Summary
HCN kanalları ve bunların yardımcı alt birimi arasındaki etkileşim Majör Depresif Bozukluk bir tedavi hedefi olarak tespit edilmiştir. Burada, bu protein-protein etkileşimi, küçük molekül inhibitörleri belirlemek için bir floresan polarizasyon tabanlı bir yöntem sunulmuştur.
Abstract
Hiperpolarizasyon aktive siklik nükleotid kapılı (HCN) kanallar nöron heyecanlanma düzenleyen işlev beyin boyunca yayg ifade edilmiştir. hipokamp alanı CA1 piramidal nöronlarda bu kanallar hücre içi dağılımı tetratricopeptide tekrar içeren Rab8b etkileşen protein (TRIP8b), bir yardımcı alt birimi tarafından kontrol edilir. HCN genetik nakavt HCN kanallarının işlevini sınırlayan Majör Depresif Bozukluk (MDB) için bir tedavi olarak yararlı olabileceğini düşündüren, alt birimler veya TRIP8b, antidepresan benzeri davranışlar artışa hem de kurşun oluşturan gözenek. önemli terapötik ilgiye rağmen, HCN kanalları da onlar ritmini düzenleyen kalp, ifade edilmektedir. Kalp HCN kanalları bloke ile ilişkili hedef dışı sorunları aşmak için, bizim laboratuvar son zamanlarda özellikle beyinde HCN kanal fonksiyonunu bozabilir için HCN ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi hedef önerdi.Burada odak noktası TRIP8b ve tetratricopeptide tekrar (TPR) etki ve HCN1 C terminal kuyruğu arasındaki etkileşim üzerinde olmasına rağmen TRIP8b, iki farklı etkileşim siteleri alt birimlerini oluşturan HCN gözenek bağlanır. Bu protokol, TRIP8b saflaştırılması ve HCN ve TRIP8b arasındaki etkileşimin küçük moleküllü inhibitörleri belirlemek için bir yüksek girdi boyunca araştırma gerçekleştirilmesi için bir yöntemin bir genişletilmiş tarifinde tarif edilmektedir. yüksek veri akışı tarama yöntemi olup floresan polarizasyon (FP) HCN1 Cı terminal kuyruğu tekabül eden asit peptidi, amino, bir florofor ile işaretlenmiş olan on bir büyük TRIP8b fragmanının bağlanmasını izlemek için tahlil tabanlı kullanmaktadır. Bu yöntem, izin verir 'hit' bileşikler yayılan ışığın polarizasyon değişikliği dayalı tespit edilecek. Doğrulama deneyleri sonra bileşikler artefakt değildir 'hit' emin olmak için yapılır.
Introduction
Hiperpolarizasyon aktive siklik nükleotid-kapılı (HCN) kanallar zarı uyarılımında 1 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadıkları kalp ve merkezi sinir sisteminde ifade edilmiştir. HCN kanalları HCN kanal fonksiyonu farmakolojik açıdan sınırlayan MDD 3 için yeni bir tedavi olarak etkili olabileceğini önermek için çeşitli gruplar yol açmıştır Majör Depresif Bozukluk (MDB) 2, patogenezinde sorumlu tutulmuştur. Ancak, doğrudan HCN kanalları hedefleyen, çünkü kalp aksiyon potansiyeli 4 önemli rolleri bir canlı değildir. İvabradin, tek FDA HCN kanalı antagonisti onaylanmış bir bradikardik etki 5 üretilmesi için, kalp yetmezliğinin tedavisi için kullanılır. Bu nedenle, merkezi sinir sisteminde, sadece HCN kanalı fonksiyonunu sınırlar farmakolojik maddeler için bir ihtiyaç vardır.
tekrar içeren tetratricopeptide Rab8b etkileşen protein (TRIP8b) beyin spesifik olanHCN kanalları 6,7 yüzey ekspresyonunu ve yerelleştirme kontrol HCN kanalları fic yardımcı alt birimi. TRIP8b genetik nakavt kalp 8 HCN ifade etkilemeden beyin HCN kanalları 7 bir azalmaya neden olur. İlginçtir, TRIP8b nakavt fareler zorla yüzmeye görev ve kuyruk süspansiyon görevi 7, antidepresan etkinliği 9-11 için iki yaygın olarak kullanılan tarama testlerinde daha az zaman hareketsiz geçirirler. Bu sonuçlar, doğrudan, HCN kanal işlevinin küçük bir molekül antagonisti ile HCN kanalları, hedefleme antidepresan benzeri bir davranış üretilmesi için yeterli olabilir TRIP8b ve HCN arasındaki etkileşimi kesintiye yerine işaret etmektedir.
