialyse cassette in een nieuw 4 L emmer koud PBS. Dialyseren eiwit gedurende 16 uur bij 4 ° C
  15. De volgende ochtend, controleer de eiwitconcentratie met behulp van een Coomassie eiwit assay kit volgens de instructies van de fabrikant. Concentreer het eiwit met een eiwit concentrator volgens de instructies van de fabrikant, als een concentratie lager dan 40 uM waargenomen. Aliquot en bevriezen bij -80 ° C voor opslag.

2. Small Scale Fluorescentie Polarisatie Assay om de interactie van de twee eiwitfragmenten karakteriseren

  1. Dooi 200 ul van 40 uM TRIP8b (241-602) en voeg deze toe aan een 1,5 ml buis. Voeg 100 pl PBS tot 11 extra 1,5 ml buizen.
  2. Voer seriële verdunningen door het overdragen van 100 pl TRIP8b (241-602) van de oorspronkelijke buis naar de volgende buis in de reeks, en neer te pipetteren, en het proces te herhalen. Dit is een 12-punts serie 2-voudige verdunningen van TRIP8b (241-602) die varieert 0,01-40 urn.
  3. Bereid een 650 pi Master Mix van 0,1 uM HCN1 FITC (6,5 pi van een 10 pM monster) en 2 mM dithiothreitol (DTT) in PBS.
    Opmerking: de master mix is ​​2x.
  4. Opzetten 12 nieuwe 1,5 ml buizen. Voeg 50 ul van de master mix met HCN1 FITC aan elke buis en voeg 50 ul van elk van de 12 seriële verdunningen.
    Opmerking: Dit zal 12 buizen genereren, die elk 0,05 uM HCN1 FITC en de helft van de concentratie van TRIP8b (241-602) van de originele seriële verdunning.
  5. Voeg de verdunningsreeks aan een testplaat, 30 ul per putje, in drievoud. Gebruik een lage bindende effen zwarte 384-wells plaat.
  6. Spin de plaat fof 2 min bij 900 x g bij kamertemperatuur.
  7. Lees de plaat met behulp van een microplaat lezer volgens de instructies van de fabrikant. Meet de fluorescentie-polarisatie met behulp van de volgende meting parameters: 485 nm excitatie, 530 nm emissie, 505 nm dichroïsche spiegel, 100 msec integratie tijd.
  8. Plot de polarisatie (mp) waarden versus de TRIP8b (241-602) de concentratie op een logaritmische schaal. Bij de data met de Hill-vergelijking met de affiniteit (Kd) te bepalen van TRIP8b (241-602) voor het gelabelde peptide HCN1.
    Opmerking: Voor het verkrijgen van seriële verdunningen, kan een multi-well plaat ook worden vervangen door buizen.

3. Bestudeer de eiwit-eiwit interactie met behulp van een positieve controle

  1. Voeg 200 ul ongemerkt HCN1 peptide (200 uM) aan een 1,5 ml buis. Voeg 100 pl PBS tot 11 extra 1,5 ml buizen. Voer seriële verdunningen door het overdragen van 100 gl van de buis met 200 ui van peptide aan de eerste buisvan 100 gl PBS. Herhaal dit proces tot 12 buizen met 2-voudige verdunningen van ongemerkt peptide HCN1 genereren.
  2. Bereid een 650 ul master mix van 0,2 uM HCN1 FITC en 4 uM TRIP8b (241-602).
    Opmerking: Dit is een 2x oplossing.
  3. Voeg 50 ul van master mix tot 12 nieuwe 1,5 ml buizen.
  4. Voeg 50 ul van elke seriële verdunning tot een 1,5 ml buis.
  5. Laad de zwarte 384-well microtiterplaat in drievoud, het toevoegen van 30 ul per putje.
  6. Centrifugeer de plaat gedurende 2 min bij 900 x g bij kamertemperatuur.
  7. Lees de plaat met behulp van een microplaat reader staat FP. Gebruik dezelfde instellingen zoals beschreven in stap 2.7.
  8. Bereken de affiniteit van het ongelabelde peptide TRIP8b (241-602) met de Cheng-Prusoff vergelijking: K d 1 = IC50 / (1 + [L] / Kd 2), waarbij Kd 1 de affiniteit van de ongelabelde TRIP8b peptide (241-602), IC50 wordt bepaald in de voorgaande stapen geeft het vermogen van de niet-gemerkte ligand aan het gemerkte ligand te verdringen, [L] is de concentratie van de gelabelde ligand in stap 3,2, en Kd 2 is de affiniteit van TRIPb (241-602) voor het gelabelde ligand.

