Summary
Die Wechselwirkung zwischen HCN-Kanäle und deren Hilfsuntereinheit als ein therapeutisches Ziel in der Major Depressive Disorder identifiziert worden. Hier wird eine Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Verfahren zur Identifizierung von Kleinmolekül-Inhibitoren dieser Protein-Protein-Interaktion, dargestellt.
Abstract
Hyperpolarisations-aktivierte cyclische Nukleotid-gesteuerten (HCN) Kanäle ubiquitär im Gehirn exprimiert wird, wo sie dazu dienen, die Erregbarkeit von Neuronen zu regulieren. Die subzelluläre Verteilung dieser Kanäle in Pyramidenneuronen des Hippocampus CA1 wird von Tetratricopeptid repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), eine Hilfsuntereinheit geregelt. Genetische Knockout von HCN porenbildenden Untereinheiten oder TRIP8b, beide führen zu einem Anstieg der Antidepressiva-ähnliche Verhalten, was darauf hindeutet, dass die Funktion der HCN-Kanäle zu begrenzen als Behandlung nützlich sein können für Major Depressive Disorder (MDD). Trotz erheblicher therapeutischen Interesse sind HCN-Kanäle auch im Herz, wo sie Rhythmik regulieren. off-target Probleme mit blockierenden kardialen HCN Kanälen unserem Labor wurde das Targeting Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN und TRIP8b um kürzlich assoziiert zu umgehen vorgeschlagen, um spezifisch HCN Kanalfunktion im Gehirn stören.TRIP8b bindet an HCN Porenuntereinheiten an zwei verschiedene Wechselwirkungsstellen bilden, wobei hier die Konzentration auf die Wechselwirkung zwischen dem tetratricopeptide repeat (TPR) Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Schwanz von HCN1 ist. In diesem Protokoll eine erweiterte Beschreibung eines Verfahrens zur Reinigung von TRIP8b und einen hohen Durchsatz Bildschirm zu identifizieren niedermolekularen Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen HCN und TRIP8b Ausführung beschrieben. Das Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening verwendet eine Fluoreszenzpolarisation (FP) -basierte Assay die Bindung eines großen TRIP8b Fragment mit einem Fluorophor-markierten elf Aminosäuren langes Peptid entsprechend dem C HCN1 terminalen Schwanz zu überwachen. Diese Methode erlaubt "Treffer" Verbindungen in der Polarisation des emittierten Lichts identifiziert basierend auf der Änderung werden. Validierungstests werden dann vorgenommen, um sicherzustellen, dass "Hit" Verbindungen sind nicht artifactual.
Introduction
Hyperpolarisation-aktivierte zyklische Nukleotid-gesteuerten (HCN) Kanäle werden im Herzen und im zentralen Nervensystem exprimiert , wo sie bei der Regulierung der Membran Erregbarkeit 1 eine wichtige Rolle spielen. HCN - Kanäle wurden in der Pathogenese von Major Depressive Disorder (MDD) 2, verwickelt , die mehrere Gruppen geführt hat, vorzuschlagen , dass HCN Kanalfunktion pharmakologisch Begrenzung für MDD 3 als neuartige Behandlung wirksam sein kann. Jedoch ist HCN - Kanäle direkt Targeting nicht lebensfähig aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei der kardialen Aktionspotentials 4. Ivabradin, die einzige FDA HCN Kanalantagonist genehmigt, ist für die Behandlung von Herzinsuffizienz und 5 eine Bradykardie - Effekt zu erzeugen. Als solches besteht ein Bedarf für pharmakologische Mittel, die HCN-Kanal Funktion ausschließlich im Zentralnervensystem zu begrenzen.
Tetratricopeptid wiederholen haltigen Rab8b interacting protein (TRIP8b) ist ein Gehirn spezifischeFic Hilfsuntereinheit von HCN - Kanäle, die die Oberflächenexpression und Lokalisierung von HCN - Kanäle 6,7 steuert. Genetische Knockout von TRIP8b führt zu einer Verringerung der Gehirn HCN - Kanäle 7 ohne 8 HCN - Expression im Herzen zu beeinflussen. Interessanterweise verbringen TRIP8b Knockout - Mäuse weniger Zeit unbeweglich auf der Forced Swim Aufgabe und Schwanz Suspension Aufgabe 7, zwei häufig verwendete Screening - Tests für antidepressive Wirksamkeit 11.09. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht direkt HCN-Kanäle mit einem kleinen Molekül-Antagonisten von HCN Kanalfunktion Targeting, Störung der Wechselwirkung zwischen TRIP8b und HCN kann ausreichend sein, Antidepressiva-ähnliche Verhalten zu erzeugen.
TRIP8b bindet an zwei verschiedene Bindungsstellen zu HCN. Die zyklische Nukleotid - Bindungsdomäne (CNBD) von HCN in Wechselwirkung mit einer konservierten Domäne von TRIP8b befindet sich N - terminal zu den TPR - Domänen von TRIP8b 12,13. Obwohl die Rückstände des CNBD, die daran beteiligt sind,Interaktion 14 zugeordnet wurden, die Region TRIP8b, die beteiligt ist hat sich über eine-80-Aminosäurefragment verengt 13 nicht. Eine zweite Wechselwirkung tritt zwischen den tetratricopeptide Repeat (TPR) Domänen von TRIP8b und dem C - terminalen Tripeptid von HCN ( 'SNL' in HCN1-, HCN2 und HCN4, aber "ANM" in HCN3) 3,12. Die vor kurzem gelöst Kristallstruktur 15 dieser C Schwanz Interaktion ergab erhebliche strukturelle Ähnlichkeit mit der Wechselwirkung zwischen dem peroxisomale Importrezeptor, Peroxin 5 (PEX5) und ihren Partnern interagieren, Typ - 1 - peroxisomale Targeting - Sequenzen (PTS1) 16 enthält.
