Summary
A interacção entre os canais HCN e a sua sub-unidade auxiliar tem sido identificada como um alvo terapêutico em Perturbação Depressiva Major. Aqui, um método baseado em polarização de fluorescência para identificar pequenas moléculas inibidoras desta interacção proteína-proteína, é apresentada.
Abstract
canais fechado nucleótidos cíclicos activada por hiperpolarização (HCN) são expressas ubiquamente em todo o cérebro, onde funcionam para regular a excitabilidade de neurónios. A distribuição sub-celular de estes canais em neurónios piramidais CA1 do hipocampo de área é regulada por tetratricopeptide proteína contendo repetição Rab8b interagindo (TRIP8b), uma sub-unidade auxiliar. nocaute genética de HCN formador de poros, subunidades ou TRIP8b, ambas conduzem a um aumento no comportamento do tipo antidepressivo, sugerindo que a limitação da função dos canais HCN pode ser útil como um tratamento para o transtorno depressivo maior (MDD). Apesar do interesse terapêutico significativo, os canais HCN também são expressos no coração, onde regulam ritmicidade. Para contornar problemas fora do alvo associados com bloqueio dos canais HCN cardíacos, nosso laboratório propôs recentemente visando a interação proteína-proteína entre HCN e TRIP8b, a fim de interromper especificamente função do canal HCN no cérebro.TRIP8b se liga a HCN poros formando subunidades em dois sítios de interação distintas, embora aqui o foco é sobre a interação entre o tetratricopeptide repeat (TPR) domínios de TRIP8b e a cauda do terminal C do HCN1. Neste protocolo, uma descrição expandida de um método para purificar TRIP8b e a execução de uma tela de alto rendimento para identificar inibidores de pequenas moléculas da interacção entre o HCN e TRIP8b, é descrito. O método de rastreio de elevado rendimento utiliza uma polarização de fluorescência (FP) à base de ensaio para monitorar a ligação de um fragmento grande TRIP8b para um onze marcado com fluoróforo amino ácido péptido correspondente à cauda do terminal HCN1 C. Este método permite que compostos "hit" a ser identificado com base na alteração na polarização de luz emitida. Os ensaios de validação são então realizadas para garantir que 'hit' compostos não são artificial.
Introduction
Canais fechado nucleótidos cíclicos activada por hiperpolarização (HCN) são expressos no coração e no sistema nervoso central, onde eles desempenham um papel importante na regulação da excitabilidade da membrana 1. Canais HCN têm sido implicados na patogênese de Transtorno Depressivo Maior (MDD) 2, o que levou vários grupos a propor que a limitação HCN função de canal farmacologicamente pode ser eficaz como um novo tratamento para MDD 3. No entanto, visando directamente os canais HCN não é viável devido ao seu papel importante no potencial de ação cardíaco 4. A ivabradina, a única FDA aprovou antagonista do canal de HCN, é utilizado para o tratamento de insuficiência cardíaca para produzir um efeito bradicárdico 5. Como tal, existe uma necessidade de agentes farmacológicos que limitam a função do canal de HCN exclusivamente no sistema nervoso central.
Tetratricopeptide repetir contendo proteína interagindo Rab8b (TRIP8b) é uma especificidade do cérebroFIC sub-unidade auxiliar de canais HCN que controla a expressão de superfície e localização dos canais HCN 6,7. Nocaute genético de TRIP8b provoca uma redução de canais HCN cerebrais 7 sem afetar a expressão HCN no coração 8. Curiosamente, camundongos knockout TRIP8b gastar menos tempo imóveis na tarefa de natação forçada e suspensão pela cauda tarefa 7, dois testes de triagem comumente utilizados para eficácia antidepressiva 9-11. Estes resultados sugerem que, em vez de ter como alvo directamente canais HCN com uma pequena molécula antagonista da função do canal de HCN, rompendo a interacção entre TRIP8b e HCN pode ser suficiente para produzir um comportamento do tipo antidepressivo.
TRIP8b se liga a HCN em dois locais de ligação distintos. O domínio de ligação de nucleótido cíclico (CNBD) de HCN interage com um domínio conservado de terminal de TRIP8b localizado N para os domínios de TPR TRIP8b 12,13. Embora os resíduos da CNBD que estão envolvidos nesteinteração foram mapeados 14, a região de TRIP8b que está envolvido não foi reduzida além de um-80 amino fragmento de ácido 13. A segunda interação ocorre entre os domínios tetratricopeptide repeat (TPR) do TRIP8b eo tripeptide do terminal C do HCN ( 'SNL' em HCN1, HCN2 e HCN4, mas 'ANM' em HCN3) 3,12. A estrutura cristalina recentemente resolvido 15 desta interação cauda C revelou semelhança estrutural substancial para a interação entre o receptor de importação peroxisomal, peroxin 5 (PEX5), e sua interação parceiros, contendo tipo 1 sequências peroxisomais alvo (PTS1) 16.