4. Evalueer Assay Prestatie (Bereken Z Factor)

  1. Bereid een master mix door een 12 ml oplossing van FP buffer met 2 uM TRIP8b (241-602), 50 nM FITC HCN1, en 1 mM DTT buffer in FP.
    Opmerking: Dit wordt 60 pl 40 pM TRIP8b (241-602), 60 pl 10 pM HCN1 FITC en 1080 pl FP buffer vereisen.
  2. Voeg 30 ul van de master mix aan elk putje van een zwarte 384-well microtiterplaat.
  3. Voeg 1 pl 1 mM ongemerkt HCN1 peptide 192 putjes te dienen als een positieve controle.
  4. Voeg 1 pl FP buffer 192 putjes te dienen als een negatieve controle.
  5. Centrifugeer de plaat gedurende 2 min bij 900 x g bij kamertemperatuur.
  6. Lees de plaat met behulp van een microplate lezer.
  7. Bereken de Z-factor voor de test volgens de volgende formule: Z = 1-3 * (σ -σ pos neg) / (μ -μ neg pos) waarin σ en σ pos neg de standaardafwijkingen van de positieve en negatieve controleputjes en μ en μ pos neg vertegenwoordigen de gemiddelde signalen in de positieve en negatieve controles.

5. High Throughput Scherm

  1. Dooi porties van TRIP8b (241-602) en HCN1 FITC en bewaar ze op ijs.
  2. Bereid 10 ml van TRIP8b (2 pm) en HCN1 FITC (50 Nm) in FP buffer.
  3. Verdeel 25 ul van het mengsel in elk putje van een lage bindende 384 putjes zwarte microtiterplaat met een pipet.
  4. Voor bibliotheek screening verbindingen toe te voegen in elk putje van de kolommen 3-22 (40 uM eindconcentratie voor elk) met een akoestische vloeistofhandler.
    Let op: Als gevolg van de relatively lage hit rate waargenomen met deze test werden twee verschillende verbindingen samengevoegd tot één goed. De twee verbindingen uit elk putje werden vervolgens actief individueel getest om te bepalen welke de activiteit verleend.
  5. Voeg 100 nl van Dimethylsulfoxide (DMSO) in elk putje van de kolommen 1 en 23 van elke plaat als negatieve controles.
  6. Voeg ongelabelde HCN1 peptide in elk putje van de kolommen 2 en 24 van elke plaat als positieve controles.
  7. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. Hier platen of incuberen bij 4 ° C gedurende 16 uur voor het lezen.
  8. Meet de fluorescentie polarisatie op een bord lezer. Gebruik dezelfde instellingen zoals beschreven in stap 2.7.
  9. Bereken percentage remming van genormaliseerd signalen berekenen van de gemiddelde positieve en negatieve controles van elke plaat als 100%. Gebruik de vergelijking XN = 100% * ((X neg - X) / (X neg - X pos)), waarin X N is het genormaliseerde percentage remming overeenkomt met het signaal X, X pos negatieve X is het signaal van de negatieve controle wells.