Obwohl beide Wechselwirkungsstellen für HCN Kanalfunktion erforderlich sind, dient die Wechselwirkung zwischen den TPR-Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Tripeptid von HCN1 als dominante Bindungsstelle und reguliert HCN Oberflächenexpression. Daher wurde diese Wechselwirkung als Targeting Stelle in diese Studie ausgewählt.Für den Rest des Manuskripts, als ein Hinweis auf die Wechselwirkung zwischen TRIP8b und HCN hergestellt wird, ist es diese Wechselwirkung, auf die verwiesen wird. Diese Interaktion wird durch ein hoch lösliches Fragment von TRIP8b entsprechend seiner konservierten C - Terminus mit den TPR - Domänen für die Bindung des C - terminalen Schwanz von HCN (Reste 241-602 der 1a-4 - Isoformen von TRIP8b) 3 erforderlich rekapituliert.
Um einen hohen Durchsatz Bildschirm zu identifizieren , kleine Moleküle zu stören diese Interaktion fähig zu entwickeln, eine Fluoreszenzpolarisation (FP) -basierte Assay 17 eingesetzt wurde. Fluoreszenzpolarisation basieren auf der Anregung eines Fluorophors-markierten Liganden mit polarisiertem Licht und Messen der Polarisationsgrad des emittierten Fluoreszenz 18. In Gegenwart eines Bindungspartners wird die Drehbewegung des fluoreszierenden Liganden beschränkt und polarisiertes Licht 19 emittiert. In Abwesenheit eines Bindungspartners, ter eine Drehbewegung des Liganden führt zur Emission von depolarisierten Lichts.
In dem beigefügten Protokoll wird ein Verfahren zur Reinigung von N-Terminal-markierten (6xHis) TRIP8b (241-602) unter Verwendung von Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) -Perlen dargestellt. Ein ähnliches Protokoll wurde verwendet , um die Glutathione-S-Transferase (GST) -markierte C - terminalen 40 Aminosäuren von HCN1 (HCN1 c40) in Schritt 7 des verwendeten Protokolls zu reinigen. Aus Platzgründen wurde eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens verzichtet.
In den Schritten 2 bis 7 des Protokolls, ein Screening mit hohem Durchsatz Workflow dargestellt (siehe Abbildung 1). Protein-Protein - Wechselwirkungen sind ein notorisch schwieriges Ziel für Hochdurchsatz - Screening und Leser wird empfohlen, auf dem 20 Thema zusätzliche Ressourcen zu suchen.
Die Schritte 2 und 3 des Verfahrens charakterisieren die in - vitro - Affinität des gereinigten TRIP8b (241-602) konstruieren fora Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markierten elf Aminosäuren langes Peptid an das C entsprechenden terminalen Schwanz von HCN1 (HCN1 FITC). Auf der Basis der Kristallstruktur des TRIP8b-HCN - Komplex 15, diese elf Aminosäuresegment ist ausreichend mit TRIP8b (241-602) zu erzeugen , zu binden. In Schritt 2 wird die K d der Wechselwirkung , gemessen durch TRIP8b (241-602) in einer festen Konzentration von HCN1 FITC titrieren. In Schritt 3 verwendet eine unbeschriftete Version des HCN - Peptid in Schritt 2 in einer festen Konzentration von sowohl TRIP8b (241-602) und HCN1- FITC titriert , um zu untersuchen , ob die FITC - Tag mit Bindung stört. Diese Versuche sind wesentlich , um die entsprechenden Konzentrationen von TRIP8b Auswählen (241-602) und HCN1 FITC im Hochdurchsatz - Screening verwendet.
Die Prämisse des Hochdurchsatz - Screening ist , dass ein kleines Molekül, das die Wechselwirkung zwischen TRIP8b stören (241-602) und HCN1- FITC einen Dezember produzierenrease im polarisierten Licht. In Schritt 4 wird der Z - Faktor des Assays 21 für eine gegebene Konzentration von TRIP8b (241-602) und HCN1 FITC sicherzustellen berechnet , dass der Assay für die Hochdurchsatz - Screening (Schritt 5) geeignet ist. Schritte 6 und 7 Validierungstests zu bestätigen sind , dass die in der primären Hochdurchsatz - Screening identifizierten Hits wirken durch die Wechselwirkung zwischen TRIP8b stören (241-602) und HCN1- FITC und nicht über einen unspezifischen Mechanismus. In Schritt 6 Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) -markierten HCN1 Peptid (HCN1 TAMRA) ist in einer ansonsten identischen Fluoreszenzpolarisationsassay verwendet , um fluoreszierende Verbindungen Filter, der die FP - Assay unter Verwendung des FITC - Tag kompromittieren. Schritt 7 verwendet einen größeren HCN1 C terminales Fragment (HCN1 C40) und verwendet einen bead-based Proximity Assay, der auf der "Tunneling" eines Singulett - Sauerstoff von einem Spender bead auf einen Akzeptor bead nahe Proteine miteinander in Wechselwirkung gebracht basiert 22.