Embora ambos os sítios de interacção são necessários para a função do canal de HCN, a interacção entre os domínios de TPR TRIP8b e do tripéptido C-terminal de HCN1 serve como o sítio de ligação dominante e regula a expressão de superfície de HCN. Portanto, esta interacção foi escolhida como o local segmentação neste estudo.Para o restante do manuscrito, quando é feita uma referência à interacção entre TRIP8b e HCN, é essa interação que está sendo referido. Esta interacção, se condensa por um fragmento altamente solúvel de TRIP8b correspondente ao seu terminal C conservada contendo os domínios TPR necessários para a ligação da cauda de terminal C de HCN (resíduos 241-602 da 1a-4 isoformas de TRIP8b) 3.
A fim de desenvolver uma tela de alto rendimento para identificar pequenas moléculas capazes de interromper esta interacção, uma polarização de fluorescência (FP) à base de ensaio foi aplicado 17. Polarização de fluorescência baseia-se na excitação de um ligando marcado com um fluororo com luz polarizada, e a medição do grau de polarização da fluorescência emitida 18. Na presença de um parceiro de ligação, o movimento de rotação do ligando fluorescente é restringida e luz polarizada é emitida 19. Na ausência de um parceiro de ligação, tele o movimento de rotação do ligando leva à emissão de luz despolarizada.
No protocolo em anexo, um método para a purificação de N-terminal etiquetado (6xHis) TRIP8b (241-602) usando ácido nitrilotriacético-níquel (Ni-NTA) grânulos é apresentada. Um protocolo semelhante foi utilizado para purificar a glutationa-S-transferase (GST) tagged terminal C de 40 aminoácidos de HCN1 (C40 HCN1) utilizado no passo 7 do protocolo. Para considerações de espaço, uma descrição detalhada do procedimento que foi omitido.
Nas etapas 2 a 7 do protocolo, um fluxo de trabalho rastreio de alto rendimento é apresentado (ver Figura 1). Interações proteína-proteína são um alvo notoriamente difícil para triagem de alto rendimento e os leitores são aconselhados a procurar recursos adicionais sobre o tema 20.
As etapas 2 e 3 do procedimento caracterizar a afinidade in vitro do TRIP8b purificado (241-602) construir fora isotiocianato de fluoresceína (FITC) tagged onze péptido de aminoácido correspondente à cauda de C terminal de HCN1 (HCN1 FITC). Com base na estrutura de cristal do complexo de HCN TRIP8b-15, este segmento de ácido onze amino é suficiente para produzir ligação com TRIP8b (241-602). No passo 2, a K d da interacção é medida por titulação TRIP8b (241-602) para uma concentração fixa de HCN1 FITC. No passo 3, uma versão não marcado do péptido HCN utilizado no passo 2 é titulada para uma concentração fixa de ambos TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC para examinar se a etiqueta FITC interfere com a ligação. Estas experiências são essenciais para a selecção das concentrações adequadas de TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC utilizados na tela de alto rendimento.
A premissa de tela de alto rendimento que é uma molécula pequena capaz de impedir a interacção entre TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC irá produzir um DECRease em luz polarizada. No passo 4, o factor de Z do ensaio é calculado 21 para uma dada concentração de TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC para assegurar que o ensaio é adequado para rastreio de alta (passo 5). Passos 6 e 7 são ensaios de validação para confirmar que os sucessos identificados no ecrã rendimento primário alta estão agindo por perturbar a interação entre TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC em vez de através de um mecanismo não específico. No passo 6, carboxitetrametilrodamina (TAMRA) marcado com HCN1 péptido (HCN1 TAMRA) é utilizado num ensaio de polarização de fluorescência de outra forma idêntico ao filtrar os compostos fluorescentes que comprometem o ensaio de FP utilizando a marcação com FITC. Passo 7 utiliza um maior fragmento do terminal HCN1 C (HCN1 C40) e emprega um ensaio de proximidade baseado em talão, que se baseia no "encapsulamento" de um oxigénio singuleto a partir de um cordão de dador para um grânulo aceitador trazida para perto uma da outra por proteínas que interagem 22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. A purificação do TRIP8b (241-602) Proteína
- Transformar o plasmídeo contendo TRIP8b (241-602) no vector de expressão da proteína bacteriana pGS21 3 em E. competente coli para a expressão da proteína de acordo com as instruções do fabricante. Placa de 300 ul da cultura em caldo de Luria (LB) -agar com 5 ug / ml de cloranfenicol e ampicilina. Incubar a placa a 37 ° C durante 16 h.
- No dia seguinte, escolher uma única colónia para inocular 50 ml de LB com 50 ug / ml de cloranfenicol e ampicilina. Incubar a cultura a 37 ° C durante 16 h (com agitação).
- Adicionar 50 ml de cultura de 1 L de LB com 50 ug / ml de ampicilina. Incubar a 37 ° C com agitação.
- Uma vez que a cultura atingiu uma DO 600 de 0,8-1,2 leitura, alterar a temperatura do incubador a 18 ° C e adicionar IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactósido) até uma concentração final de 1 mM. Permitir que a expressão da proteína prosseguir durante 16 hr.
- Spin down a E. coli a 6000 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar as bactérias. Após a remoção dos tubos da centrífuga, manter as bactérias em gelo durante o restante do processo. Ressuspender as bactérias em 36 ml de tampão A com 0,25 mM de fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF).