6. Bevestiging van Hits behulp TAMRA-tag HCN Peptide

  1. Valideren raakt met meer dan 50% remming met behulp van TAMRA-gelabelde HCN1 peptide (HCN1 TAMRA).
    1. Bereid een master mix van 12 ml van 2 micrometer TRIP8b (241-602) en 50 Nm HCN1 TAMRA in FP buffer.
    2. Verdeel 25 ul van de master mix in elk putje van een zwarte 384-well microtiterplaat.
    3. Transfer seriële verdunningen van elke werkzame verbindingen in de respectieve putjes. Voeg tweevoudige verdunningen zodanig dat de concentratie van elke hit varieert van 0,2 uM tot 200 uM.
    4. Voor de negatieve controle reacties dragen 100 nl van DMSO in elk putje. Voor de positieve controle voeg 100 nl van serieel verdund ongelabelde HCN1 peptide met een uiteindelijke concentratie van 200 uM tot 0,1 uM.
    5. Incubeer de plaat bij kamertemperatuurgedurende 2 uur. Lees platen en incubeer gedurende 16 uur bij 4 ° C voor het lezen.
    6. Meet de fluorescentie polarisatie (MP) met behulp van de volgende meting parameters: 535 nm excitatie; 580 nm emissie; 535 nm dichroïsche spiegel, 20 msec integratie tijd.
    7. Bereken IC 50-waarden door het aanbrengen van de concentratie afhankelijke FP-gegevens van elke verbinding met behulp van een vier-parameter niet-lineaire regressiemodel 23.

7. Dosis-respons Validatie van Bead-gebaseerde Proximity Assay

  1. Dooi 1 portie van His-tag TRIP8b (241-602) (His-TRIP8b) en GST-gelabeld HCN1 (GST HCN1 C40) fusie-eiwitten en houd ze op ijs.
  2. Combineer His-TRIP8b met GST-HCN1 C40 in assaybuffer bij concentraties van 400 nM His-TRIP8b en 40 nM GST HCN1 C40. Bereid 300 pi van het mengsel voor elke te testen verbinding.
    Noot: Verbindingen worden uitgevoerd in drievoud bij 11 verschillende concentraties en een DMSO control (geen verbinding).
  3. Voor de controle wells, voor te bereiden 30 ul van His-TRIP8b (200 nm) zonder GST-HCN1C40 en vervolgens afzonderlijk voor te bereiden 30 ul van GST-HCN1C40 (20 nM) zonder Zijn-TRIP8b in assay buffer.
  4. Voor elke te testen verbinding, voeg 7 pl van de His-TRIP8b: GST-HCN1 C40 mengsel (bereid in stap 7.2 hierboven) aan 36 putjes van een plaat met behulp van een 16-kanaals pipet. Voor het testen van een enkele verbinding, het regelen van de 12 verschillende concentraties in rijen AL en de drie herhalingen in de kolommen 1-3. Voeg 7 ul van de His-TRIP8b-oplossing (bereid in 7.3) kolommen 1-3 van rij M en 7 pi GST-HCN1 C40-oplossing (bereid in 7.3) kolommen 1-3 van rij N. kort centrifuge de plaat zorgen voor de vloeistoffen op de bodem van elk putje en eventuele luchtbellen te verwijderen.
  5. Verdeel de treffer te testen verbindingen in de plaat zodanig dat de concentratie van elke hit varieert van 200 pM (in rij A) tot 0,1 uM (in rij K). Verdeel een volume vanDMSO in rijen LN die overeenkomt met de hoeveelheid verbinding afgeleverd in rijen AK.
  6. Schud de plaat gedurende 2 min en incubeer gedurende 2,5 uur bij kamertemperatuur.
  7. Verdun de anti-GST acceptor korrels 1:50 met testbuffer.
  8. Voeg 3,5 gl van de verdunde Acceptant kralen aan elk putje van de plaat met een 16-kanaals pipet en meng door voorzichtig pipetteren te voorkomen dat luchtbellen.
  9. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij KT in het donker.
  10. Verdun de Nickel Chelaat Donor kralen 01:50 met assay buffer. Mis het mengsel niet bloot aan licht.
  11. Voeg 3,5 gl van de verdunde Donor kralen aan elk putje van de plaat met een 16-kanaals pipet en meng door voorzichtig pipetteren te voorkomen dat luchtbellen.
  12. Incubeer de plaat gedurende 1,5 uur bij KT in het donker.
  13. Lezen op een bord lezer. Gebruik een plaat reader met de volgende meting parameters: 40 msec excitatie tijd, 100 msec emissie tijd, 0,1 mm detectie hoogte.
  14. Bereken IC 50-waarden door het aanbrengen van gegevens voor each verbinding onder toepassing van een vier parameter lineaire regressiemodel 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Copyright problemen met onze eerdere publicatie voorkomen, een TAMRA-gemerkt probe HCN1 TAMRA werd de figuren 2 en 3 te genereren. Merk op dat deze substitutie geen merkbaar verschil maakte op de resultaten en de protocollen identiek aan die hierboven beschreven met HCN1 FITC. De interactie met HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) evalueren werd getitreerd in een vaste concentratie van HCN1 TAMRA gebruik van het protocol beschreven in stap 2 (Figuur 2). Vervolgens wordt de in stap 3 experiment werd uitgevoerd en ongemerkt HCN1 peptide werd getitreerd in een vaste concentratie van TRIP8b (241-602) en HCN1 TAMRA (figuur 3).