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Protocol
1. Reinigung von TRIP8b (241-602) Protein
- Verwandeln Sie das Plasmid TRIP8b (241-602) in der bakteriellen Proteinexpressionsvektor pGS21 3 in kompetente E. enthält coli für die Proteinexpression nach den Anweisungen des Herstellers. Platte 300 ul der Kultur auf Luria Broth (LB) mit 5 ug / ml Chloramphenicol und Ampicillin -Agar. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 16 h.
- Am nächsten Tag, wählen Sie eine einzelne Kolonie 50 ml LB zu inokulieren mit 50 ug / ml Chloramphenicol und Ampicillin. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C für 16 Stunden (unter Schütteln).
- 50 ml Kultur zu 1 l LB mit 50 & mgr; g / ml Ampicillin. bei 37 ° C inkubieren unter Schütteln.
- Sobald die Kultur eine OD 600 von 0,8-1,2 Lese erreicht hat, ändern , um die Temperatur des Inkubators auf 18 ° C und IPTG (Isopropyl-beta-D-thiogalactosid) bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzuzufügen. Lassen Sie die Proteinexpression für 16 Stunden, um fortzufahren.
- Spin down die E. coli bei 6.000 xg für 15 min bei 4 ° C , um die Bakterien zu pelletieren. Nachdem die Röhrchen aus der Zentrifuge entfernt wird, halten die Bakterien auf Eis für den Rest des Verfahrens. Resuspendieren der Bakterien in 36 ml Puffer A mit 0,25 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF).
- Beschallen die resuspendierten Bakterien auf Eis einen Flachbolzen für 5-10 min mit, im Wechsel zwischen 30 sec 'auf' und 30 sec 'off' bei hoher Leistung.
- Zentrifuge bei 12.000 xg für 15 min bei 4 ° C. Zentrifuge für weitere 15 Minuten, wenn der Überstand noch nicht klar.
- Wenden Sie den Überstand auf eine Säule mit 2 ml Ni-NTA-Kügelchen. Inkubieren für 60 Minuten bei 4 ° C unter leichtem Schütteln.
- Lassen Sie das ungebundene Material durch die Säule zu fließen und wäscht mit 500 ml Puffer A
- Die Säule wird mit 250 ml Puffer B
- Die Säule wird mit 125 ml Puffer A mit 5 mM Imidazol ergänzt.
- Eluieren des Proteins herm die Säule mit 20 ml Elutionspuffer.
- Fügen Sie das eluierte Protein zu einer Dialysekassette (Molekulargewichtsgrenze - 10 kDa) mit einer Spritze. Dialysieren das Protein für 60 min in 4 l kaltem Phosphate Buffered Saline (PBS) bei 4 ° C.
- Bewegen Sie die Dialysekassette in eine neue 4 L Eimer mit kaltem PBS. Dialysieren Protein für 16 Stunden bei 4 o C.
- Am nächsten Morgen, überprüfen Sie die Proteinkonzentration ein Coomassie-Protein-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Konzentriere das Protein ein Protein-Konzentrator unter Verwendung von nach den Anweisungen des Herstellers, wenn eine Konzentration von unter 40 & mgr; M beobachtet wird. Aliquot und gefrier bei -80 ° C zur Lagerung.
2. Small Scale Fluoreszenz-Polarisations-Assay die Wechselwirkung der beiden Proteinfragmente zu Charakterisieren
- Auftauen 200 & mgr; l von 40 & mgr; M TRIP8b (241-602), und fügen Sie sie in ein 1,5-ml-Röhrchen. 100 l PBS bis 11 zusätzliche 1,5-ml-Röhrchen.
- Führen Reihenverdünnungen durch Transferieren 100 ul TRIP8b (241-602) aus dem ursprünglichen Rohr zum nächsten Rohr in der Reihe, Auf- und Abpipettieren und den Prozess zu wiederholen. Dies wird eine 12-Punkte-Serie von 2-fachen Verdünnungen von TRIP8b (241-602) im Bereich von 0,01 bis 40 & mgr; m herzustellen.
- Bereiten Sie einen 650 & mgr; l Master - Mix von 0,1 uM HCN1- FITC (6,5 ul einer 10 uM aliquoten) und 2 mM Dithiothreitol (DTT) in PBS.
Hinweis: Der Master-Mix 2x ist. - Richten Sie 12 neue 1,5-ml-Röhrchen. In 50 ul des Master - Mix enthält HCN1- FITC zu jedem Röhrchen, und fügen Sie dann 50 & mgr; l von jedem der 12 Reihenverdünnungen.
Anmerkung: Diese Rohre 12 erzeugen wird, die jeweils 0,05 uM HCN1 FITC und die Hälfte der Konzentration von TRIP8b (241-602) von der Originalreihenverdünnung. - Fügen Sie die Verdünnungsreihe zu einer Testplatte, 30 & mgr; l pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung. Verwenden Sie eine niedrige Bindungs feste schwarze 384-Well-Platte.
- Drehen Sie die Platte foder 2 min bei 900 × g bei RT.
- Lesen Sie die Platte mit einem Mikroplatten-Reader verwenden, nach den Anweisungen des Herstellers. Messen der Fluoreszenzpolarisation unter Verwendung der folgenden Messgrößen: 485 nm Anregung, 530 nm Emission 505 nm dichroitischen Spiegel, 100 ms Integrationszeit.