- Sonicate as bactérias ressuspensas em gelo utilizando um parafuso plana durante 5-10 min, alternando entre 30 seg 'on' e 30 sec 'off' em alta potência.
- Centrifuga-se a 12000 xg durante 15 min a 4 ° C. Centrifugar para um adicional de 15 min se o sobrenadante ainda não está claro.
- Aplicar o sobrenadante a uma coluna de 2 ml de pérolas de Ni-NTA. Incubar durante 60 min a 4 ° C com agitação suave.
- Permitir que o material não ligado a fluir através da coluna e lava-se com 500 ml de tampão A.
- Lava-se a coluna com 250 ml de tampão B.
- Lava-se a coluna com 125 ml de tampão A suplementado com imidazole a 5 mM.
- Eluir a proteína from a coluna com 20 ml de Tampão de Eluição.
- Adicionar a proteína eluida com uma cassete de diálise (corte de peso molecular - 10 kDa), utilizando uma seringa. Dializar a proteína durante 60 minutos em 4 L de frio tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C.
- Mover a cassete de diálise em um novo 4 L balde de PBS frio. Dialisar proteína durante 16 horas a 4 o C.
- Na manhã seguinte, verificar a concentração de proteína usando um kit de ensaio de proteínas Coomassie, seguindo as instruções do fabricante. Concentra-se a proteína utilizando um concentrador de proteína, seguindo as instruções do fabricante, se uma concentração inferior a 40 uM é observado. Alíquotas e congelamento a -80 ° C durante o armazenamento.
2. Pequena Escala Polarização de Fluorescência de ensaio para caracterizar a interação dos dois fragmentos de proteína
- Descongelar 200 ul de 40 uM TRIP8b (241-602) e adicioná-lo para um tubo de 1,5 ml. Adicionar 100 ul de PBS para 11 tubos de 1,5 ml adicionais.
- Efectuar diluições em série por transferência de 100 ul de TRIP8b (241-602) a partir do tubo original para o tubo seguinte da série, pipetando para cima e para baixo, e repetindo o processo. Isto produzirá uma série de 12 pontos de diluições de 2 vezes de TRIP8b (241-602) variando 0,01-40 uM.
- Prepara-se uma mistura de 650 ul mestre de 0,1 uM HCN1 FITC (6,5 ul de uma alíquota de 10 ^ M) e ditiotreitol 2 mM (DTT) em PBS.
Nota: A mistura principal é 2x. - Criou 12 novos tubos de 1,5 ml. Adicionam-se 50 ul da mistura principal contendo HCN1 FITC a cada tubo, e em seguida, adicionar 50 ul de cada uma das diluições em série 12.
Nota: Isto irá gerar 12 tubos, contendo cada um 0,05 uM HCN1 FITC e a metade da concentração de TRIP8b (241-602) a partir de uma diluição de série original. - Adicionar a série de diluição para uma placa de ensaio, 30 uL por poço, em triplicado. Use um sólido preto placa de 384 poços de ligação baixa.
- Girar a placa de fou 2 min a 900 xg à temperatura ambiente.
- Ler a placa utilizando um leitor de microplacas, seguindo as instruções do fabricante. Medir polarização de fluorescência usando os seguintes parâmetros de medição: 485 nm de excitação, 530 nm de emissão, 505 nm espelho dicróico, 100 ms de tempo de integração.
- Traçar os valores de polarização (MP) em relação ao (241-602) a concentração em uma escala logarítmica TRIP8b. Ajustar os dados com a equação de Hill para determinar a afinidade (K d) de TRIP8b (241-602) para o péptido marcado HCN1.
Nota: Para preparar as diluições em série, uma placa de multi-poços também pode ser usado em vez de tubos.
3. Analisar a interação proteína-proteína Usando um Controle Positivo
- Adicionar 200 ul de péptido não marcado HCN1 (200 uM) para um tubo de 1,5 ml. Adicionar 100 ul de PBS para 11 tubos de 1,5 ml adicionais. Efectuar diluições em série por transferência de 100 ul a partir do tubo contendo 200 jil de péptido para o primeiro tubode 100 ul de PBS. Repetir o processo de geração de 12 tubos com 2 diluições de péptido não marcado HCN1.
- Prepara-se uma mistura de 650 ul mestre de 0,2 uM HCN1 FITC e 4 uM TRIP8b (241-602).
Nota: Esta é uma solução 2x. - Adicionar 50 ul de mistura principal a 12 novos tubos de 1,5 ml.
- Adicionar 50 ul de cada diluição em série para um tubo de 1,5 ml.
- Carregar a 384 poços de placas de microtitulação preto em triplicado, adicionar 30 ul por poço.
- Centrifugar a placa durante 2 minutos a 900 xg à temperatura ambiente.
- Leia a placa utilizando um leitor de microplacas capaz de FP. Use as mesmas configurações conforme descrito na etapa 2.7.