Om te controleren of de test geschikt was voor high throughput screening, zijn prestaties werd vervolgens onderzocht door het protocol in stap 4; en Z een factor 0.89 werd verkregen, wat aangeeft dat de test klaar voor high throughput screening (figuur 4) was. Vervolgens werd een verbinding 20.000 klein molecuul bibliotheek gescreend met de procedure die in stap 5. Alle verbindingen die remming percentage boven 50% heeft werden vervolgens getest in de tweede KP assay met HCN1 TAMRA (stap 6). Tenslotte werden de bevestigde treffers getest in de bead-based proximity assay (stap 7, figuur 5). Een hit verbinding NUCC-5953, werd vastgesteld als resultaat van deze experimenten.

Figuur 1
Figuur 1: HTS Workflow Schematische beschrijving van de workflow voor high throughput screening.. Diagram opbrengst van boven naar beneden, met elke driehoek die een stap in het protocol. Klik hier om te bekijkengrotere versie van dit cijfer.

Figuur 2
Figuur 2:. Kd van eiwit-eiwit interactie (A) Schematische waarin de in stap 2 beschreven Al TRIP8b experiment (241-602) wordt getitreerd in een vaste concentratie van HCN1 TAMRA de TPR-domeinen van TRIP8b (grijs) bind de 11 aminozuur peptide (zwarte, met 'SNL terminale gemarkeerd). (B) Aangezien de concentratie van TRIP8b (241-602) toeneemt, meer HCN1 TAMRA moleculen worden gebonden en polarisatie toeneemt (KD = 0.320.01μM). Error bars geven standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3 Figuur 3:. IC 50 van de positieve controle (A) Schematische aantonen experimentele paradigma voor stap 3. Als ongelabelde HCN1 peptide wordt getitreerd in een vaste concentratie van TRIP8b (241-602) en HCN1 TAMRA, wordt het gelabelde peptide ontheemd. (B) Merk op dat het signaal afneemt als de concentratie ongemerkt HCN1 toeneemt, wat aangeeft verplaatsing van HCN1 TAMRA (IC50 = 1.070.08μM). Error bars geven standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4:. Representatieve resultaten van HTS (a) de resultaten van de high throughput sc reen uitgevoerd met het protocol beschreven in stap 5. Elk punt in de grafiek staat voor een enkele verbinding. De X- en Y-coördinaten worden bepaald door het percentage remming in elke run. (B) Resultaten uit het scherm uitgezet met positieve en negatieve controles (zie legenda). gemiddelde percentage remming van elke verbinding (over twee runs van de test) wordt uitgezet op de Y-as. (C) Resultaten van FP bevestigende experimenten met een TAMRA-gemerkt peptide HCN1. Verbindingen die een grotere dan 50% remming in stap 5 werden vervolgens gebruikt in stap 6. Zoals in (A), de X- en Y-coördinaten worden bepaald door het percentage remming twee punten van de test. Overgenomen van Han et al. 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