- Zeichnen Sie die Polarisation (mp) Werte im Vergleich zu den TRIP8b (241-602) Konzentration auf einer logarithmischen Skala. Montieren Sie die Daten mit der Hill - Gleichung , die Affinität (K d) von TRIP8b (241-602) für das markierte HCN1- Peptid zu bestimmen.
Hinweis: Für die Reihenverdünnungen Vorbereitung, eine Multi-Well-Platte auch anstelle von Rohren verwendet werden kann.
3. Überprüfen Sie die Protein-Protein-Wechselwirkung eine Positivkontrolle verwenden
- Mit 200 ul unmarkiertem HCN1-Peptid (200 & mgr; M) in ein 1,5 ml Röhrchen. 100 l PBS bis 11 zusätzliche 1,5-ml-Röhrchen. Führen Reihenverdünnungen von 100 & mgr; l aus dem Röhrchen übertragen 200 ul Peptid an der ersten Röhre enthält,von 100 & mgr; l PBS. Wiederholen Sie den Vorgang 12 Röhrchen mit 2-fach-Verdünnungen von unmarkierten HCN1- Peptid zu erzeugen.
- Bereiten Sie einen 650 & mgr; l Master - Mix von 0,2 uM HCN1- FITC und 4 uM TRIP8b (241-602).
Hinweis: Dies ist eine 2x Lösung. - In 50 ul Master-Mix auf 12 neue 1,5-ml-Röhrchen.
- In 50 ul jeder seriellen Verdünnung in ein 1,5-ml-Röhrchen.
- Laden Sie die schwarzen 384-Well-Mikrotiterplatte in dreifacher Ausfertigung, Zugabe von 30 & mgr; l pro Vertiefung.
- Zentrifugieren Sie die Platte für 2 Minuten bei 900 × g bei RT.
- Lesen Sie die Platte mit einem Mikroplattenleser der Lage FP verwenden. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen wie in Schritt 2.7 beschrieben.
- Berechne die Affinität des unmarkierten Peptids für TRIP8b (241-602) unter Verwendung der Cheng-Prusoff - Gleichung: K d 1 = IC 50 / (1 + [L] / K d 2), wobei K d 1 die Affinität des unmarkierten Peptid für TRIP8b (241-602), IC 50 ist in dem vorhergehenden Schritt bestimmtund stellt die Fähigkeit des unmarkierten Liganden den markierten Liganden, [L] die Konzentration des markierten Liganden in Schritt 3.2, und K d 2 ist die Affinität von TRIPb (241-602) für den markierten Liganden zu verdrängen.
4. Bewerten Testleistung (berechnen Z-Faktor)
- Bereiten Sie einen Master - Mix , indem sie eine 12 - ml - Lösung von FP - Puffer mit 2 uM TRIP8b (241-602), 50 nM HCN1- FITC und 1 mM DTT in FP - Puffer.
Hinweis: Diese 60 & mgr; l von 40 & mgr; M TRIP8b erfordern (241-602), 60 ul 10 uM HCN1- FITC und 1.080 & mgr; l von FP - Puffer. - Werden 30 & mgr; l der Mastermischung in jede Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Mikrotiterplatte.
- 1 ul 1 mM unmarkiertem HCN1- Peptid zu 192 Brunnen als positive Kontrolle zu dienen.
- 1 & mgr; l von FP-Puffer auf 192 Brunnen als negative Kontrolle dienen.
- Zentrifugieren Sie die Platte für 2 Minuten bei 900 × g bei RT.
- Lesen Sie die Platte mit einem microplate Leser.
- Berechnen Sie den Z - Faktor für den Test mit der folgenden Formel: Z = 1-3 * (σ pos & sgr; neg) / (μ neg -μ pos) , wo σ pos und σ neg sind die Standardabweichungen der positiven und negativen Kontrollvertiefungen und μ pos und μ neg repräsentieren die Mittelwertsignale in den positiven und negativen Kontrollvertiefungen.
5. Hochdurchsatz-Screening
- Auftauen Aliquots von TRIP8b (241-602) und HCN1- FITC und halten sie auf dem Eis.
- Bereiten Sie 10 ml TRIP8b (2 uM) und HCN1- FITC (50 nM) in FP - Puffer.
- Dispense 25 ul des Gemischs in jede Vertiefung einer geringen Bindung 384-Well-schwarzen Mikrotiterplatte mit einer Pipette.
- Für Bibliotheks-Screening, fügen Sie Verbindungen in jede Vertiefung der Spalten 3 bis 22 (40 & mgr; M Endkonzentration für jedes) eine akustische Liquid Handler verwenden.
Hinweis: Aufgrund der relatively niedrige Trefferrate mit diesem Test beobachtet, zwei verschiedene Verbindungen wurden in einem einzigen gut gebündelt. Die beiden Verbindungen von jedem aktiven und wurden anschließend einzeln zu identifizieren getestet, die die Aktivität verliehen. - Je 100 nl Dimethylsulfoxid (DMSO) in jede Vertiefung der Spalten 1 und 23 jeder Platte als negative Kontrollen.
- Hinzufügen unmarkierten HCN1 Peptid in jede Vertiefung der Spalten 2 und 24 jeder Platte als positive Kontrollen.