- Calcula-se a afinidade do péptido não marcado para TRIP8b (241-602), utilizando a equação de Cheng-Prusoff: K d 1 = IC50 / (1 + [L] / K d 2), em que K representa um d a afinidade do não marcado péptido para TRIP8b (241-602), IC50 é determinado no passo precedentee representa a capacidade do ligando não marcado para deslocar o ligando marcado, [L] é a concentração do ligando marcado no passo 3.2, e K 2 d é a afinidade de tripb (241-602) para o ligando marcado.
4. Avaliar Ensaio de Desempenho (Calcular Z Factor)
- Prepara-se uma mistura principal por preparação de uma solução de tampão de FP 12 ml com 2 uM TRIP8b (241-602), 50 nM HCN1 FITC, e DTT a 1 mM em tampão de FP.
Nota: Isso vai exigir 60 ul de 40 mM TRIP8b (241-602), 60 ul de 10 mM HCN1 FITC e 1.080 mL de tampão de FP. - Adicionar 30 ul da mistura principal para cada poço de uma placa de microtitulação de 384 poços preta.
- Adicionar 1 ml de péptido não marcado HCN1 de 1 mM a 192 poços para servir como um controlo positivo.
- Adicionar 1 mL de tampão de FP a 192 poços para servir como um controlo negativo.
- Centrifugar a placa durante 2 minutos a 900 xg à temperatura ambiente.
- Leia a placa usando a mileitor croplate.
- Calcula-se a factor de Z para o ensaio através da seguinte fórmula: Z = 1 - 3 * (σ -σ pos neg) / (μ -μ neg pos) onde σ POS e NEG σ são os desvios padrão dos poços de controlo positivo e negativo , e pos neg μ μ e representam os sinais médios nos poços de controlo positivo e negativo.
Tela 5. High Throughput
- Descongelar alíquotas de TRIP8b (241-602) e HCN1 FITC e mantê-los no gelo.
- Preparar 10 ml de TRIP8b (2 uM) e HCN1 com FITC (50 nM) em tampão de FP.
- Pipetar 25 ul da mistura em cada cavidade de uma ligação de 384 poços de placas de microtitulação pretas usando uma pipeta de baixo.
- Para rastreio da biblioteca, adicionar compostos em cada poço das colunas 3 a 22 (40 uM de concentração final para cada) utilizando um manipulador de líquidos acústico.
Nota: Devido à relativelbaixa taxa de batida y observada com este ensaio, dois compostos diferentes foram reunidas em um único poço. Os dois compostos a partir de cada poço activa foram subsequentemente testados individualmente para identificar qual conferida a actividade. - Adiciona-se 100 nl de dimetil sulfóxido (DMSO) em todos os poços das colunas 1 e 23 de cada placa como controlos negativos.
- Adicionar peptídeo HCN1 não marcado em cada poço de colunas 2 e 24 de cada placa como controlos positivos.
- Incubar as placas a temperatura ambiente durante 2 h. Ler as placas ou incubar a 4 ° C durante 16 h antes da leitura.
- Medir polarização de fluorescência em um leitor de placas. Use as mesmas configurações conforme descrito na etapa 2.7.
- Calcular a percentagem de inibição por normalizar os sinais usando os controlos positivos e negativos médias a partir de cada placa como 100%. Utilizar a equação XN = 100% * ((X NEG - X) / (X NEG - X pos)) em que X N é a percentagem de inibição normalizada corresponde ao sinal de X, X pos NEG é o sinal dos poços de controlo negativo.
6. Confirmação de visitas Usando TAMRA-marcado HCN Peptide
- Validar bate com a inibição mais de 50% usando peptídeo HCN1 TAMRA marcado (HCN1 TAMRA).
- Preparar um master mix de 12 ml de 2 mM TRIP8b (241-602) e 50 nM HCN1 TAMRA na FP buffer.
- Pipetar 25 ul da mistura principal em cada poço de uma placa de microtitulação de 384 poços preta.
- Transferir diluições em série de cada compostos activos para os respectivos poços. Adicione duas diluições de tal modo que a concentração de cada batida varia de 0,2 uM a 200 uM.
- Para as reacções de controlo negativo, transferir 100 nl de DMSO em cada cavidade. Para o controlo positivo adicionar 100 nl de péptido não marcado HCN1 diluída em série com concentração final variando de 200 uM a 0,1 uM.
- Incubar a placa a RTdurante 2 h. Ler as placas ou incubar durante 16 horas a 4 ° C antes da leitura.
- Medir a polarização de fluorescência (MP), utilizando os seguintes parâmetros de medição: excitação 535 nm; 580 nm de emissão; 535 espelho dicróico nm, tempo de integração 20 mseg.
- Calcular valores de IC50 ajustando os dados de FP dependente da concentração de cada composto utilizando um modelo de regressão não linear de quatro parâmetros 23.
7. Validação de dose-resposta de ensaio de proximidade baseado no grânulo
- Descongelar uma alíquota de TRIP8b marcada com His (241-602) (His-TRIP8b) e proteínas de fusão HCN1 GST-marcado (GST HCN1 C40) e mantê-los no gelo.
- Combinar His-TRIP8b com GST-HCN1 C40 em tampão de ensaio em concentrações de 400 nM de His-TRIP8b e 40 nM de GST HCN1 C40. Preparar 300 ul da mistura para cada composto a ser testado.