40 / 54540fig5.jpg "/>
Figuur 5:. Bead-gebaseerde Proximity Assay (A) Schematische die de kraal gebaseerde proximity assay. TRIP8b (241-602) bevat een N-terminale hexahistidine tag die Nickel Chelaat donor kralen bindt (cirkel met strepen). HCN1 C40 bevat een N-terminale GST tag die acceptor kralen bindt. Wanneer door de interactie van de TPR-domeinen van TRIP8b en de C-terminale tripeptide van HCN1 in de nabijheid gebracht excitatie van de donor kraal van 680 nm golflengte produceert singlet zuurstof. Deze singlet zuurstof energieoverdracht aan korrels binnen een bepaalde straal acceptor en leidt tot de emissie van licht. (B) Titratie van toenemende concentraties van de verbinding hit (NUCC-5953) in een vaste concentratie van TRIP8b (241-602) en HCN1 C40. Overgenomen van Han et al. 3. Error bars geven standaarddeviatie.target = "_ blank"> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wegens zijn potentieel als een therapie bij MDD 24, is er veel belangstelling voor farmacologische benaderingen die HCN kanaalfunctie antagoniseren in het centrale zenuwstelsel 4 geweest. Echter, deze inspanningen tot stilstand gekomen door de belangrijke rol van HCN kanalen in cardiale pacemaking en het risico van aritmie 25. We redeneerden dat het verstoren van de interactie tussen HCN en brein geëxpresseerd auxiliaire subeenheid, TRIP8b 8 voldoende antidepressivum-achtige effecten zonder dat cardiale HCN kanalen 3 te produceren kunnen zijn. Deze hypothese werd ondersteund door de waarneming dat muizen ontbreekt TRIP8b antidepressivum-achtig gedrag 7 vertonen. Gericht op deze interactie kan een nieuw paradigma voor de behandeling van MDD geworden.

Een gedetailleerd protocol voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van de interactie tussen de TPR-domeinen van TRIP8b en de C-terminale tripeptide van HCN1 isbovengenoemde zin. Zijn algemene toepassing te vergemakkelijken hier bedoeld onze redenering die leidde tot de ontwikkeling van deze test. Hoewel TRIP8b om HCN subeenheden bindt op twee locaties, hebben we ons gericht op de interactie tussen de TPR domeinen van TRIP8b en de C-terminale staart van HCN. De structuuropheldering van deze interactie door x-ray kristallografie onthulde een diepe zak gevormd door de TPR-domeinen van TRIP8b rond de C-terminale 15 van HCN. De tweede TRIP8b-HCN interactie plaatsvindt tussen een 80 aminozuur stuk TRIP8b (gelegen N terminal naar de TPR domeinen) en het cyclische nucleotide bindend domein van HCN. Deze interactie gebeurt over verschillende aminozuren van elk eiwit en is een diffuus oppervlak met minder goed gedefinieerde intermoleculaire interacties 26. Op basis van deze structurele observaties, redeneerden we dat de interactie tussen de TPR-domeinen van TRIP8b en de C terminale HCN gevoeliger voor verstoring door een klein molecuul inhiBITOR.