- Inkubiere die Platten bei RT für 2 h. Lesen Sie Platten oder bei 4 ° C inkubieren für 16 Stunden vor dem Lesen.
- Messen der Fluoreszenzpolarisation auf einem Plattenlesegerät. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen wie in Schritt 2.7 beschrieben.
- Berechnen prozentuale Hemmung durch die Signale Normalisierung der durchschnittlichen positiven und negativen Kontrollen von jeder Platte als 100% verwendet wird. Verwenden Sie die Gleichung XN = 100% * ((X neg - X) / (X neg - X pos)) , wobei X N ist die normierte prozentuale Hemmung auf das Signal X entspricht, X - Pos neg ist das Signal von den negativen Kontrollvertiefungen.
6. Bestätigung der Treffer Mit TAMRA-markierten HCN Peptid
- Validate - Hits mit über 50% ige Hemmung TAMRA-markierten HCN1- Peptid (HCN1- TAMRA) verwendet wird .
- Bereiten Sie einen Master - Mix aus 12 ml 2 uM TRIP8b (241-602) und 50 nM HCN1- TAMRA in FP - Puffer.
- Dispense 25 ul des Master-Mix in jede Vertiefung einer schwarzen 384-well-Mikrotiterplatte.
- Übertragen Reihenverdünnungen von jeder aktiven Verbindungen in die entsprechenden Wells. Bilden zwei fachen Verdünnungen, so daß die Konzentration jeder im Bereich von 0,2 uM bis 200 uM getroffen.
- Für die negativen Kontrollreaktionen, dann 100 nl von DMSO in jede Vertiefung. Für die Positivkontrolle mit 100 nl von seriell verdünnten unmarkierten HCN1- Peptid mit einer Endkonzentration von 200 uM bis 0,1 uM reichen.
- Die Platte bei RT2 Std. Lesen Platten oder Inkubation für 16 h bei 4 ° C vor dem Lesen.
- Messen der Fluoreszenzpolarisation (mP) unter Verwendung der folgenden Messgrößen: 535 nm Anregung; 580 nm Emission; 535 nm dichroitischen Spiegel, 20 ms Integrationszeit.
- Berechnen IC 50 Werte durch die konzentrationsabhängigen FP Daten jeder Verbindung Armatur 23 einen Vier-Parameter nicht - lineare Regressionsmodell.
7. Dosis-Wirkungs-Validierung von Bead-basierten Proximity Assay
- Auftauen 1 aliquote Menge von His-Tag TRIP8b (241-602) (His-TRIP8b) und GST-getaggten HCN1- (GST- HCN1- C40) Fusionsproteine und halten sie auf dem Eis.
- Kombinieren Sie His-TRIP8b mit GST-HCN1- C40 in Testpuffer bei Konzentrationen von 400 nM His-TRIP8b und 40 nM GST HCN1- C40. Bereiten 300 & mgr; l der Mischung für jede Verbindung getestet werden.
Hinweis: Die Verbindungen werden in dreifacher Ausfertigung in 11 verschiedenen Konzentrationen plus DM laufenSO Kontrolle (keine Verbindung). - Für Kontrollvertiefungen, Herstellung von 30 & mgr; l von His-TRIP8b (200 nM) ohne GST-HCN1C40 und dann separat Herstellung von 30 & mgr; l GST-HCN1C40 (20 nM) ohne His-TRIP8b in Testpuffer.
- Für jede Verbindung , die getestet werden, fügen 7 ul des His-TRIP8b: GST-HCN1 C40 - Mischung (hergestellt in Schritt 7.2 oben) auf 36 Kavitäten einer Platte mit einem 16-Kanal - Pipette. Für eine einzelne Verbindung zu testen, ordnen Sie die 12 verschiedenen Konzentrationen in Reihen AL und die drei Replikaten in Spalten 1-3. In 7 ul der His-TRIP8b Lösung (hergestellt in 7.3) zu den Spalten 1-3 der Reihe M und 7 ul GST-HCN1- C40 - Lösung (hergestellt in 7.3) zu den Spalten 1-3 der Reihe N. Zentrifuge kurz auf die Platte sicherzustellen, dass die Flüssigkeiten am Boden jeder Vertiefung sind und alle Blasen zu entfernen.
- Dispense die Treffer Verbindungen werden in die Platte getestet, so dass die Konzentration von jedem Treffer im Bereich von 200 & mgr; M (in der Reihe A) bis zu 0,1 & mgr; M (in der Reihe K). Dispense ein Volumen vonDMSO in Reihen LN, die die Menge der Verbindung, die in Reihen AK entfallen einstimmt.
- Schütteln Sie die Platte für 2 min und Inkubation für 2,5 h bei RT.
- Verdünnen Sie die anti-GST-Acceptor Perlen 1:50 mit Assay-Puffer.
- In 3,5 ul der verdünnten Acceptor Perlen in jede Vertiefung der Platte mit einem 16-Kanal-Pipette und mischen durch vorsichtiges Blasen zu vermeiden Pipettieren zu schaffen.
- Inkubieren der Platte für 1 h bei RT im Dunkeln.
- Verdünnen Sie die Nickel-Chelat-Donorbeads 1:50 mit Assay-Puffer. Nicht die Mischung auf Licht aussetzen.
- In 3,5 ul der verdünnten Donorbeads in jede Vertiefung der Platte mit einem 16-Kanal-Pipette und mischen durch vorsichtiges Blasen zu vermeiden Pipettieren zu schaffen.
- Inkubieren der Platte für 1,5 h bei RT im Dunkeln.
- Lesen Sie auf einem Plattenleser. Verwenden Sie einen Plattenleser mit folgenden Messparametern: 40 ms Erregungszeit 100 ms Emissionszeit, 0,1 mm Überwachungshöhe.
- Berechnen IC 50 Werte durch den Einbau von Daten für Bildung und Kulturh Verbindung mit einem Vier-Parameter nicht - linearen Regressionsmodell 23.
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Representative Results
Um Copyright - Probleme mit unserer früheren Veröffentlichung, eine TAMRA-markierte Sonde HCN1- TAMRA wurde vermeiden verwendet , um generieren 2 und 3. Beachten Sie, dass diese Substitution, nicht nennenswerten Unterschied in den Ergebnissen zu machen und die Protokolle sind identisch mit den oben umrissenen mit HCN1 FITC. Zur Beurteilung der Interaktion mit HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) wurde in einer festen Konzentration von HCN1 TAMRA titriert das Protokoll in Schritt 2 (Figur 2) umrissen werden. Als nächstes wurde das Experiment erläutert in Schritt 3 durchgeführt , und unmarkierten HCN1 Peptid wurde in einer festen Konzentration von TRIP8b (241-602) und HCN1 TAMRA (Abbildung 3) titriert.
Um sicherzustellen, dass der Test für Hochdurchsatz-Screening geeignet war, wurde seine Leistung als nächstes durch das Protokoll in Schritt geprüft 4; und ein Z-Faktor von 0.89 erhalten wurde, was darauf hinweist , dass der Assay für Hochdurchsatz - Screening (Abbildung 4) bereit war. Dann wurde durch das Verfahren ein 20.000 Verbindung kleines Molekül - Bibliothek in Schritt 5 Alle Verbindungen skizzierte gescreent , die über 50% prozentuale Hemmung haben wurden dann in der zweiten FP - Assay getestet mit HCN1- TAMRA (Schritt 6). Schließlich werden die bestätigten Treffer wurden in der Wulst-basierten Proximity - Assay (Schritt 7, 5) getestet. Ein Treffer Verbindung, NUCC-5953 wurde als Ergebnis dieser Experimente identifiziert.
Abbildung 1: HTS - Workflow - Schema , das die Workflow für die Hochdurchsatzscreening zu beschreiben.. Diagramm Erlös von oben nach unten, wobei jedes Dreieck einen Schritt in dem Protokoll darstellt. Bitte klicken Sie hier anzuschauenGrößere Version der Figur.
Abbildung 2:. K d von Protein-Protein - Wechselwirkung (A) Schematische das Experiment in Schritt 2 Wie TRIP8b beschrieben zeigt (241-602) in einer festen Konzentration von HCN1- TAMRA titriert, binden die TPR - Domänen von TRIP8b (in grau) an das Peptid 11 Aminosäure (in schwarz, markiert mit Terminal 'SNL'). (B) Da die Konzentration von TRIP8b (241-602) zunimmt, werden mehr HCN1 TAMRA - Moleküle gebunden und Polarisation zunimmt (K D = 0.320.01μM). Die Fehlerbalken bezeichnen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. IC 50 von Positivkontrolle (A) Schematische Demonstrieren experimentelle Paradigma für Schritt 3. Als unmarkierten HCN1- Peptid in einer festen Konzentration von TRIP8b titriert (241-602) und HCN1- TAMRA wird das markierte Peptid verdrängt. (B) Man beachte , daß das Signal abnimmt , wenn die Konzentration an unmarkiertem HCN1 zunimmt, was darauf hinweist Verschiebung HCN1 TAMRA (IC 50 = 1.070.08μM). Die Fehlerbalken bezeichnen Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4:. Repräsentative Ergebnisse von HTS (A) ergibt sich aus dem hohen Durchsatz sc reen geführt, um das Protokoll in Schritt 5 Jeder Punkt auf der Grafik skizziert unter Verwendung stellt eine einzelne Verbindung. Die X- und Y-Koordinaten werden durch die prozentuale Hemmung in jedem Durchlauf ermittelt. (B) Ergebnisse aus dem Bildschirm gezeichnet mit positiven und negativen Kontrollen (siehe Legende). Jede Verbindung der durchschnittliche prozentuale Hemmung (in zwei Durchläufen des Tests) auf der Y-Achse aufgetragen. (C) Die Ergebnisse aus bestätigende Experimente FP mit einem TAMRA-markierten HCN1- Peptid. Verbindungen zeigen mehr als 50% Hemmung in Schritt 5 , wurden dann in Schritt 6 , wie in (A), die X- und Y - Koordinaten werden durch die prozentuale Hemmung in zwei Durchläufen des Tests bestimmt verwendet. Übernommen aus Han et al. 3. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 5:. Bead-basierten Proximity Assay (A) Schematische Darstellung der Wulst-basierten Proximity - Assay. TRIP8b (241-602) enthält einen N-terminalen Hexahistidin-Tag, das Nickel-Chelat-Donorbeads (Kreis mit Streifen) bindet. HCN1- C40 enthält einen N - terminalen GST - Tag , das Akzeptor - Perlen bindet. Wenn sie in die Nähe von der Wechselwirkung der TPR-Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Tripeptid von HCN1 gebracht Anregung des Wulstes Donator von 680 nm Wellenlänge Licht erzeugt Singulett-Sauerstoff. Dieser Singulett-Sauerstoff überträgt Energie Perlen in einem bestimmten Radius zu Akzeptor- und führt zur Emission von Licht. (B) Titration von Konzentrationen der Treffer Verbindung (NUCC-5953) in einer festen Konzentration von TRIP8b (241-602) und HCN1- C40 zu erhöhen. Übernommen aus Han et al. 3. Die Fehlerbalken bezeichnen Standardabweichung.target = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wegen ihres Potenzials als ein therapeutisches Ziel in MDD 24 hat es in pharmakologischen Ansätzen beträchtliches Interesse , die HCN - Kanal Funktion im Zentralnervensystem 4 antagonisieren. Allerdings haben diese Bemühungen durch die wichtige Rolle der HCN - Kanäle in der Herzschrittmacher und das Risiko einer Arrhythmie 25 installiert. Wir schlussfolgerten , dass die Interaktion zwischen HCN zu stören und sein Gehirn spezifische Hilfsuntereinheit, TRIP8b 8, ausreichend sein könnte Antidepressiva-ähnliche Effekte zu erzeugen , ohne drei Herz-HCN - Kanäle zu beeinflussen. Diese Hypothese wurde durch die Beobachtung verstärkt , die Mäuse 7 TRIP8b aufweisen Antidepressivum-ähnliches Verhalten fehlen. diese Interaktion Targeting könnte ein neues Paradigma für die Behandlung von MDD werden.