Nota: Os compostos são executados em triplicado a 11 concentrações diferentes, além de um DMSO controle (sem composto). - Para poços de controlo, prepare-se 30 ul de His-TRIP8b (200 nM), sem GST-HCN1C40 e, em seguida, preparar separadamente 30 ul de GST-HCN1C40 (20 nM), sem His-TRIP8b em tampão de ensaio.
- Para cada composto a ser testado, adicionar 7 ul da His-TRIP8b: mistura de GST-HCN1 C40 (preparado no passo 7.2 acima) a 36 cavidades de uma placa utilizando uma pipeta de 16 canais. Para testar um único composto, organizar as 12 concentrações diferentes em linhas AL e os três repetições nas colunas 1-3. Adicionar 7 uL da solução de His-TRIP8b (preparado em 7.3) para colunas 1-3 da linha M e 7 mL de solução de GST-HCN1 C40 (preparado em 7.3) para colunas 1-3 da linha N. Resumidamente centrifugar a placa de assegurar os líquidos estão no fundo de cada poço e para remover quaisquer bolhas.
- Dispensar os compostos de vida a ser testado para a placa de tal modo que a concentração de cada batida varia de 200 uM (linha A) em até 0,1 uM (linha em K). Dispensar um volume deDMSO em linhas LN que corresponde à quantidade de composto distribuído em linhas AK.
- Agitar a placa durante 2 min e incubar durante 2,5 h à TA.
- Dilui-se as pérolas aceitadoras de anti-GST 1:50 com tampão de ensaio.
- Adicionar 3,5 uL das esferas aceitadoras diluído a cada poço da placa com uma pipeta de 16 canais e misturar cuidado pipetando para evitar a criação de bolhas.
- Incubar a placa durante 1 hora à TA no escuro.
- Dilui-se a grânulos de quelato de níquel doadores 1:50 com tampão de ensaio. Não exponha a mistura à luz.
- Adicionar 3,5 uL das esferas doadoras diluído a cada poço da placa com uma pipeta de 16 canais e misturar cuidado pipetando para evitar a criação de bolhas.
- Incubar a placa durante 1,5 horas à temperatura ambiente no escuro.
- Lida num leitor de placas. Usar um leitor de placas com os seguintes parâmetros de medição: 40 mseg excitação tempo, tempo de emissão de 100 mseg, 0,1 mm Altura da detecção.
- Calcular valores de IC50 por ajuste dos dados para each composto utilizando um modelo de regressão não linear de quatro parâmetros 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para evitar problemas com direitos de autor nossa publicação anterior, uma sonda marcada com TAMRA HCN1 TAMRA foi usada para gerar Figuras 2 e 3. Note-se que esta substituição não fez uma diferença significativa nos resultados, e os protocolos são idênticos aos descritos acima, com HCN1 FITC. Para avaliar a interacção com HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) foi titulada numa concentração fixa de HCN1 TAMRA utilizando o protocolo delineado no passo 2 (Figura 2). Em seguida, o experimento descrito na etapa 3 foi realizada e o péptido não marcado foi titulado HCN1 em uma concentração fixa de TRIP8b (241-602) e HCN1 TAMRA (Figura 3).
Para verificar que o ensaio foi adequado para rastreio de alta produtividade, a sua performance foi em seguida analisada pelo protocolo no passo 4; e um factor de Z 0.89 foi obtido, indicando que o ensaio estava pronto para rastreio de alta (Figura 4). Em seguida, um composto de 20.000 biblioteca de molécula pequena foi rastreada pelo processo descrito na etapa 5. Todos os compostos que têm a inibição percentual superior a 50% foram então testados no ensaio de FP segunda HCN1 com TAMRA (passo 6). Finalmente, os sucessos confirmados foram testados no ensaio baseado em grânulo proximidade (passo 7, Figura 5). Um composto de sucesso, NUCC-5953, foi identificada como um resultado destas experiências.
Figura 1: HTS fluxo de trabalho esquemático descrevendo o fluxo de trabalho para triagem de alto rendimento.. Rendimentos diagrama de cima para baixo, com cada triângulo que representa um passo no protocolo. Por favor clique aqui para ver umaversão maior desta figura.
Figura 2:. K d de Interacção proteína-proteína (A) Representação esquemática mostrando a experiência descrita no passo 2. Como TRIP8b (241-602) é titulada para uma concentração fixa de HCN1 TAMRA, os domínios de TPR TRIP8b (em cinzento) se ligam ao peptídeo ácido 11 amino (de preto, com 'SNL' terminal de destaque). (B) À medida que a concentração de TRIP8b (241-602) aumenta, mais moléculas HCN1 TAMRA estar vinculado e polarização aumenta (K D = 0.320.01μM). As barras de erro indicam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. IC50 de Controlo Positivo (A) demonstra paradigma experimental esquemático para o passo 3. Como HCN1 péptido não marcado é titulada para uma concentração fixa de TRIP8b (241-602) e TAMRA HCN1, o péptido marcado é deslocado. (B) De notar que o sinal diminui à medida que aumenta a concentração de HCN1 não marcados, indicando deslocamento de HCN1 TAMRA (IC 50 = 1.070.08μM). As barras de erro indicam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Os resultados representativos de HTS (a) Resultados do sc de alto rendimento reen realizada utilizando o protocolo delineado no passo 5. Cada ponto no gráfico representa um único composto. As coordenadas X e Y são determinados pela percentagem de inibição em cada execução. (B) os resultados a partir da tela plotados com controlos positivos e negativos (ver legenda). inibição percentual médio de cada composto (através de duas execuções do ensaio) é representada no eixo Y. (C) Resultados de experiências de confirmação FP utilizando um péptido marcado com TAMRA HCN1. Os compostos que mostram inibição maior do que 50% no passo 5 foram, em seguida, utilizado no passo 6. Como em (a), as coordenadas X e Y são determinados pela percentagem de inibição em duas corridas do ensaio. Reproduzido de Han et al. 3. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
40 / 54540fig5.jpg "/>
Figura 5:. Baseado no grânulo Ensaio de Proximidade (A) Representação esquemática que mostra o ensaio de proximidade baseado em grânulo. TRIP8b (241-602) contém um N tag terminal de hexa-histidina que se liga contas de doadores de quelato de níquel (círculo com listras). HCN1 C40 contém um marcador GST do terminal N que se liga esferas aceitadoras. Quando colocado em proximidade pela interacção dos domínios de TPR TRIP8b e do tripéptido C-terminal de HCN1, excitação do cordão de dador por 680 nm de luz de comprimento de onda produz oxigénio singuleto. Este transfere energia de oxigénio singuleto para aceitador de esferas dentro de um raio definido e leva à emissão de luz. (B) A titulação de concentrações crescentes do composto Hit (NUCC-5953) para uma concentração fixa de TRIP8b (241-602) e HCN1 C40. Reproduzido de Han et al. 3. As barras de erro indicam o desvio padrão.target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Devido ao seu potencial como um alvo terapêutico no TDM 24, tem havido um interesse considerável em abordagens farmacológicas que antagonizam a função do canal de HCN no sistema nervoso central 4. No entanto, estes esforços têm sido parado por o importante papel dos canais HCN em pacemaking cardíaca eo risco de arritmia 25. Nós fundamentado que interromper a interação entre HCN e seu sub-unidade auxiliar específica do cérebro, TRIP8b 8, pode ser suficiente para produzir efeitos do tipo antidepressivo sem afetar canais HCN cardíacas 3. Esta hipótese foi reforçada pela observação de que os ratos que faltam TRIP8b exibem antidepressivo comportamento 7. Segmentação essa interação poderia tornar-se um novo paradigma para o tratamento de MDD.
Um protocolo detalhado para a identificação de inibidores de pequenas moléculas da interacção entre os domínios de TPR TRIP8b e do tripéptido C-terminal de HCN1 éapresentado acima. Para facilitar a sua aplicação geral, nós aqui descrever o nosso raciocínio que levou ao desenvolvimento deste ensaio. Embora TRIP8b liga-se a subunidades HCN em dois locais, estamos focados na interação entre os domínios TPR de TRIP8b e a cauda do terminal C do HCN. A elucidação estrutural desta interacção por cristalografia de raios-X revelou um bolso profunda formada pelos domínios de TPR TRIP8b redor do terminal C de HCN 15. A segunda interacção TRIP8b-HCN ocorre entre um trecho de 80 aminoácidos de TRIP8b (localizado do terminal N para os domínios TPR) e o domínio de ligação de nucleótido cíclico de HCN. Essa interação ocorre através de muitos aminoácidos diferentes de cada proteína e constitui uma superfície difusa com menos interações intermoleculares bem definidos 26. Com base nestas observações estruturais, nós concluímos que a interacção entre os domínios de TPR TRIP8b e o terminal C de HCN é mais susceptível à ruptura por uma pequena molécula inhiBITOR.
Inicialmente, um fragmento maior de TRIP8b foi usada no ensaio com base na suposição de que uma construção já pode ter sítios reguladores alostéricos e aumentar as chances de sucesso. comprimento completo TRIP8b foi inicialmente utilizada, mas esta abordagem foi limitada pela agregação de proteínas, degradação, e sensibilidade a ciclos de congelação-descongelação. Posteriormente, dois intermediária tamanho TRIP8b constrói, uma mais longa (resíduos 219-602) e um menor (resíduos 259-602), foram testados antes de uma construção intermediária (resíduos 241-602) foi selecionado. Embora cada um dos quatro truncagens acima descritos contêm os domínios TPR relevantes para a ligação ao terminal C de HCN, apenas o clone de comprimento intermédio (241-602) era suficientemente estável para utilização em ensaios de rastreio. Em particular, nós fomos capazes de obter grandes quantidades de proteína, após purificação por cromatografia de afinidade de Ni 2+ sem passos de separação adicionais.
após choosção de um fragmento adequado de TRIP8b e HCN, que próxima determinada a afinidade do péptido marcado para HCN1 TRIP8b (241-602). Como regra geral, uma medição precisa só pode ser feita se a concentração do ligando é substancialmente abaixo do K D de 28 o parceiro de ligação. No nosso caso, usamos 50 nM de péptido HCN1 marcado para o experimento no passo 2, e obteve uma K D de 0.320.01μM. Para considerações mais experimentais do projeto a respeito das interações proteína-proteína, os leitores são encaminhados para um dos vários excelentes comentários sobre o assunto 27-30.