TRIP8b iki farklı bağlanma bölgelerinde HCN bağlanır. HCN'nin siklik nükleotid bağlama alanı (CNBD) TRIP8b 12,13 TPR alanlarına TRIP8b bulunan N terminal korunmuş bir alan ile etkileşime girer. Bu katılan CNBD kalıntıları rağmenetkileşim 14 haritalanmıştır, ilgilenmektedir TRIP8b bölgesi bir-80-amino asit fragmanı 13 ötesinde daralmış edilmemiştir. İkinci etkileşim TRIP8b ve tetratricopeptide tekrar (TPR) etki ve HCN C terminal tripeptit (HCN1, HCN2 ve HCN4 içinde 'SNL', ama HCN3 içinde 'ANM') 3,12 arasında oluşur. Bu C kuyruk etkileşimin son zamanlarda çözülmüş kristal yapısı 15 5 (PEX5) peroxin, peroksizomal ithalat reseptörü arasındaki etkileşim için önemli yapısal benzerlik ortaya koymuştur ve onun tip 1 Peroksizomal hedefleyen dizileri (PTS1) 16 içeren, ortakları etkileşim.
Her iki etkileşim siteleri HCN kanal fonksiyonu için gerekli olmasına rağmen, TRIP8b TPR etki ve HCN1 C terminali tripeptid arasındaki etkileşim baskın bağlanma yeri olarak hizmet vermektedir ve HCN yüzey ekspresyonunu düzenler. Bu nedenle, bu etkileşimin bu çalışmada hedefleme site olarak seçildi.Bir referans TRIP8b ve HCN arasındaki etkileşim yapılır yazının, geri kalanı için, o sevk edilirken bu etkileşimdir. Bu etkileşim içeren onun korunmuş Cı terminaline HCN C terminal kuyruğu (kalıntılar TRIP8b 1a-4 izoform 241-602) 3 bağlanması için gerekli TPR etki gelen TRIP8b bir yüksek derecede çözünür bir parçası tarafından değinmeyecek.
Bu etkileşimini bozabildiklerini küçük molekülleri tanımlamak için bir yüksek girdi boyunca araştırma geliştirmek için bir floresan polarizasyon (FP) deneyi 17 kullanılmıştır tabanlı. Floresan polarizasyon polarize ışık ve yayılan floresan 18 polarizasyon derecesinin ölçülmesi ile florofor-etiketli ligandın uyarım dayanır. Bir bağlanma partneri varlığında, floresan ligandının dönme hareketi kısıtlanır ve polarize ışık 19 çıkar. bir bağlanma partneri, T yokluğundaO ligandın dönme hareketi depolarize ışığın yayılmasına neden olur.
Kapalı protokol, Nikel nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) boncuklar kullanılarak N-terminal-etiketli (6xHis) TRIP8b saflaştırılması (241-602) için bir yöntem sunulmaktadır. Benzer bir protokol protokolü aşama 7'de kullanılan glutation-S-transferaz (GST) etiketli Cı HCN1 terminal 40 amino asitleri (HCN1 C40) saflaştırmak için kullanıldı. uzay hususlar için bu prosedürün ayrıntılı bir açıklaması ihmal edildi.
Protokol 7. adımda 2'de, yüksek verimli tarama akışı (Şekil 1 e bakınız) verilmiştir. Protein-protein etkileşimleri yüksek verimli tarama için oldukça zordur hedef ve okuyucular konu 20 ek kaynak bulmak için tavsiye edilir.
2. adımları ve prosedürün 3 fo inşa saflaştırılmış TRIP8b (241-602) in vitro afinite karakterizeRA floresein izotiosiyanat (FITC) HCN1 (HCN1 FITC) C terminal kuyruğu tekabül eden on bir amino asit peptidi etiketli. TRIP8b-HCN kompleksi 15 kristal yapısına göre, bu on bir amino asit segmenti TRIP8b (241-602) bağlanma sağlamak için yeterlidir. Adım 2'de, etkileşim Kd HCN1 FITC sabit bir konsantrasyonu (241-602) TRIP8b titre ile ölçülür. Aşama 3'te, aşama 2'de kullanılan HCN peptidin etiketlenmemiş versiyonu FITC etiketi bağlanmasını engellemeye, incelemek için her iki TRIP8b (241-602) ve HCN1 FITC sabit bir konsantrasyonu titre edilir. Bu deneyler, yüksek girdi boyunca kullanılan TRIP8b (241-602) ve HCN1 FITC uygun konsantrasyonlarının seçilmesinde için gereklidir.
Yüksek girdi boyunca araştırma öncül bir dec üretecek TRIP8b (241-602) ile HCN1 FITC arasındaki etkileşimi kesintiye yeteneğine sahip küçük moleküllüPolarize ışık içinde artma. Aşama 4'te, tahlil Z faktörü deneyi yüksek verimli tarama teknikleri (aşama 5) için uygun olduğundan emin olmak için TRIP8b (241-602) ve HCN1 FITC belirli bir konsantrasyonu için 21 hesaplanmıştır. 6 ve 7 ilköğretim yüksek kapasiteli ekranında tanımlanan isabet TRIP8b (241-602) ve HCN1 FITC arasında yerine spesifik olmayan mekanizma yoluyla etkileşim bozarak hareket onaylamak için doğrulama deneyleri vardır Adımları. Adım 6'da, carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) HCN1 peptit (HCN1 TAMRA) FITC etiketi kullanılarak AP deneyi tehlikeye floresan bileşikler filtre bir başka benzer floresan polarizasyon tahlili kullanılan bir etiketli. Adım 7 daha büyük bir HCN1 Cı terminal parçası (HCN1 C40) kullanır ve proteinler etkileşerek birbirine yaklaştırılır bir alıcı boncuk bir takviye kordonu bir tekli oksijen 'tünel' göre bir tane bazlı yakınlığı deneyi kullanmaktadır 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
TRIP8b (241-602) Protein 1. Saflaştırma
- Yeterli E. halinde bakteriyel protein ifade vektörü pGS21 3 (241-602) TRIP8b ihtiva eden plazmid Dönüşümü E. coli, üreticinin talimatlarına uygun olarak protein ekspresyonu için. Plaka Luria Broth (LB) kültürün 300 ul kloramfenikol ve Ampisilin 5 ug / ml -agar. 16 saat 37 ° C'de inkübe plakası.