Ein detailliertes Protokoll niedermolekularen Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen den TPR-Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Tripeptid von HCN1 zur Identifizierung istoben dargestellt. Ihrer allgemeinen Anwendung zu erleichtern, beschreiben wir unsere Überlegungen, die zur Entwicklung dieses Assays führte. Obwohl TRIP8b zu HCN-Untereinheiten an zwei Stellen bindet, konzentrierten wir uns auf die Wechselwirkung zwischen den TPR-Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Schwanz von HCN. Die Strukturaufklärung dieser Wechselwirkung durch Röntgenkristallographie ergab eine tiefe Tasche durch die TPR - Domänen von TRIP8b um das C - Terminal von HCN 15 gebildet. Die zweite TRIP8b-HCN Wechselwirkung tritt zwischen einer 80 Aminosäure langen TRIP8b (befindet sich N-terminal zu den TPR-Domänen) und das zyklische Nukleotid-Bindungsdomäne von HCN. Diese Interaktion tritt in vielen verschiedenen Aminosäuren jedes Proteins und stellt eine diffuse Oberfläche mit weniger gut definierte intermolekularen Wechselwirkungen 26. Basierend auf diesen Beobachtungen Struktur begründete wir, dass die Wechselwirkung zwischen den TPR-Domänen von TRIP8b und dem C-Anschluß des HCN ist anfälliger für Störungen durch ein kleines Molekül INHIbitor.
Zunächst wurde in dem Assay basiert auf der Annahme, dass eine längere Konstrukt kann allosterische regulatorische Stellen und erhöhen die Chance auf Erfolg ein größeres Fragment TRIP8b verwendet. In voller Länge TRIP8b wurde ursprünglich verwendet, aber dieser Ansatz wurde durch Proteinaggregation, Abbau begrenzt, und die Empfindlichkeit gegen Frost-Tau-Zyklen. Anschließend wurden zwei zwischengroße TRIP8b konstruiert, ein längeres (Reste 219-602) und eine kürzere (Reste 259-602), vor einem Zwischen Konstrukt getestet wurden (Reste 241-602) wurde ausgewählt. Obwohl jede der oben beschriebenen vier Abflachungen die TPR-Domänen relevant für die Bindung an das C-Terminal von HCN enthalten, wird nur der Zwischenlänge clone (241-602) wurde für den Einsatz in Screening-Assays ausreichend stabil. Insbesondere konnten wir große Mengen des Proteins nach Reinigung durch Ni 2+ Affinitätschromatographie ohne zusätzliche Trennschritte zu erhalten.
Nach choosein geeignetes Fragment von TRIP8b und HCN ing, stellten wir fest, neben der Affinität des markierten HCN1- Peptid für TRIP8b (241-602). Als allgemeine Regel kann eine genaue Messung nur , wenn die Konzentration des Liganden hergestellt werden , 28 im wesentlichen unterhalb der K D des Bindungspartners ist. In unserem Fall verwendeten wir 50 nM markierter HCN1 Peptid für das Experiment in Schritt 2, und erhielt einen K D von 0.320.01μM. Weitere experimentelle Design - Überlegungen in Bezug auf Protein-Protein - Wechselwirkungen werden die Leser zu einem von mehreren exzellenten Kritiken auf das Thema 27-30 bezeichnet.
Sobald wir die K D des markierten HCN1- Peptid für TRIP8b (241-602) bestimmt, stellten wir fest , dann , wenn das Etikett selbst mit Bindung stört. In Schritt 3 erhalten wir einen IC 50 Wert von 1.070.08 uM durch ein unmarkierter HCN1 Peptids in einer festen Konzentration von TRIP8b Titrieren (241-602) , um das markierte Peptid zu verdrängen. In Kombination mit dem K D des markiertes Peptid für TRIP8b (241-602) und der Cheng-Prusoff - Anwendung, schätzten wir dann die Affinität des unmarkierten Peptid für TRIP8b (241-602) als K D = 0.93μM. Dies ist in enger Abstimmung mit der Affinität von TRIP8b (241-602) für das markierte Peptid, und schlägt vor, dass das Peptid Markierung im wesentlichen seine Affinität hatte keinen Einfluss auf TRIP8b. Ein wichtiges Merkmal der Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Bildschirm ist seine ausgezeichnete Signal-Rausch-Verhältnis, wie durch einen Z-Faktor von 0,89 angegeben. Mit anderen Parameter gleich sind, die Größe der Änderung in FP-Signal wird durch die Größe des Bindungspartners (TRIP8b (241-602)) und die Größe des Fluorophor-markierten Liganden bestimmt. Eine Änderung der Polarisation (44-224 mP) beobachtet, die mit dem 11-Aminosäure-Peptid-Ligand zwischen seinem freien und gebundenen Zuständen mit dem ~ 42 kDa TRIP8b (241-602) Protein ist ausreichend, um die gezielte Interaktion zu reproduzieren und bietet einen ausreichenden Dynamikbereich für Bibliotheks-Screening.
ntent "> Eine der Herausforderungen von jedem High-Throughput-Screening-Test ist die Unterscheidung wahr" Hit "Verbindungen aus artifactual Veränderungen der Signalintensität. In der Fluoreszenzpolarisation basierte Bildschirme, ist es üblich, dass viele Verbindungen, die entweder mit dem Fluorophor direkt zu interagieren oder fluoreszieren auf ihre eigenen. um diese Probleme zu umgehen, ein zweistufiges Screening-Verfahren zwei unterschiedliche Fluorophore unter Verwendung der oben beschrieben ist. reduziert dieses Verfahren die Wahrscheinlichkeit, dass fluoreszierende Verbindungen und Verbindungen direkt mit dem Fluorophor in Wechselwirkung wird das Screening-Verfahren voran durch. Neben der Bindung des Fluorophors einige Verbindungen , die als "Aggregatoren 'in vitro wirken und in der Fluoreszenzpolarisationssignal zu unspezifischen Veränderungen führen. Diese Verbindungen Waschmittelempfindlichen micellaren Strukturen und hemmen , sind gedacht , um Protein-Protein - Wechselwirkungen 31,32 bilden. um diese Auswirkungen zu mildern, ist es wichtig , dass der Fluoreszenzpolarisationspuffer im Hoch verwendetthroughput screening-Protokoll oben umrissenen enthält ein Detergens (Triton), obwohl eine zusätzliche Validierung mit anderen Waschmitteln in Betracht gezogen werden sollte.Es sollte beachtet werden, dass es mehrere wichtige Einschränkungen des Screening-Verfahren oben beschrieben sind. Obwohl TRIP8b an zwei Stellen an HCN bindet, beschrieben auf dem Bildschirm oben untersucht nur eine Website Interaktion und nicht kleine Moleküle zu identifizieren, die CNBD Interaktion Targeting. Ebenso Verbindungen, die allosterisch TRIP8b Bindung an HCN modulieren, indem mit TRIP8b in der N-terminalen Region in Wechselwirkung wird nicht als Treffer identifiziert werden. Beide dieser Überlegungen sind das Ergebnis eines kleineren TRIP8b Fragment (siehe oben), die in dem Verfahren die Reproduzierbarkeit in den Screening-Assays umrissenen gewährleistet. Um diese Einschränkungen zu , künftige Anstrengungen zu vermeiden , kann bei Verwendung eines zellbasierten Bildschirm mit Voll Länge HCN und TRIP8b konstruiert 33,34 gerichtet werden. Diese Art von Bildschirm kann auf hohe t verlassenhroughput elektrophysiologischen Verfahren, um Verbindungen zu identifizieren, fähig ist, die Wechselwirkung zwischen HCN und TRIP8b stören, und die Expression von HCN-Kanäle an der Zelloberfläche zu begrenzen. Zu beachten ist , Ansätze wie diese Gegen Bildschirme enthalten , um sicherzustellen , dass kleine Moleküle Begrenzungsfunktion HCN Kanal als Antagonisten wurden nicht direkt müssten, da dies zu Tor Effekte in vivo führen könnte.
Obwohl HCN1-, HCN2 und HCN4 alle eine konservierte 'SNL' C-terminale Peptid haben, variieren die Reste N-terminal zu diesem Tripeptid wesentlich und wahrscheinlich die TRIP8b Bindungsaffinität beeinflussen. Dies eröffnet die Möglichkeit, dass ein kleines Molekül, das durch Bildschirm oder auf der Basis anderer Trefferverbindungen entworfen erhalten hit kann HCN-Isoform Spezifität bieten die TRIP8b-HCN Wechselwirkung zu stören. In der ursprünglichen Bildschirm wurde NUCC-5953 als erstes kleines Molekül identifiziert Lage ist , die Wechselwirkung zwischen TRIP8b stören und HCN1- 3. Zukünftige work mit diesem Test kann mit den gewünschten chemischen Eigenschaften für die Arzneimittelentwicklung zusätzliche kleine Molekül-Inhibitoren identifizieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Dialysis cassette | ThermoFisher | 66456 | |
| Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 - 1 gr | |
| 384-Well Black plate | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
| Anti-GST Acceptor beads | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| Protein concentrator | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | Agilent | 200131 |
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