Aanvankelijk een groter fragment van TRIP8b werd gebruikt in de assay gebaseerd op de aanname dat een langere construct allosterische regulerende sites weergeven en vergroten de kans op succes. Volledige lengte TRIP8b werd aanvankelijk gebruikt, maar deze aanpak werd beperkt door eiwit aggregatie, degradatie, en de gevoeligheid voor vries-dooi cycli. Vervolgens twee matig gerangschikte TRIP8b construeert een langere (resten 219-602) en een kortere (residuen 259-602), werden getest voor tussenproduct construct (residuen 241-602) werd geselecteerd. Hoewel elk van de vier afknottingen hierboven beschreven TPR-domeinen relevant voor binding aan de eindstandige C van HCN bevat, alleen het tussenstuk kloon (241-602) was voldoende stabiel voor gebruik in screeningstesten. In het bijzonder, waren we in staat om grote hoeveelheden van het eiwit na zuivering door Ni2 + affiniteitschromatografie zonder andere scheidingsstappen verkrijgen.

na choosing een geschikt fragment van TRIP8b en HCN, we vervolgens bepalen van de affiniteit van de gemerkte peptide HCN1 TRIP8b (241-602). Als algemene regel kan een nauwkeurige meting alleen toegestaan indien de concentratie van het ligand ver beneden de Kd van de bindingspartner 28. In ons geval gebruikten we 50 nM gelabeld peptide HCN1 het experiment in stap 2, en verkregen een Ko van 0.320.01μM. Voor meer experimenteel ontwerp overwegingen ten aanzien van eiwit-eiwit interacties, wordt verwezen naar een van de vele uitstekende recensies over het onderwerp 27-30.

Zodra we de K D van het gemerkte HCN1 peptide voor TRIP8b (241-602) bepaald, we vervolgens bepaald als het label zelf interfereert met binding. In stap 3, verkregen we een IC50 waarde van 1.070.08 uM door titratie een ongemerkt HCN1 peptide in een vaste concentratie van TRIP8b (241-602) aan het gemerkte peptide verplaatsen. In combinatie met de Kd van het gelabeld peptide TRIP8b (241-602), en het toepassen van de Cheng-Prusoff-vergelijking, dan geschat we de affiniteit van het ongelabelde peptide TRIP8b (241-602) als K D = 0.93μM. Dit is in nauw overleg met de affiniteit van TRIP8b (241-602) voor het gelabelde peptide, en stelt voor dat het labelen van het peptide niet wezenlijk van invloed op de affiniteit voor TRIP8b. Een belangrijk kenmerk van de fluorescentiepolarisatie gebaseerde screen is de uitstekende signaal-ruisverhouding zoals aangegeven door een Z-factor van 0,89. Met andere parameters gelijk, is de grootte van de verandering van KP signaal bepaald door de grootte van de bindingspartner (TRIP8b (241-602)) en de grootte van het fluorofoor-gelabelde ligand. Een verandering in polarisatie (44-224 mP) waargenomen met de 11 aminozuur peptide ligand tussen de vrije en gebonden toestanden met ~ 42 kDa TRIP8b (241-602) eiwit voldoende is om de beoogde interactie reproduceren en een voldoende dynamisch bereik voor bibliotheek screening.

ntent "> Een van de uitdagingen van elke high throughput screening assay onderscheid waar treffer verbindingen uit artefactuele veranderingen in signaalintensiteit. In fluorescentie-polarisatie schermen op, dan is het voor vele stoffen, die hetzij rechtstreeks met de fluorofoor of fluoresceren op hun eigen. om deze problemen een tweetraps screening procedure met twee verschillende fluoroforen is hierboven beschreven omzeilen. Deze procedure reduceert de waarschijnlijkheid dat fluorescerende verbindingen en verbindingen die direct interageren met de fluorofoor zal verbeteren door de screening. Naast het binden van de fluorofoor sommige verbindingen werken als 'aggregators in vitro en leiden tot niet-specifieke veranderingen in de fluorescentiepolarisatie signaal. deze verbindingen worden vermoedelijk detergens-gevoelige micellaire structuren en remmen eiwit-eiwitinteracties 31,32. om deze effecten te verminderen, is het belangrijk dat de fluorescentie polarisatie buffer gebruikt in highthroughput screening protocol hierboven beschreven omvat een detergent (Triton), hoewel extra validatie met andere schoonmaakmiddelen moet worden overwogen.