Uma vez determinou-se o K D do péptido marcado para HCN1 TRIP8b (241-602), que, em seguida, determinado se a própria etiqueta interfere com a ligação. No passo 3, obteve-se um valor de IC 50 de 1.070.08 ^ M por titulação de um péptido não marcado para HCN1 uma concentração fixa de TRIP8b (241-602) para deslocar o péptido marcado. Combinado com a K D do péptido marcado para TRIP8b (241-602), e aplicando a equação de Cheng-Prusoff, que, em seguida, estimado a afinidade do péptido não marcado para TRIP8b (241-602) como K D = 0.93μM. Isto está em estreita concordância com a afinidade de TRIP8b (241-602) para o péptido marcado, e sugere que a marcação do péptido de não afectar substancialmente a sua afinidade para TRIP8b. Uma característica importante da tela à base de polarização de fluorescência é a sua excelente relação sinal-ruído, tal como indicado por um factor de 0,89 Z. Com os outros parâmetros iguais, a magnitude da mudança no sinal de FP é ditado pelo tamanho do parceiro de ligação (TRIP8b (241-602)) e o tamanho do ligando marcado com fluoróforo. Uma mudança na polarização de (44-224 mP) observados com o ligando peptídico ácido 11 aminoácidos entre os seus estados livre e ligada com a ~ 42 kDa TRIP8b (241-602) da proteína é suficiente para reproduzir a interacção alvo e fornece uma gama dinâmica suficiente para o rastreio da biblioteca.
ntent "> Um dos desafios de qualquer ensaio de rastreio de alto rendimento é distinguir verdadeira 'hit' compostos de mudanças de artefatos na intensidade do sinal. Nas telas à base de polarização de fluorescência, é comum para muitos compostos para interagir diretamente com o fluoróforo ou fluorescência em sua própria. para contornar estes problemas, um processo de rastreio de duas fases utilizando dois fluoróforos diferentes está acima descritos. Este procedimento reduz a probabilidade de que os compostos fluorescentes e os compostos de interagir directamente com o fluororo irá avançar através do processo de triagem. Além de ligação do fluoróforo , alguns compostos actuam como agregadores '' in vitro e levar a alterações não específicas no sinal de polarização de fluorescência. estes compostos são pensados para formar detergentes sensíveis-estruturas micelares e inibir as interacções proteína-proteína de 31,32. para minimizar estes efeitos, é importante que o tampão de polarização de fluorescência utilizadas nos altosthroughput screening protocolo descrito acima inclui um detergente (Triton), embora uma validação adicional com outros detergentes devem ser considerados.Deve notar-se que existem várias limitações importantes do procedimento de rastreio descrito acima. Embora TRIP8b se liga a HCN em dois locais, a tela acima descrito examina apenas um local de interação e não identificar pequenas moléculas que visam a interação CNBD. De modo semelhante, os compostos que modulam a ligação alostericamente TRIP8b de HCN através da interacção com TRIP8b na região do terminal N não será identificado como sucessos. Ambas estas considerações são o resultado da utilização de um fragmento TRIP8b menor (ver acima), o que garante a reprodutibilidade nos ensaios de rastreio descritos no procedimento. De modo a evitar estas limitações, os esforços futuros pode ser dirigido para usando uma tela baseada em célula incorporando HCN comprimento completo e TRIP8b constrói 33,34. Este tipo de tela pode contar com alta throughput métodos electrofisiológicos a fim de identificar compostos capazes de interromper a interacção entre o HCN e TRIP8b, e limitando a expressão dos canais HCN na superfície da célula. De nota, abordagens como estas teriam de incluir contra-telas para garantir que as pequenas moléculas não foram limitantes directamente função do canal HCN como antagonistas, pois isso pode levar a efeitos alvo off in vivo.
Embora HCN1, HCN2 e HCN4 todos têm um peptídeo C-terminal conservado 'SNL', os resíduos terminais N a esta tripeptide variar substancialmente e, provavelmente, afectar a afinidade de ligação TRIP8b. Isto levanta a possibilidade de que uma molécula pequena batida obtido por tela ou concebidas com base em outros compostos de sucesso pode proporcionar especificidade isoforma HCN em interromper a interacção TRIP8b-HCN. Na tela original, NUCC-5953 foi identificada como a primeira molécula pequena capaz de impedir a interacção entre TRIP8b e HCN1 3. wor futurok com este ensaio pode identificar inibidores de moléculas pequenas adicionais com propriedades químicas desejáveis para o desenvolvimento de drogas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Dialysis cassette | ThermoFisher | 66456 | |
| Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 - 1 gr | |
| 384-Well Black plate | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
| Anti-GST Acceptor beads | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| Protein concentrator | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | Agilent | 200131 |
References
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
- Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (244), pe44 (2012).
- Han, Y., et al. Identification of Small-Molecule Inhibitors of Hyperpolarization-Activated Cyclic Nucleotide-Gated Channels. J Biomol Screen. 20 (9), 1124-1131 (2015).
- Postea, O., Biel, M. Exploring HCN channels as novel drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (12), (2011).
- Stieber, J., Wieland, K., Stöckl, G., Ludwig, A., Hofmann, F. Bradycardic and proarrhythmic properties of sinus node inhibitors. Mol Pharmacol. 69 (4), 1328-1337 (2006).
- Santoro, B., Wainger, B. J., Siegelbaum, S. A. Regulation of HCN channel surface expression by a novel C-terminal protein-protein interaction. J Neurosci. 24 (47), 10750-10762 (2004).
- Lewis, A. S., et al. Deletion of the hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel auxiliary subunit TRIP8b impairs hippocampal Ih localization and function and promotes antidepressant behavior in mice. J Neurosci. 31 (20), 7424-7440 (2011).
- Heuermann, R. J., et al. Reduction of thalamic and cortical Ih by deletion of TRIP8b produces a mouse model of human absence epilepsy. Neurobiol Dis. 85, 81-92 (2016).
- Steru, L., Chermat, R., Thierry, B., Simon, P. The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice. Psychopharmacology. 85 (3), 367-370 (1985).
- Petit-Demouliere, B., Chenu, F., Bourin, M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology. 177 (3), 245-255 (2004).
- Cryan, J. F., Mombereau, C., Vassout, A. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neurosci Biobehav Rev. 29 (4-5), 571-625 (2005).
- Han, Y., et al. Trafficking and gating of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels are regulated by interaction with tetratricopeptide repeat-containing Rab8b-interacting protein (TRIP8b) and cyclic AMP at distinct sites. J Biol Chem. 286 (23), 20823-20834 (2011).
- Hu, L., Santoro, B., Saponaro, A., Liu, H., Moroni, A., Siegelbaum, S. Binding of the auxiliary subunit TRIP8b to HCN channels shifts the mode of action of cAMP. J Gen Physiol. 142 (6), 599-612 (2013).
- Saponaro, A., et al. Structural basis for the mutual antagonism of cAMP and TRIP8b in regulating HCN channel function. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (40), 14577-14582 (2014).
- Bankston, J. R., Camp, S. S., DiMaio, F., Lewis, A. S., Chetkovich, D. M., Zagotta, W. N. Structure and stoichiometry of an accessory subunit TRIP8b interaction with hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), 7899-7904 (2012).
- Gatto, G. J. Jr, Geisbrecht, B. V., Gould, S. J., Berg, J. M. Peroxisomal targeting signal-1 recognition by the TPR domains of human PEX5. Nat Struct Biol. 7 (12), 1091-1095 (2000).
- Owicki, J. C. Fluorescence polarization and anisotropy in high throughput screening: perspectives and primer. J Biomol Screen. 5 (5), 297-306 (2000).
- Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
- Roehrl, M. H. A., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43 (51), 16056-16066 (2004).
- Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3 (4), 301-317 (2004).
- Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Eglen, R. M., et al. The use of AlphaScreen technology in HTS: current status. Curr Cheml Genomics. 1 (1), 2-10 (2008).
- Lehninger, A. L., Nelson, D. L., Cox, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. , Worth Publishers. New York. (2000).
- Kim, C. S., Chang, P. Y., Johnston, D. Enhancement of dorsal hippocampal activity by knockdown of HCN1 channels leads to anxiolytic- and antidepressant-like behaviors. Neuron. 75 (3), 503-516 (2012).
- Wahl-Schott, C., Biel, M. HCN channels: structure, cellular regulation and physiological function. Cell Mol Life Sci. 66 (3), 470-494 (2009).
- DeBerg, H. A., Bankston, J. R., Rosenbaum, J. C., Brzovic, P. S., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structural Mechanism for the Regulation of HCN Ion Channels by the Accessory Protein TRIP8b. Structure. 23 (4), 734-744 (2015).
- Weiss, J. N. The Hill equation revisited: uses and misuses. FASEB J. 11 (11), 835-841 (1997).
- Prinz, H. Hill coefficients, dose-response curves and allosteric mechanisms. J Chem Biol. 3 (1), 37-44 (2009).
- Pollard, T. D. A Guide to Simple and Informative Binding Assays. Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).
- Rossi, A. M., Taylor, C. W. Analysis of protein-ligand interactions by fluorescence polarization. Nat Protoc. 6 (3), (2011).
- Ryan, A. J., Gray, N. M., Lowe, P. N., Chung, C. -W. Effect of Detergent on "Promiscuous" Inhibitors. J Med Chem. 46 (16), 3448-3451 (2003).
- McGovern, S. L., Caselli, E., Grigorieff, N., Shoichet, B. K. A common mechanism underlying promiscuous inhibitors from virtual and high-throughput screening. J Med Chem. 45 (8), 1712-1722 (2002).
- Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution-and cell-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 11 (1), (2000).