- Sonraki gün, tek bir koloni kloramfenikol, ampisilin 50 ug / ml, 50 ml LB aşılamak için seçin. (Çalkalama ile), 16 saat boyunca 37 ° C 'de kültür inkübe edin.
- Ampisilin 50 ug / ml LB 1 L 50 mi kültür ekleyin. çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
- Kültür 0.8-1.2 OD 600 okuma ulaştığında, 18 ° C kuluçka sıcaklığının değiştirilmesi ve 1 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar IPTG (İzopropil-beta-D-tiyogalaktozid) ekleyin. protein ifadesi 16 saat devam etmesine izin.
- E. Spin 4 ° C'de 15 dakika boyunca 6000 x g'de coli bakteri pelet. santrifüj tüpleri çıkardıktan sonra, prosedürün kalan buz üzerinde bakteri tutun. fenilmetansülfonil florit, 0.25 mM (PMSF) ile tampon A 36 ml bakteri yeniden süspanse edin.
- yüksek güçte ve 30 saniye 'off' 'açık' 30 saniye arasında değişen, 5-10 dakika için düz bir cıvata kullanarak buz üzerinde yeniden süspanse bakteri ses dalgalarına maruz.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin. süpernatant henüz belli değilse ek bir 15 dakika boyunca santrifüj.
- 2 mi Ni-NTA boncuk kolonu süpernatantı uygulanır. hafifçe çalkalanarak 4 ^ 'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
- Bağlanmamış malzeme sütun aracılığıyla akan akış ve Tampon A, 500 ml ile yıkanır izin ver
- Tampon B ve 250 ml kolon yıkaması
- Tampon A 125 mi, 5 mM imidazol ile takviye edilmiş olan bir sütun yıkayın.
- sağa sola proteinini ayrıştırmak20 mi, elüsyon tamponuyla m.
- Bir şırınga kullanılarak - bir diyaliz kaseti (10 kDa moleküler ağırlık cutoff) ile elüt protein ekleyin. 4 ° C'de soğutulmuş fosfat tamponlu tuz (PBS) 4 L 60 dakika için protein dialyze.
- soğuk PBS yeni bir 4 L kovaya diyaliz kaseti taşıyın. 4 O ° C'de 16 saat için protein dialyze
- Ertesi sabah, imalatçının talimatları izlenerek, Coomassie protein tahlili kiti kullanarak protein konsantrasyonunu kontrol edin. 40 uM'nin altında bir konsantrasyon gözlenmesi halinde, üreticinin talimatlarına, bir protein yoğunlaştırıcı kullanarak aşağıdaki protein konsantre ol. depolama için -80 ° C'de kısım ve dondurularak.
2. Küçük Ölçekli Floresan Polarizasyon Tahlili İki Protein Fragmanlar Etkileşimi karakterize etmek
- 40 uM TRIP8b (241-602) 200 ul çözülme ve 1.5 ml tüp ekleyin. 11 1.5 ml tüpler için 100 ul PBS ilave edin.
- , Serinin bir sonraki tüp orijinal tüp TRIP8b (241-602) 100 ul transfer aşağı yukarı pipetleme ve ve süreci tekrarlayarak seri dilüsyonları gerçekleştirin. Bu 0.01-40 uM arasında değişen TRIP8b (241-602) 2-kat seyreltilmiş 12 nokta dizi üretecektir.
- 0.1 uM HCN1 FITC (10 uM kısım 6.5 | il) ve PBS içinde 2 mM ditiyotreitol (DTT) içindeki bir 650 ul ana karışımı hazırlayın.
Not: master miks 2x olduğunu. - 12 yeni 1.5 ml tüpler ayarlayın. Her tüpe HCN1 FITC içeren ana karışımı 50 ul ekleyin ve 12 seri seyreltme her birinden 50 ul ilave edin.
Not: Bu 12 tüp oluşturur, her orijinal seri seyreltme 0.05 uM HCN1 FITC içeren ve TRIP8b (241-602) 'ın konsantrasyonunun yarısı. - üç kopya halinde, oyuk başına bir deney plakasına 30 ul dilüsyon serisi ekleyin. düşük bir bağlanma düz siyah 384 oyuklu plaka kullanınız.
- plaka f Spinveya oda sıcaklığında 900 x g'de 2 dakika.
- , Bir mikro-okuyucu kullanarak üreticinin yönergeleri izleyerek plakasını okuyun. Aşağıdaki ölçüm parametreleri kullanarak floresan polarizasyon ölçün: 485 nm uyarma, 530 nm emisyon, 505 nm dikroik ayna, 100 milisaniye entegrasyon süresini.
- TRIP8b logaritmik ölçekte (241-602) konsantrasyonu karşı polarizasyon (MP) değerleri çizilir. Etiketli HCN1 peptidi TRIP8b (241-602) afinitesi (Kd) belirlemek için Hill denklemine veri takın.
Not: seri dilüsyonları hazırlanması için bir çok-yuvalı plakası da yerine tüpler kullanılabilir.
3. Pozitif Kumandanın Kullanılması Protein-protein Etkileşim inceleyin
- 1.5 ml tüp etiketlenmemiş HCN1 peptid (200 uM) 200 ul ekle. 11 1.5 ml tüpler için 100 ul PBS ilave edin. birinci tüp peptidin 200 ul ihtiva eden tüp 100 ul transfer seri sulandırmalar gerçekleştirmek100 ul PBS. etiketsiz HCN1 peptid 2 kat seyreltmeleri ile 12 tüpler oluşturmak için işlemi tekrarlayın.
- 0.2 uM HCN1 FITC ve 4 mcM TRIP8b (241-602) bir 650 ul ana karışımı hazırlayın.
Not: Bu, 2x çözümdür. - 12 yeni 1.5 ml tüpler ana karışımı 50 ul ekleyin.
- 1.5 ml tüp her seri seyreltme 50 ul ekle.
- oyuk başına 30 ul ekleyerek, üç kopya halinde siyah 384 oyuklu bir mikrotiter plaka yükleyin.
- Oda sıcaklığında 900 x g'de 2 dakika süre ile plaka santrifüjleyin.
- FP edebilen bir mikrolevha okuyucusu kullanılarak plaka okuyun. Adım 2.7 açıklandığı gibi aynı ayarları kullan.
- Kd 1 = IC50 / (1 + [L] / Kd 2), Kd 1 etiketlenmemiş afinitesini temsil eder, Cheng-Prusoff denklemi kullanılarak TRIP8b için etiketlenmemiş peptid (241-602) afinitesini hesaplayın TRIP8b (241-602), IC50 için peptit önceki aşamada belirlenenve etiketlenmiş ligand yer değiştirmesi için, etiketlenmemiş ligandın yeteneği, [L] adım 3.2 etiketli ligandın konsantrasyonudur temsil eder ve Kd 2 etiketli ligand için TRIPb (241-602) arasında eğilimidir.
4. Değerlendirin Testi Performansı (Hesapla Z Faktörü)
- 2 uM TRIP8b (241-602), 50 nM HCN1 FITC ve AP tampon maddesi içinde 1 mM DTT ile AP tamponu 12 mi çözelti yapılarak bir ana karışımı hazırlayın.
Not: Bu 40 uM TRIP8b (241-602) 60 ul, 10 uM HCN1 FITC 60 ul ve FP Tampon 1.080 ul gerektirir. - Siyah bir 384-oyuklu mikro titer plakanın her oyuğuna ana karışımı 30 ul ekle.
- Bir pozitif kontrol olarak hizmet etmek üzere 192 gözlere 1mM etiketsiz HCN1 peptid 1 ul ekle.
- bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere 192 gözlere AP tamponu 1 ul ekle.
- Oda sıcaklığında 900 x g'de 2 dakika süre ile plaka santrifüjleyin.
- Bir mil kullanarak plaka okumacroplate okuyucu.
- Aşağıdaki formül kullanılarak tahlil Z faktörü hesaplanır: Z = 1-3 * (σ POS -σ negatif) / (μ negatif -μ POS) σ POS ve σ negatif pozitif ve negatif kontrol kuyuları, standart sapmaları göstermektedir burada ve μ pos ve μ neg pozitif ve negatif kontrol kuyuları ortalama sinyalleri temsil etmektedir.
5. Yüksek Verimli Ekran
- TRIP8b (241-602) ve HCN1 FITC hacimde çözülme ve buz üzerinde saklayın.
- AP tamponu TRIP8b (2 uM) ve HCN1 FITC (50 nM), 10 ml hazırlayın.
- Bir pipet kullanarak 384 oyuklu siyah mikrotitre plaka bağlama düşük her oyuğuna karışımı 25 ul koyun.
- kütüphanesinin taranması için bir akustik sıvı tutucu kullanarak sütun her çukuruna 3 (her biri 40 uM son konsantrasyon) 22 içine bileşikleri ekleyin.
Not: nedeniyle şansı göreceli içinBu deneyde gözlemlenen Y, düşük isabet oranı, iki farklı bileşik, tek bir kuyunun içine toplanmıştır. her aktif kuyudan iki bileşik sonradan aktiviteyi haiz olduğunu belirlemek için tek tek test edilmiştir. - sütun 1 ve her bir levhanın 23 negatif kontroller olarak her bir kuyunun içine dimetil sülfoksit (DMSO), 100 NL ekleyin.
- sütun 2 ve her plakanın 24 pozitif kontroller olarak her bir kuyunun içine etiketlenmemiş HCN1 peptid ekleyin.
- 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Tabaklar ve okumadan önce 16 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Bir plaka okuyucusu üzerinde flüoresans polarizasyon ölçün. Adım 2.7 açıklandığı gibi aynı ayarları kullan.
- % 100 olarak her plaka ortalama pozitif ve negatif kontrolleri kullanarak sinyalleri normalize ederek yüzde inhibisyon hesaplayın. X, N sinyali X karşılık gelen normalize inhibisyon yüzdesi olduğu, X, POS denklemi XN =% 100 * (- X -) / (X-negatif x POS) (X negatif) kullanarak neg, negatif kontrol kuyularından sinyalidir.
TAMRA etiketli HCN Peptide kullanma Hits 6. Onay
- Doğrulama TAMRA etiketli HCN1 peptit (HCN1 TAMRA) kullanılarak% 50'nin üzerinde inhibisyonu ile vurur.
- 2 uM TRIP8b (241-602) ve 50 nM TAMRA HCN1 FP tamponu 12 ml bir ana karışımı hazırlayın.
- Siyah bir 384-oyuklu mikro titer plakanın her oyuğuna ana karışımı 25 ul koyun.
- İlgili gözlerdeki her bir aktif bileşiklerin seri dilüsyonları aktarın. Her birinin konsantrasyonu, 200 uM 0.2 uM arasında değişir isabet iki kat seyreltileri bu sağlayın.
- Negatif kontrol reaksiyonları için, her bir kuyunun içine DMSO, 100 NL aktarın. Pozitif kontrol için ila 200um arasında 0,1 mikron arasında değişen nihai konsantrasyona sahip seri olarak seyreltilmiş etiketlenmemiş HCN1 peptidin 100 NL ekleyin.
- Oda sıcaklığında plaka inkübe2 saat. Tabaklar ve 4 ° C'de 16 saat boyunca inkübe okumadan önce ° C.
- Aşağıdaki ölçüm parametreleri kullanarak floresan polarizasyon (MP) ölçün: 535 nm Tahrik olma; 580 nm emisyon; 535 nm dikroik ayna, 20 msn entegrasyon süresi.
- Dört parametreli doğrusal olmayan bir regresyon modeli 23 kullanılarak her bileşiğin konsantrasyonu göre AP verileri uydurularak IC50 değerlerini hesaplar.
Boncuk tabanlı yakınlık Testi 7. Doz-yanıt Doğrulama
- His ile etiketlenmiş TRIP8b (241-602) (His-TRIP8b) ve GST etiketli HCN1 (GST HCN1 C40) füzyon proteinlerinin 1 kısım Çözülme ve buz üzerinde saklayın.
- 400 nM His-TRIP8b 40 nM GST HCN1 C40 konsantrasyonlarda deney tamponu içinde GST-HCN1 C40 ile His-TRIP8b birleştirin. Her bir bileşik için karışımın 300 ul Hazırlama Test edilecek.
Not: Bileşikler 11 farklı konsantrasyonda artı DM üç kopya halinde çalıştırılırSO kontrolü (yok bileşik). - Kontrol kuyuları, GST-HCN1C40 olmayan His-TRIP8b (200 nM) 30 ul hazırlamak ve daha sonra ayrı ayrı analiz tamponu içinde His-TRIP8b GST-HCN1C40 (20 nM), 30 ul hazırlar.
- 16 kanallı bir pipet kullanarak bir plaka 36 oyuklarına (yukarıdaki adım 7.2 hazırlandı) GST-HCN1 C40 karışımı: Her bir bileşik, test edilecek için His-TRIP8b 7 ul ekle. tek bir bileşik test etmek için, satırlar AL içinde 12 farklı konsantrasyonda ve sütun 1-3'te üç kez tekrarlanmış sağlayabilir. Sütun satır N. 1-3 sütun satır M 1-3 ve (7.3 hazırlanan) GST-HCN1 C40 çözeltisi 7 ul için (7.3 hazırlanmış) His-TRIP8b solüsyonu 7 ul ekleyin Kısaca plaka için santrifüj sıvılar her bir kuyunun dibinde olmasını sağlamak ve herhangi bir kabarcıklarını çıkarmak için.
- Dağıtın isabet bileşiklerin her konsantrasyonu (satırdaki K) 0,1 uM kadar (A sırasında), 200 uM aralıkları isabet şekilde plaka test edilecek. bir hacim koyunsatırlar AK dağıtılan bileşik miktarını eşleşen satırları LN DMSO.
- 2 dakika boyunca plaka çalkalanır ve oda sıcaklığında 2.5 saat süreyle inkübe edin.
- deney tamponu anti-GST Alıcı boncuk 1:50 seyreltin.
- 16-kanallı pipet ile plaka her kuyuya seyreltilmiş Alıcı boncuk 3.5 ul ekleyin ve hafifçe hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için pipetleme karıştırın.
- karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
- deney tamponu ile nikel chelat Donör boncuk 1:50 seyreltin. ışığa Karışımı maruz bırakmayın.
- 16-kanallı pipet ile plaka her kuyuya seyreltilmiş Donör boncuk 3.5 ul ekleyin ve hafifçe hava kabarcıkları oluşturarak önlemek için pipetleme karıştırın.
- karanlıkta, oda sıcaklığında 1.5 saat inkübasyona bırakılır.
- Bir plaka okuyucusu üzerinde okuyun. 40 msan uyarma zaman, 100 msn emisyon süresi, 0.1 mm algılama yüksekliği: Aşağıdaki ölçüm parametreleri ile bir plaka okuyucu kullanın.
- EAC için uydurma verilerle IC50 değerleri hesaplamakdört parametreli doğrusal olmayan regresyon modeli 23 ile h bileşik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önceki yayın ile telif hakkı sorunları önlemek için, bir TAMRA-etiketli sonda HCN1 TAMRA Şekil 2 ve 3 üretmek için kullanıldı. Bu ikame sonuçlarında kayda değer bir fark olmadığını unutmayın ve protokoller HCN1 FITC ile yukarıda özetlenen aynıdır. HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) ile etkileşimi ölçmek için Adım 2 (Şekil 2) belirtilen protokol kullanılarak HCN1 TAMRA sabit bir konsantrasyonu titre edildi. Daha sonra, adım 3'te tarif deneyi gerçekleştirildi ve etiketlenmemiş HCN1 peptid TRIP8b (241-602) ve HCN1 TAMRA (Şekil 3) sabit bir konsantrasyonu titre edildi.
Deney, yüksek miktarda madde taraması için uygun olduğunu doğrulamak için, performansı aşağıdaki aşama 4'te protokolü tarafından incelenmiştir; ve 0 olan bir Z faktörü.89 deney yüksek verimli tarama teknikleri (Şekil 4) hazır olduğunu belirten elde edilmiştir. Daha sonra, 20,000 bileşiği, küçük moleküllü kütüphanesi% 50'nin üzerinde yüzde inhibisyonu gereken bileşikler daha sonra HCN1 TAMRA (adım 6) ikinci AP deneyde test edilen adım 5'te belirtilen prosedür ile tarandı. Son olarak, teyit isabetler tane bazlı yakınlığı deneyi (aşama 7, Şekil 5) test edildi. NUCC-5953 Bir hit bileşik, bu deneylerin bir sonucu olarak tespit edilmiştir.
Şekil 1: İş Akışı HTS şematik yüksek verimli tarama teknikleri akışını açıklayan.. Protokolünde bir adım temsil eden her üçgen yukarıdan aşağıya gelen Diyagram ilerler. Bir görmek için buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.
Şekil 2:. Protein-protein etkileşimi Kd (A) şematik TRIP8b olarak adım 2'de tarif edilen deney gösteriyor (241-602) HCN1 TAMRA sabit bir konsantrasyonu titre edilir, (gri) TRIP8b TPR alan bağlama 11 amino asit peptide (terminalin 'SNL' ile siyah, vurgulanan). TRIP8b konsantrasyonu (B) (241-602) arttıkça, daha HCN1 TAMRA molekülleri bağlı ve polarizasyon artar (KD = 0.320.01μM) haline gelir. Hata çubukları standart sapmayı ifade etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. Pozitif kontrol IC50 (A) aşamasında 3 olarak etiketlenmemiş HCN1 peptidi için şematik gösteren deney paradigma TRIP8b (241-602) ve HCN1 TAMRA sabit bir konsantrasyonu titre edilir, etiketli peptid yer değiştirir. (B) HCN1 TAMRA yer değiştirmesine (IC50 = 1.070.08μM) gösteren sinyal etiketlenmemiş HCN1 konsantrasyonu arttıkça azalır unutmayın. Hata çubukları standart sapmayı ifade etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. HTS gelen Temsilcisi Sonuçlar (A) yüksek verimli sc Sonuçları Reen adım 5'te grafik üzerindeki her bir nokta, tek bir bileşik temsil belirtilen protokol kullanılarak gerçekleştirildi. X ve Y koordinatları, her vadede yüzde inhibisyonu belirlenir. Ekranından (B) Sonuçları pozitif ve negatif kontroller (efsane bakınız) ile çizilen. Her bileşik ortalama yüzde inhibisyonu (deneyinin iki çalışan karşısında) Y ekseni üzerine çizilir. Bir TAMRA etiketli HCN1 peptidi kullanılarak teyit AP deneyleri (C) sonuçları. 5. adımda% 50'den daha fazla önleme gösteren bileşikler daha sonra, (A) 'da olduğu gibi aşama 6'da kullanılan X ve Y koordinatları deneyin iki çalışır yüzde inhibisyonu belirlenir edildi. Han ve ark., 3 çoğaltılamaz. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
40 / 54540fig5.jpg "/>
Şekil 5:. Boncuk merkezli Yakınlık Deneyi (A) şematik boncuk tabanlı yakınlık deneyi gösteren. TRIP8b (241-602) Nikel Şelat donör boncuklar bağlayan bir N terminali hekzahistidin etiketi (çizgili daire) içerir. HCN1 C40 alıcı boncuklar bağlayan bir N terminali GST etiketi içerir. TRIP8b TPR etki ve HCN1 C terminal tripeptid etkileşimiyle yakınlığı haline getirdiğinde, 680 nm dalga boyu ışık ile donör boncuk uyarma singlet oksijen üretir. Bu tekli oksijen enerji aktarır tanımlanmış bir yarıçap içinde boncuk alıcısı ve ışığın yayılmasına yol açar. TRIP8b (241-602) ve HCN1 C40 sabit bir konsantrasyonu, hit bileşik (NUCC-5953) artan konsantrasyonlarının (B) titrasyon. Han ve ark., 3 çoğaltılamaz. Hata çubukları standart sapmayı belirtir.target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çünkü MDD 24 bir tedavi hedefi olarak potansiyeli, merkezi sinir sisteminde 4 HCN kanal fonksiyonunu antagonize farmakolojik yaklaşımlar önemli ilgi olmuştur. Ancak bu çabalar kalp kalp vurusu HCN kanallarının önemli rolü ve aritmi 25 riski ile durmuş durumda. Biz HCN ve beyin özel yardımcı alt birimi, TRIP8b 8 arasındaki etkileşimi kesintiye kardiyak HCN kanalları 3 etkilemeden antidepresan benzeri etkiler üretmek için yeterli olabileceğini gerekçeli. Bu hipotez fareler antidepresan benzeri davranışlar 7 sergilemek TRIP8b eksik gözlem takviye edildi. Bu etkileşimi hedef alan MDD tedavisi için yeni bir paradigma haline gelebilir.
TRIP8b TPR etki alanları ve HCN1 C terminal tripeptid arasındaki etkileşimin küçük moleküllü önleyicilerinin tespit edilmesi için ayrıntılı bir protokolYukarıda sunulan. genel uygulamayı kolaylaştırmak için, burada bu tahlilde geliştirilmesine yol eden mantık açıklar. TRIP8b iki yerde HCN alt birimlerine bağlanır rağmen, biz TRIP8b TPR etki ve HCN C terminal kuyruğu arasındaki etkileşim üzerinde duruldu. X-ışını kristalografisi ile bu etkileşimin yapı tayini HCN 15 C terminal çevresinde TRIP8b TPR etki oluşturduğu derin cep saptandı. İkinci TRIP8b-HCN etkileşimi (TPR etki için N terminal bulunur) TRIP8b bir 80 amino asit kısmının ve HCN siklik nükleotid bağlama alanı arasında gerçekleşir. Bu etkileşim, her bir proteinin farklı amino asit arasında oluşur ve daha az iyi tanımlanmış arası etkileşimlerin 26 diffüz yüzeyi oluşturmaktadır. Bu yapısal gözlemlere dayanarak, biz TRIP8b TPR etki ve HCN C terminali arasındaki etkileşim küçük bir molekül inhi tarafından bozulmasına karşı daha hassas olduğunu gerekçeliBITOR.
Başlangıçta, TRIP8b daha büyük bir parçası, daha uzun bir yapı allosterik düzenleme sitesi ve başarı olasılığını arttırabilir varsayımına dayalı analizde kullanılmıştır. Tam boy TRIP8b başlangıçta kullanılan, ancak bu yaklaşım döngülerini Donma-çözülme protein birikimini, bozulma ve duyarlılık ile sınırlı kalmıştır. Daha sonra, iki orta derecede boyutlu TRIP8b oluşturur, daha uzun bir (kalıntılar 219-602) ve daha kısa bir (kalıntılar 259-602), bir ara yapısı önce test edildi (kalıntılar 241-602) seçildi. Yukarıda tarif edilen dört kesikler her HCN'nin Cı terminaline bağlanması hakkında TPR alanlan ihtiva eden, ancak, sadece ara uzunluktaki bir klon (241-602) tarama tahlillerinde kullanım için yeterli bir stabilite göstermiştir. Özellikle, ek bir ayırma adımlar olmadan Ni2 + afinite kromatografisi ile saflaştırma işlemlerinden sonra, proteinin büyük miktarlarda elde etmek mümkün oldu.
Choos sonraTRIP8b ve HCN uygun bir fragmanını kullanarak, sonuçta aşağıdaki TRIP8b (241-602) için işaretlenmiş HCN1 peptidin afinitesi belirlenmiştir. Genel bir kural olarak, doğru bir ölçüm sadece çok ligandın konsantrasyonu büyük ölçüde bağlama ortağı 28 Kd altında ise yapılabilir. Bizim durumda, aşama 2'de deney için etiketli HCN1 peptidin 50 nm ve 0.320.01μM bir Kd elde edilmiştir. Protein-protein etkileşimleri konusunda daha deneysel tasarım konuları için okuyucular konuyla 27-30 birkaç mükemmel değerlendirmeleri birine denir.
Biz TRIP8b için etiketli HCN1 peptid (241-602) K D belirlendikten sonra etiket kendisi bağlayıcı engelliyorsa, biz o zaman karar verdi. Aşama 3'te, etiketli peptid yerinden TRIP8b (241-602) 'in bir sabit konsantrasyonu, bir etiketlenmemiş HCN1 peptidi titre 1.070.08 uM'lik bir IC50 değeri elde edilmiştir. K D ile birlikte TRIP8b (241-602) ve Cheng-Prusoff denklemi uygulamak için peptid etiketli Daha sonra KD = 0.93μM olarak TRIP8b (241-602) için, etiketlenmemiş peptidin afinitesi tahmin etmiştir. Bu işlem, işaretlenmiş peptidin TRIP8b (241-602) arasında bir afinite ile yakın uyum içinde olan, ve Peptid etiketleme esas TRIP8b afinitesi etkilemediğini göstermektedir. 0.89 Z faktörü ile gösterildiği gibi floresan polarizasyon bazlı bir elek önemli bir özelliği, gürültü oranı, mükemmel bir sinyaldir. Aynı şey diğer parametreler ile, FP sinyal değişikliği büyüklüğü bağlanma ortağı (TRIP8b (241-602)) ile fluoroforla işaretlenmiş ligandın boyutu ile belirlenmektedir. (44 ila 224 MP) polarizasyon bir değişiklik ile serbest ve bağlı devletler arasında 11 amino asit peptid ligand ile gözlenen ~ 42 kDa TRIP8b (241-602) proteini hedef etkileşimi çoğaltmak yeterli ve yeterli bir dinamik aralığı sağlar belge görüntüleme için.
ntent "> herhangi bir yüksek verimli tarama testinin zorluklardan biri gerçek ayırt sinyal yoğunluğunda artefakt değişikliklerden bileşikleri 'hit' olduğunu. floresan polarizasyon tabanlı ekranlar, pek çok bileşikler fluorofor ile doğrudan etkileşim veya floresan ya sık görülen bir durumdur kendi., iki farklı florofor ile iki aşamalı bir tarama yöntemi, yukarıda açıklanan bu sorunları aşmak için. Bu prosedür, flüoresan bileşikler ve bileşiklerin taranması işlemi boyunca ilerler florofor ile doğrudan etkileşim olasılığını azaltır. Ayrıca fluorofor bağlanma bazı bileşikler, in vitro olarak 'toplayıcılar "olarak hareket eder ve floresan polarizasyon sinyali spesifik olmayan değişikliklere yol açar. bu bileşikler, protein-protein etkileşimleri 31,32 deterjan duyarlı misel yapılarının oluşturulması ve engellediği düşünülmektedir. bu etkileri azaltmak için, bu önemlidir yüksek kullanılan floresan polarizasyon tamponuDiğer deterjan ilave doğrulama düşünülmelidir, ancak yukarıda belirtilen veri akışı tarama protokolü, bir deterjan (Triton) içerir.Yukarıda tarif edilen tarama prosedürü birçok önemli sınırlamalar olduğu not edilmelidir. TRIP8b iki konumda HCN'nin bağlanan, ancak yukarıda tarif edilen ekran tek etkileşim bölgesi inceler ve CNBD etkileşimi hedefleyen küçük molekülleri tanımlamak olmaz. Benzer şekilde, alosterik N terminal bölgesinde TRIP8b ile etkileşerek TRIP8b HCN'nin bağlanma modüle eden bileşikler, vuruşlar halinde tespit edilmez. Bu hususlar her iki prosedür de tarif tarama tahlillerinde tekrarlanabilirlik sağlayan bir küçük TRIP8b fragmanı (yukarıya bakınız) kullanılarak bir sonucudur. Bu sınırlamaları önlemek için, gelecekteki çabalar tam uzunlukta HCN içeren bir hücre bazlı ekranı kullanarak yönelik olabilir ve TRIP8b 33,34 oluşturur. Ekranın Bu tür yüksek t güveniyor olabilirHCN ve TRIP8b arasındaki etkileşimi kesintiye ve hücre yüzeyinde HCN kanalları ekspresyonunda sınırlama yeteneğine sahip bileşimleri belirlemek için, elektrofizyolojik yöntemler hroughput. Not, bu in vivo kapalı hedef etkilere yol açabilir olarak bu, küçük moleküller doğrudan antagonistleri olarak HCN kanal fonksiyonunu sınırlayıcı değil emin olmak için karşı ekranları dahil etmek gerekir gibi yaklaşımlar.
HCN1, HCN2 ve HCN4 rağmen tüm korunmuş 'SNL' Cı terminali peptidi olan bu tripeptid tortudur N ucu esas olarak ve büyük olasılıkla değişir TRIP8b bağlanma afinitesine etkiler. Bu küçük bir molekül ekran tarafından elde edilen veya TRIP8b-HCN etkileşimi bozan HCN izoformu özgüllük sağlayabilir diğer hit bileşiklere göre tasarlanmış hit ihtimalini yükseltir. Orijinal ekranında, NUCC-5953 TRIP8b ve HCN1 3 arasındaki etkileşimi parçalanmaları nedeniyle ilk küçük molekül olarak tespit edilmiştir. gelecek kelilaç gelişimi için istenen kimyasal özelliklere sahip ek bir küçük molekül inhibitörleri tespit edebilir, bu test ile k.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Dialysis cassette | ThermoFisher | 66456 | |
| Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 - 1 gr | |
| 384-Well Black plate | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
| Anti-GST Acceptor beads | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| Protein concentrator | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | Agilent | 200131 |
References
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
- Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).
- Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
- Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
- Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
- Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
- Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
- Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
- Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
- Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
- Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
- Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
- Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
- Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
- Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
- Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
- Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
- Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
- Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
- Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
- DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
- Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
- Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
- Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
- Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
- McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
- Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).