Opgemerkt zij dat er verschillende belangrijke beperkingen van de screeningsprocedure hierboven beschreven. Hoewel TRIP8b om HCN bindt op twee locaties, het scherm hierboven beschreven onderzoekt slechts één interactie site en zal niet kleine moleculen gericht op de CNBD interactie te identificeren. Ook verbindingen die allosterisch moduleren TRIP8b binding aan HCN door interactie met TRIP8b in de N-terminale regio niet worden geïdentificeerd als treffers. Beide overwegingen zijn het gevolg van het gebruik van een kleinere TRIP8b fragment (zie boven), die reproduceerbaarheid waarborgt in de screeningstesten beschreven in de procedure. Om deze beperkingen te vermijden, zouden toekomstige aan worden gedaan met behulp van een mobiele scherm gebaseerd waarin volledige lengte HCN en TRIP8b constructen 33,34. Dit soort scherm kunnen rekenen op hoge throughput elektrofysiologische werkwijzen om verbindingen die het ontwrichten van de interactie tussen HCN en TRIP8b en de expressie van HCN kanalen beperking aan het celoppervlak identificeren. Van de nota, benadert zoals deze zou moeten contra-schermen omvatten om ervoor te zorgen dat kleine moleculen werden niet rechtstreeks beperken HCN kanaal functie als antagonisten, omdat dit kan leiden tot off doel effecten in vivo.

Hoewel HCN1, HCN2 en HCN4 hebben allemaal een geconserveerd 'SNL' C terminale peptide, de resten N-klem om dit tripeptide variëren aanzienlijk en waarschijnlijk invloed hebben op de TRIP8b bindingsaffiniteit. Dit verhoogt de mogelijkheid dat een klein molecuul hit verkregen scherm of ontworpen op basis van andere populaire verbindingen HCN isovorm specificiteit in het verstoren van de TRIP8b HCN-interactie. In het oorspronkelijke scherm werd NUCC-5953 geïdentificeerd als de eerste kleine molecule die het ontwrichten van de interactie tussen TRIP8b en HCN1 3. Future work met deze test kunnen extra klein molecuul-remmers te identificeren met gewenste chemische eigenschappen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ni-NTA agarose  Qiagen 30210
Dialysis cassette  ThermoFisher 66456
Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside  Sigma-Aldrich I5502 - 1 gr
384-Well Black plate  Corning 3820
Proxiplate  Perkin-Elmer  6008289
Anti-GST Acceptor beads  Perkin-Elmer  6760603C
NiChelate Perkin-Elmer  AS101D
pGS21-a Genscript SD0121
PMSF Sigma-Aldrich 10837091001
Coomassie Kit ThermoFisher 23200
Protein concentrator ThermoFisher 88527
Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader Perkin-Elmer  #2300-001M
BL21 (DE3) Competent Cells Agilent 200131

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
  2. Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).
  3. Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
  4. Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
  5. Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
  6. Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
  7. Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
  8. Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
  9. Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
  10. Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
  11. Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
  12. Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
  13. Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
  14. Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
  15. Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
  16. Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
  17. Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
  18. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  19. Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
  20. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
  21. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  22. Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
  23. Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
  24. Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
  25. Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
  26. DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
  27. Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
  28. Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
  29. Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
  30. Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
  31. Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
  32. McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
  33. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  34. Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).

Tags

Biochemistry High-throughput screening drug discovery eiwit-eiwit interacties fluorescentiepolarisatie HCN TRIP8b
Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M.,… More

Han, Y., Lyman, K. A., Clutter, M., Schiltz, G. E., Ismail, Q. A., Cheng, X., Luan, C. H., Chetkovich, D. M. Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b. J. Vis. Exp. (117), e54540, doi:10.3791/54540 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter