Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الاستفادة من مجمع بين الافراج عن الإثيلين، حمض 2-Chloroethylphosphonic، كأداة لدراسة استجابة الإثيلين في البكتيريا

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54682
Automatic Translation
1, 1, 1
1Molecular Microbial Biochemistry Laboratory, Faculty of Science (Applied Bioscience Program), University of Ontario Institute of Technology

Introduction

الاثيلين الأوليفين (C 2 H 4) اكتشفت لأول مرة كما هرمون مصنع في عام 1901 عندما لوحظ أن الشتلات البازلاء، ونمت في المختبر التي تستخدم مصابيح الغاز والفحم، وعرضت على التشكل الشاذ الذي ينبع كانت (hypocotyls) أقصر، وأكثر سمكا وعازمة جانبية مقارنة الشتلات البازلاء العادية. وصف النمط الظاهري في وقت لاحق 1،2 استجابة الثلاثي. أثبتت الدراسات اللاحقة أن الاثيلين هو هرمون نباتي الحيوي الذي ينظم العمليات التنموية العديدة مثل النمو والاستجابة للضغط النفسي، نضج الثمار والشيخوخة 3. thaliana نبات الأرابيدوبسيس، كائن نموذج للأبحاث بيولوجيا النبات، قد درست جيدا في ما يخص ردها على الإيثيلين. وقد تم عزل المسوخ استجابة العديد من الاثيلين من خلال استغلال النمط الظاهري استجابة الثلاثي لوحظ في الظلام نمت أ. الشتلات thaliana في وجود من الاثيلين 1،4،5. مقدمة السكروز لإنتاج الإثيلين في النباتات هو 1-لحمض minocyclopropane الكربوكسيلية (ACC) 6، ويستخدم عادة خلال فحص استجابة الثلاثي لزيادة انتاج الاثيلين الذاتية التي تؤدي إلى الثلاثي 1،4،5 استجابة النمط الظاهري.

على الرغم من أن استجابة الاثيلين تدرس على نطاق واسع في النباتات، ودراسة سلوكه تأثير الاثيلين دخيلة على البكتيريا إلى حد كبير على الرغم من ارتباط وثيق من البكتيريا مع النباتات. ذكرت إحدى الدراسات أن بعض سلالات الزائفة يمكن البقاء على قيد الحياة باستخدام الاثيلين كمصدر وحيد للكربون والطاقة 7. ومع ذلك، فقد أظهرت اثنين فقط من الدراسات أن البكتيريا تستجيب للالاثيلين. وأظهرت الدراسة الأولى أن سلالات الزائفة الزنجارية، P. المتألقة، P. الكريهة، وP. كانت syringae الكيميائي نحو الاثيلين باستخدام فحص المكونات الاغاروز التي الاغاروز المنصهر كانت مختلطة مع العازلة الكيميائي معايرتها مع غاز الاثيلين النقي 8. ومع ذلك، على حد علمنا، لم تكن هناك أي فورثتقارير إيه باستخدام غاز الاثيلين النقي لتوصيف استجابة الاثيلين البكتيرية، ويرجح ذلك بسبب صعوبة التعامل مع الغازات في المختبر بدون المعدات المتخصصة. أظهر التقرير الثاني للاستجابة الاثيلين البكتيرية التي الاثيلين زاد إنتاج السليلوز البكتيريا والتعبير الجيني أثرت في البكتيريا المصاحبة الفاكهة، Komagataeibacter (سابقا Gluconacetobacter) xylinus 9. في هذه الحالة، ومجمع الإفراج الإثيلين، واستخدم حمض 2-chloroethylphosphonic (CEPA) لإنتاج الإثيلين في الموقع في المتوسط نمو البكتيريا، تجاوز الحاجة للغاز الاثيلين النقي أو المعدات المتخصصة.

CEPA تنتج الاثيلين في نسبة 1: 1 الرحى فوق درجة الحموضة 3.5 10،11 من خلال المحفز الأساس، من الدرجة الأولى رد فعل 12-14. ويرتبط تدهور CEPA بإيجابية مع الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة 13،14 والنتائج في إنتاج إيثيلإيني، كلوريد والفوسفات. يوفر CEPA الباحثين المهتمين بدراسة ردود البكتيرية إلى الإثيلين مع بديل مناسب لالاثيلين الغازي.

ويتمثل الهدف العام من البروتوكولات التالية هو توفير وسيلة بسيطة وفعالة لدراسة استجابة الاثيلين البكتيرية ويتضمن المصادقة على المستويات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لانتاج الاثيلين من CEPA التحلل في المتوسط ​​نمو البكتيريا، وتحليل درجة الحموضة الثقافة لضمان CEPA لم تضعف التحلل خلال نمو البكتيريا، وتقييم تأثير الاثيلين على مورفولوجيا البكتيرية والنمط الظاهري. علينا أن نظهر هذه البروتوكولات تستخدم ك. xylinus، ومع ذلك، يمكن تكييف هذه البروتوكولات لدراسة استجابة الاثيلين في غيرها من البكتيريا باستخدام متوسط النمو المناسب وتحليل النمط الظاهري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المواد الكيميائية

  1. إعداد محلول من 500 ملي CEPA (144.49 جم / مول)، والتوصل إلى حل تتألف من 500 ملي كلوريد الصوديوم (58.44 جم / مول) و 500 ملي ناه 2 ص 4 · H 2 O (137.99 جم / مول) في المحمضة (الرقم الهيدروجيني 2.5) ماء نقي للغاية أو 0.1 N حمض الهيدروكلوريك. مزيج باستخدام الدوامة حتى حلول واضحة.
  2. تمييع متسلسل (10X) الحلول ملي 500 في نفس مذيب للحصول على 5 ملي و 50 ملي الأسهم.
  3. إعداد محلول 10 ملم من 1 aminocyclopropane حمض الكربوكسيلية (ACC، 101.1 غرام / مول) في مياه نقي للغاية.
  4. تصفية تعقيم حلول الأسهم وقسامات مخزن في -20 درجة مئوية.
  5. تصفية تعقيم السيلولوز. مخزن aliquots في 4 درجات مئوية.

2. التحقق من إنتاج الإثيلين من 2 Chloroethylphosphonic حمض التحلل: الثلاثي الفحص الاستجابة

  1. سطح تعقيم نبات الأرابيدوبسيس thaliana بذور نوع إيكولوجي كولومبيا باستخدام بخار المرحلة الطريقة:
    تنبيه: الخطوة التالية تنتج رغاز الكلور ناقصة الأكسدة. إجراء تعقيم البذور في غطاء الدخان.
    1. الحصول على وعاء قابل للغلق عميقة بما فيه الكفاية لاستيعاب كوب زجاجي 250 مل لتعقيم البذور ووضعه في غطاء الدخان.
    2. إضافة A. thaliana البذور لأنبوب microcentrifuge ووضع أنبوب في رفوف. وضع رف يحتوي على أنبوب مفتوح في وعاء قابل للغلق.
      ملاحظة: لا تملأ أنابيب الفردية أكثر من نصف كامل للسماح للغاز الكلور لاختراق البذور أقل.
    3. وضع كوب 250 مل تحتوي على 100 مل من التبييض التجاري في الحاويات اغلاقها باحكام. بعناية إضافة 3 مل من حمض الهيدروكلوريك المركز إلى التبييض وختم على الفور حاوية مع غطاء لها.
      تنبيه: بليتش وحمض الهيدروكلوريك رد فعل لإنتاج غاز الكلور السام الذي يعمل على السطح تعقيم البذور.
    4. احتضان بذور في وجود غاز الكلور لمدة 4 ساعة في fumehood.
      ملاحظة: مرة التعقيم أطول وتقلل من كفاءة الإنبات.
    5. بعد التعقيم، والسماح للجالغاز hlorine للتنفيس في غطاء الدخان لا يقل عن 1 ساعة ثم ختم أنبوب microcentrifuge. ترك التبييض وحمض الهيدروكلوريك الخليط في fumehood لا يقل عن 24 ساعة قبل رميه.
      ملاحظة: قد تكون مخزنة تعقيم البذور في درجة حرارة الغرفة للاستخدام الفوري.
    6. إبقاء البذور في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. جلب البذور إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح أنبوب microcentrifuge لمنع التكثيف. تخزين البذور في الظلام.
  2. إعداد لوحات أجار في القطاع 4 أطباق بتري (90 × 15 ملم):
    1. إعداد 110 مل من متوسط النمو للأ. thaliana الشتلات ما يلي: 1X Murashige وسكوغ (MS) متوسطة القاعدية 15 (4.33 جم / لتر) يحتوي على 1٪ (ث / ت) السكروز و 0.8٪ (ث / ت) أجار. ضبط متوسطة MS لدرجة الحموضة 6 مع هيدروكسيد الصوديوم.
    2. إعداد 100 مل من متوسط النمو البكتيري للCEPA التحلل: شرام وHestrin (SH) المتوسطة 16 تحتوي على 1.5٪ (ث / ت) أجار. ضبط المتوسطة SH لدرجة الحموضة 7 مع هيدروكسيد الصوديوم.
    3. تعقيم وسائل الإعلام قبل التعقيم وتمب(ص) في 55 ° C حمام الماء.
    4. مرة واحدة وقد خفف آغار MS، إضافة إلى 40 مل قارورة معقمة. لإعداد متوسط النمو تحكم إيجابية لأ. thaliana الشتلات، تكملة قسامة 40 مل من مرض التصلب العصبي المتعدد أجار مع 40 ميكرولتر من 10 ملي ACC للحصول على تركيز النهائي من 10 ميكرومتر ACC.
    5. إضافة 5 مل من المتوسط إلى الأرباع المناسبة للأطباق بتري قطاعية (الشكل 1)، والسماح للأجار ليصلب. إعداد جميع لوحات في ثلاث نسخ.
      ملاحظة: لم يتم إضافة CEPA إلى وسط النمو حتى في وقت لاحق في البروتوكول.

شكل 1
الشكل 1: إعداد لوحات أجار يستخدم لفحص استجابة الثلاثي مع CEPA يوضح التخطيطي الأرباع محددة للسيطرة سلبية (A)، مراقبة إيجابية (ب)، واللوحات التجريبية (C). تم تعديل هذا الرقم من Augimeri والشريط 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تطبق أ. thaliana بذور لضمان الإنبات متزامن:
    1. إضافة ما يقرب من خمسين ألف بذور thaliana على كل رباعي يحتوي MS أو MS + ACC أجار. وتوزع ضمان بذور بالتساوي لتسهيل إزالة الشتلات والتحليل.
    2. احتضان لوحات تحتوي على البذور في الظلام في 4 ° مئوية لمدة 3-4 أيام.
  2. تتحلل CEPA على البكتيريا النمو المتوسطة (SH) ونفذ الثلاثي الاستجابة الفحص:
    1. بعد التقسيم الطبقي، وتعريض البذور لضوء الفلورسنت لمدة 2 ساعة.
    2. نشر 10 ميكرولتر من ملي CEPA حل سهم 500 على الأرباع لوحات تجريبية تحتوي على أجار SH (الرقم الهيدروجيني 7؛ الشكل 1) للحصول على تركيز CEPA النهائيمن 1 ملم.
    3. ختم لوحات مع فيلم المختبرات ويغطى بورق لخلق بيئة مظلمة للبذور.
    4. تنبت البذور التي يحتضنها لوحات في الظلام في 23 درجة مئوية لمدة 3 أيام مع الجانب آغار أسفل.
      ملاحظة: يمكن أن تكون مكدسة لوحات، ولكن يجب وضع ضوابط السلبية على الجزء السفلي منذ الاثيلين هو أخف من الهواء.
  3. تحليل الثلاثي الاستجابة بيانات الفحص:
    1. مع ملقط معقم لهب، وإزالة الشتلات واحدة من لوحة المقابلة لكل معاملة وعرض تحت المجهر تشريح أو USB الرقمية. ضمان الجزء السفلي من الشتلات تتماشى وصورة.
    2. إزالة 30 شتلة من كل رباعي (60 شتلة في تكرار البيولوجي و 180 شتلة لكل معاملة). محاذاة على السطح مع خلفية سوداء وصورة مع الحاكم.
    3. قياس طول التحتفلقي (ملم) من الشتلات تكرار استخدام يماغيج البرمجيات 17. تعيين نطاق عن طريق النقر والسحب * مستقيم *أداة لتحديد طول 10 ملم. تحديد "جدول تعيين" تحت علامة التبويب "تحليل" وتعيين مسافة معروفة إلى 10. باستخدام أداة * مقسمة *، انقر واسحب لتحديد طول التحتفلقي ثم اضغط M لقياس المسافة. مقارنة وسائل مكررات البيولوجية باستخدام في اتجاه واحد أنوفا مع التجارب المقارنة متعددة لتوكي و. تعتبر الاختلافات كبير إذا ف <0.05.

3. تحليل درجة الحموضة في جميع أنحاء النمو الجرثومي

  1. تنمو وتحديد Komagataeibacter كاتب xylinus الثقافات في ثلاث نسخ:
    1. تلقيح مستعمرة واحدة من ك. xylinus إلى 5 مل من المتوسط SH (الرقم الهيدروجيني 5) تستكمل مع 0.2٪ (ت / ت) السيلولوز فلتر تعقيم. احتضان الثقافات في 30 درجة مئوية مع الإثارة في 150 دورة في الدقيقة حتى لOD يتم التوصل إلى 600 من 0،3-0،4 (حوالي 72 ساعة).
    2. الثقافات الحصاد بداية بواسطة الطرد المركزي (2000 x ج، 4 درجة مئوية و 10 دقيقة). مع 5 مل العقيمة 0.85٪ (ث / ت) NACل حل، وغسل الخلايا مرتين و resuspend بيليه الخلية. تبقي الخلايا على الجليد.
    3. تحديد الخلايا باستخدام غرفة عد بيتروف-Hausser.
  2. تطعيم الثقافات لتحليل درجة الحموضة:
    1. إضافة 150 مل من مرق SH (الرقم الهيدروجيني 7) تستكمل مع 0.2٪ (ت / ت) السيلولوز فلتر تعقيم إلى 500 اثني عشر مل القوارير ذات الأغطية احباط. تطعيم قوارير مع ك. بداية الثقافات xylinus بتركيز 10 5 خلية / مل. باستخدام بداية الثقافات الثلاث، إعداد ثلاث مكررات البيولوجية لكل معاملة.
    2. الثقافات الملحق مع 300 ميكرولتر من 5، 50، أو 500 الحلول الأسهم ملم CEPA للحصول على تركيزات CEPA النهائية من 0.01، 0.1، و 1.0 ملم على التوالي. تكملة الثقافات ضابطة مع 300 ميكرولتر من المذيبات المستخدمة لإذابة CEPA.
    3. ختم القوارير عن طريق تسجيل بإحكام الأغطية احباط لقوارير واحتضان الثقافات لمدة 14 يوما حتى 30 درجة مئوية مع الإثارة في 150 دورة في الدقيقة.
  3. كل يوم، asepticaLLY إزالة 5 مل عينات من كل قارورة وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي (2000 x ج، 4 درجة مئوية و 10 دقيقة). نقل supernatants إلى أنبوب نظيفة وقياس درجة الحموضة من كل تكرار البيولوجي باستخدام مقياس درجة الحموضة.
  4. تحليل البيانات في الوقت بالطبع عن طريق الرسوم البيانية يعني الرقم الهيدروجيني للمكررات البيولوجية.
    ملاحظة: من المهم أن الرقم الهيدروجيني الثقافة لا تنخفض الى اقل من 3.5. الرقم الهيدروجيني الثقافة من 5 يقلل بشكل ملحوظ الافراج الاثيلين من CEPA، ودرجة حموضة أقل من 3.5 يمنع تماما الإفراج الاثيلين.
  5. للسيطرة على مستويات الكلور والفوسفات، إجراء تجربة مماثلة باستخدام 0.01، 0.1، و 1.0 ملم من 4 حل كلوريد الصوديوم-ناه 2 ص باستخدام 5، 50، و 500 أسهم ملم على التوالي.

4. مستعمرة الصرف

  1. تنمو ك. الثقافات xylinus كاتب في ثلاث نسخ:
    1. تلقيح مستعمرة واحدة من ك. xylinus إلى 5 مل من المتوسط SH (الرقم الهيدروجيني 5) تستكمل مع 0.2٪ (ت / ت) السيلولوز فلتر تعقيم. Incubaالثقافات الشركة المصرية للاتصالات عند 30 درجة مئوية مع الإثارة في 150 دورة في الدقيقة حتى على OD 600 من 0،3-0،4 يتم التوصل إلى (حوالي 72 ساعة).
    2. الثقافات الحصاد بداية بواسطة الطرد المركزي (2000 x ج، 4 درجة مئوية و 10 دقيقة). مع 5 مل من محلول ملحي، وغسل الخلايا ثم resuspend الكرية الخلية. تبقي الخلايا على الجليد.
  2. إعداد 24 أجار لوحات تحتوي على 25 مل من SH (الرقم الهيدروجيني 7) المتوسطة مع 1.5٪ (ث / ت) أجار.
  3. مرة واحدة وقد عززت أجار، نشر 50 ميكرولتر من 5، 50، و 500 الحلول الأسهم ملم CEPA على أجار للحصول على تركيزات CEPA النهائية من 0.01، 0.1، و 1.0 ملم على التوالي. إعداد لوحات تحكم غير المعالجة والمذيبات، والتي تتكون من أي تعديل ونشر 50 ميكرولتر من المذيبات المستخدمة لإذابة مركبات الاختبار.
  4. لوحات متتالية للمستعمرات معزولة مع حلقة كاملة (~ 5 ميكرولتر) من ك. xylinus ثقافة المبتدئين وختم لهم مع فيلم البارافين. تطعيم جميع لوحات في ثلاث نسخ. احتضان لوحات لمدة خمسة أيام في 30 درجة مئوية.
  5. الفت وحدة التدفق الضوئيالمستعمرات ograph في 20X التكبير باستخدام مجهر USB الرقمية ونوعيا تقييم الاستعماري التشكل والسليلوز الإنتاج في وسط صلب.
    يبدو السليلوز باعتباره مادة ضبابية على هامش مستعمرة: مذكرة.
  6. للسيطرة على مستويات الكلور والفوسفات، إجراء تجربة مماثلة باستخدام 0.01، 0.1، و 1.0 ملم من 4 حل كلوريد الصوديوم-ناه 2 ص باستخدام 5، 50، و 500 أسهم ملم على التوالي.

5. جليدة فحوصات

  1. تنمو وتحديد ك. الثقافات xylinus كاتب في ثلاث نسخ:
    1. في ثلاث نسخ، تلقيح مستعمرة واحدة من ك. xylinus إلى 5 مل من المتوسط SH (الرقم الهيدروجيني 5) تستكمل مع 0.2٪ (ت / ت) السيلولوز فلتر تعقيم. احتضان الثقافات في 30 درجة مئوية مع الإثارة في 150 دورة في الدقيقة حتى لOD يتم التوصل إلى 600 من 0،3-0،4 (حوالي 72 ساعة).
    2. الثقافات الحصاد بداية بواسطة الطرد المركزي (2000 x ج، 4 درجة مئوية و 10 دقيقة). مع 5 مل من محلول ملحي، وغسل رانه خلايا مرتين و resuspend بيليه الخلية. تبقي الخلايا على الجليد.
    3. تحديد الخلايا باستخدام غرفة عد بيتروف-Hausser.
  2. إعداد ماستر خلطات لتلقيح لوحات 24-جيدا:
    1. تكملة 60 مل من المتوسط ​​SH (الرقم الهيدروجيني 7) مع 120 ميكرولتر من 5، 50، و 500 أسهم ملي CEPA الحصول على تركيزات CEPA النهائية من 0.01، 0.1، و 1.0 ملم على التوالي. تكملة 60 مل أخرى متوسطة SH (الرقم الهيدروجيني 7) مع 120 ميكرولتر من المذيبات المستخدمة لإذابة CEPA. دوامة لخلط.
    2. تقسيم كل 60 مل من CEPA-تحتوي على المتوسط ​​إلى أربعة 14 مل قسامات. تطعيم ثلاثة من aliquots مل 14 مع مكررات البيولوجية للثقافة المبتدئين بتركيز 10 5 خلية / مل. إبقاء الأنابيب مع الخلايا على الجليد لمنع إنتاج السليلوز.
      ملاحظة: سيتم استخدام قسامة 14 مل المتبقية لآبار المراقبة معقمة.
  3. تطعيم لوحات 24-جيدا:
    1. اختبار كل معاملة في لوحة خاصة بها مع ثلاثة صفوف من مكررات البيولوجية وصف من الضوابط معقمة (الشكل 2).

الشكل 2
وaliquoted تدفق البياني يوضح البروتوكول المستخدم لفحص جليدة وتحليل تستكمل CEPA المخزن الرقم الهيدروجيني 7 المتوسطة SH (60 مل) لمدة ثلاث التطعيمات تكرار البيولوجي منفصلة والسيطرة العقيمة (14 مل لكل منهما): الشكل 2. ثم يتم aliquoted هذه الثقافات إلى ستة مكررات التقنية (2 مل) في 24 لوحة جيدا وبعد ذلك اغلقت مع فيلم البارافين. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 7 أيام في 30 درجة مئوية، ويتم حصاد pellicles وتتميز تحديد الوزن الرطب، سمك، الوزن الجاف، والتبلور التي كتبها FT-IR. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم

  1. باستخدام مزيج الرئيسي 14 مل، إضافة 2 مل في مجموعة شرق افريقياح ستة آبار العقيمة 24 لوحة جيدا. استكمال لمكررات البيولوجية ثلاثة والسيطرة العقيمة (الشكل 2). كرر لكل معاملة.
  2. لوحات ختم مع فيلم البارافين واحتضان ثابت لمدة 7 أيام عند 30 درجة مئوية.
  1. الحصاد وقياس جليدة ويت الوزن، سمك، الوزن الجاف (السليلوز الغلة) والتبلور (الشكل 2):
    1. خفض جانب واحد من جليدة لرفع حافة جليدة المعارضة وإزالة pellicles الفردية مع ملقط. مع الحفاظ على قبضة، ووضعها على منشفة ورقية جديدة لمدة 3 ثانية لإزالة المتوسطة الزائدة قبل وزنها لتحديد أوزانها الرطب.
    2. محاذاة pellicles المتاخمة للحاكم وصورة من الجانب باستخدام كاميرا رقمية عالية الدقة.
    3. باستخدام يماغيج البرمجيات 17، وقياس سماكة غشاء رقيق على الكتف الأيسر والكتف الأيمن ووسط كل جليدة. متوسط ​​جميع مكررات التقنية لكل replicat البيولوجيه.
    4. نقل فردي pellicles في الآبار من لوحة 6 جيدا. علاج pellicles مع 12 مل من 0.1 هيدروكسيد الصوديوم N 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لليز الخلايا.
    5. إزالة هيدروكسيد الصوديوم وتحييد pellicles عن طريق الغسيل بالماء فائقة نقية لمدة 24 ساعة مع الإثارة. تغيير الماء كل 6 ساعات.
      ملاحظة: يجب أن تكون بيضاء Pellicles عند الانتهاء من خطوة الغسيل.
    6. مكان pellicles على الحصير السيليكون وجافة عند 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة على وزن ثابت. الجاف مرة واحدة، وترفع من الحصير وقياس الأوزان جليدة على نطاق تحليلي لتحديد العائد السليلوز البكتيريا.
    7. تحليل جليدة التبلور باستخدام فورييه تحويل مطياف الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) باستخدام 32 المسح الضوئي وقرار من 4 سم -1 في حدود 4000 إلى 650 سم -1. حساب مؤشر التبلور، CI (الأشعة تحت الحمراء)، وذلك باستخدام 1437 / أ 895. نسبة الامتصاص من "الفرقة البلورية" و "الفرقة غير متبلور" كما وصفها سابقا 18.
    8. للسيطرة على مستويات الكلور والفوسفات، إجراء تجربة مماثلة باستخدام 0.01، 0.1، و 1.0 ملم من 4 حل كلوريد الصوديوم-ناه 2 ص باستخدام 5، 50، و 500 أسهم ملم على التوالي.
    9. تحليل البيانات جليدة:
      1. حساب جليدة الماء عن طريق تحديد الفرق بين جليدة الوزن الرطب والوزن الجاف.
      2. متوسط ​​قيم كل مكررات التقنية للحصول على قيمة واحدة لكل تكرار البيولوجي للتحليل الإحصائي. مقارنة العلاجات باستخدام في اتجاه واحد أنوفا مع التجارب المقارنة متعددة توكي و. فروق ذات دلالة إذا ف <0.05.
      3. تطبيع البيانات مثل في المئة من الضوابط غير المعالجة ورسم وسائل مكررات البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد الإعداد لوحة التخطيطي للتحقق من تحرير الاثيلين من CEPA في المتوسط SH (الرقم الهيدروجيني 7) من خلال فحص استجابة الثلاثي في الشكل 1A - C. ويرد-الرسم البياني يوضح بروتوكول جليدة في الشكل 2. الظلام نمت أ. thaliana الشتلات يحمل النمط الظاهري استجابة ثلاثية (التحتفلقي أقصر وأكثر سمكا مع هوك قمي مبالغ فيه) في وجود لجنة التنسيق الإدارية وبحضور الإثيلين المنتجة من خلال التحلل من CEPA على وسط SH (الرقم الهيدروجيني 7)، ولكن ليس في ظل ظروف غير المعالجة (الشكل 3A) 9. طول التحتفلقي من ACC- وCEPA المستمدة الاثيلين تعامل A. كانت بذور thaliana معنويا (P <0.0001) أقصر من الضوابط غير المعالجة (الشكل 3B) 9، مؤكدا أن الاثيلين أفرج عنه من CEPA على وسط SH (الرقم الهيدروجيني 7) في concentra ذات الصلة من الناحية الفسيولوجيةنشوئها. درجة حموضة K. غير المعالجة أو المعالجة CEPA- ظلت الثقافات xylinus فوق 5 (الشكل 4) 9؛ ولذلك لا ينقص CEPA التحلل في الاثيلين نتيجة لإنتاج الأحماض العضوية البكتيرية. زيادة الاثيلين المستمدة CEPA-إنتاج السليلوز البكتيريا عندما ك. وقد نمت xylinus على وسط SH الصلبة (الرقم الهيدروجيني 7) (الشكل 5) 9. جميع تركيزات الاثيلين المستمدة CEPA-انخفضت بشكل ملحوظ جليدة الوزن الرطب (الشكل 6A)، لم يؤثر سمك جليدة (الشكل 6B) وزيادة كبيرة جليدة الوزن الجاف (العائد السليلوز، الشكل 6C) 9. وأظهرت صورة الممثلة المأخوذة لقياس سمك جليدة في الشكل 7. تم تخفيض جليدة ترطيب جميع تركيزات الاثيلين المستمدة CEPA (الشكل 8A) 9، في حين أن جميع تركيزات CEPA المستمدة الاثيلين 9 زاد اااالتبلور licle (الشكل 8B). وكانت آثار كلوريد الصوديوم وناه 2 ص 4 تافهة في جميع الحالات (لا تظهر البيانات) مؤكدا أن الظواهر الملحوظة نجمت عن الاثيلين المستمدة CEPA.

الشكل (3)
الشكل (3): CEPA تتحلل في المتوسط SH (الرقم الهيدروجيني 7) لإنتاج الإثيلين تظهر الصور المجهر USB الرقمية التي داكنة نمت أ. thaliana الشتلات عرض النمط الظاهري استجابة الثلاثي (التحتفلقي أقصر، التحتفلقي سمكا وبالغت هوك قمي) عندما نمت في ظل وجود لجنة التنسيق الإدارية والاثيلين المستمدة CEPA-مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المعالجة (A). وكان طول التحتفلقي الشتلات المزروعة في وجود لجنة التنسيق الإدارية والاثيلين المستمدة CEPA-significantlذ أقصر من سيطرة غير المعالجة (B). شريط مقياس = 1 مم. تظهر أشرطة الخطأ SD (ن = 3). الحانات بأحرف مختلفة تختلف اختلافا كبيرا (P <0.0001). تم تعديل هذا الرقم من Augimeri والشريط 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: الرقم الهيدروجيني من ك. xylinus الثقافات لا تزال مرتفعة بما يكفي لتحلل CEPA في المتوسط SH (الرقم الهيدروجيني 7). يبقى الرقم الهيدروجيني ثقافة فوق 5، والسماح للتحلل كفاءة CEPA إلى الإثيلين في جميع مراحل النمو البكتيرية. الرقم الهيدروجيني من ك. يجب مراقبة الثقافات xylinus لأنها تفرز وممتص الأحماض العضوية. تظهر أسطورة تركيزات CEPA اختبارها. لاحظ أن المحور ص يبدأفي الرقم الهيدروجيني تظهر 5. أشرطة الخطأ SD (ن = 3). تم تعديل هذا الرقم من Augimeri والشريط 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الاثيلين المستمدة CEPA-يزيد إنتاج السليلوز التي كتبها ك. xylinus في وسط صلب. ك. وقد نمت xylinus على لوحات SH أجار (الرقم الهيدروجيني 7) التي كانت دون علاج (A)، أو قبل تعامل مع المحمضة (درجة الحموضة 2.5) ماء نقي للغاية (B) والفوسفات وكلوريد (C - E) أو CEPA (F - H ). وتظهر المستعمرات التمثيلية. يظهر السهم السليلوز التي تنتجها ك. xylinus، ينظر إليها على أنها مادة ضبابية حول مستعمرة. شريط مقياس = 0.5 مم. هذا الرقم هكتارق تم تعديلها من Augimeri والشريط 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: الاثيلين المستمدة CEPA-يقلل من القدرة على الاحتفاظ بالماء وزيادة العائد من ك. xylinus pellicles السليلوز. الثقافات ونمت بشكل ثابت في مرق SH (الرقم الهيدروجيني 7) تستكمل مع CEPA في 24 لوحات جيدة، وحضنت في 30 درجة مئوية لمدة 7 أيام قبل أن تحصد pellicles وتحليلها. انخفض الاثيلين المستمدة CEPA-جليدة الوزن الرطب (A)، لم يكن لها تأثير على سمك جليدة (ب) وزيادة جليدة الوزن الجاف (C). وكانت العلاجات CEPA مختلفة لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض. تظهر أشرطة الخطأ SD (ن = 3). الحانات معرسائل مختلفة تختلف معنويا (P <0.05). تم تعديل هذا الرقم من Augimeri والشريط 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7: صورة الممثل من ك. pellicles xylinus. وقد تم قياس سماكة غشاء رقيق من الصور باستخدام برنامج ImageJ. شريط النطاق = 10 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

شكل 8
الرقم 8: تخفيض الاثيلين المستمدة CEPA-لترطيبوقد نمت ك xylinus pellicles السليلوز عن طريق زيادة جليدة التبلور. الثقافات بشكل ثابت في SH مرق (الرقم الهيدروجيني 7) في 24 لوحات جيدا، وحضنت في 30 درجة مئوية لمدة 7 أيام قبل أن تحصد pellicles وتحليلها. تم احتساب الماء جليدة بالفرق بين جليدة الرطب والوزن الجاف. CEPA المشتقة من الايثيلين خفض جليدة الماء (A) عن طريق زيادة التبلور جليدة (B). وكانت العلاجات CEPA مختلفة لا تختلف كثيرا عن بعضها البعض. تظهر أشرطة الخطأ SD (ن = 3). الحانات بأحرف مختلفة تختلف معنويا (P <0.05). تم تعديل هذا الرقم من Augimeri والشريط 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأساليب المذكورة هنا تلخص في الإنتاج الموقعي من الاثيلين من CEPA لدراسة استجابة الاثيلين البكتيرية باستخدام كائن نموذج، K. xylinus. هذه الطريقة مفيدة جدا كما الاثيلين يمكن أن تنتج من خلال استكمال أي وسط مائي يحتوي على الأس الهيدروجيني أكبر من 3.5 10،11 مع CEPA انتفت الحاجة للغاز الاثيلين النقي أو معدات المختبرات المتخصصة. هذه الطريقة لا يقتصر على دراسة آثار الاثيلين المستمدة CEPA على البكتيريا ولكن يمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة استجابة الاثيلين في الكائنات حقيقية النواة. من المهم أن يتم تنفيذ تجارب السيطرة متوازية مع الفوسفات وكلوريد كما يتم إنتاج هذه المركبات أيضا من التحلل CEPA في الموقع. المراقبة الضرورية الأخرى هي للتأكد مما إذا CEPA نفسها تمارس تأثيرا مباشرا على الثقافات الميكروبية قيد التحقيق. من الناحية الفسيولوجية وأنتجت تركيزات الاثيلين ذات صلة عندما ك. الثقافات xylinus نحنإعادة زراعتها في SH متوسطة الحموضة 5، وبالتالي يكون بمثابة الرقابة على الآثار CEPA 9؛ ومع ذلك، فإن هذا النهج يعمل فقط للكائنات متسامحة الحمضية.

استخدام الإيثيلين المستمدة CEPA-للدراسات البيولوجية في متوسط ​​النمو مائي يتطلب التحقق من أن الاثيلين هو في الواقع يتم إنتاجها داخل النظام. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم لA. thaliana فحص استجابة الثلاثي الذي يستغل النمط الظاهري استجابة الثلاثي التي أظهرتها الشتلات المزروعة داكنة في وجود من الاثيلين 1. أطباق بتري مقسمة إلى أربعة أجزاء تسمح للشتلة لزراعتها في MS المتوسطة على حدة، ولكن المتاخمة للمتوسط ​​نمو الميكروبات ذات الصلة. تطبيق حل CEPA على وسط النمو الميكروبي يسهل إنتاج الاثيلين ويعرض الشتلات المجاورة إلى مصدر خارجي من الاثيلين كما تتسرب إلى فراغ الرأس. المكمل لمتوسطة MS مع لجنة التنسيق الإدارية يوفر مراقبة إيجابية كما أنه يعزز منتج الذاتيةأيون من الاثيلين قبل أ. thaliana وتحريض لاحق من النمط الظاهري استجابة الثلاثي.

ثقافة الرقم الهيدروجيني هو اعتبار آخر مهم عند إنتاج الإيثيلين من CEPA في وسط النمو الميكروبي 13،14. المتوسط SH تستخدم عادة لثقافة ك. xylinus لديه درجة الحموضة من حوالي 5 مما يقلل إلى حد كبير إنتاج الإثيلين المستمدة CEPA (Augimeri والشريط، بيانات غير منشورة). وبالتالي، تم تعديل المتوسط ودرجة الحموضة 7 9. وهذا يتفق مع الدراسات الأخرى التي أظهرت أن معدل CEPA انهيار بطيء للغاية عند أو أقل من درجة الحموضة 5، في حين تم تعزيز ذلك إلى حد كبير في درجة الحموضة 7 13. ولذا فمن الضروري لضمان أن متوسط النمو للكائن الحي اختبار يبقى فوق درجة الحموضة 5. ك. وصلت الثقافات xylinus أدنى درجة الحموضة من حوالي 5.5، مما يتيح للتطور الاثيلين 9. من المهم أن نلاحظ أن التركيز المطلق من الاثيلين لا يمكن السيطرة عليها في ظل هذه الثقافة جonditions.

تأثير الاثيلين المستمدة CEPA على نمو وإنتاج السليلوز، وخصائص جليدة من ك. وقد استخدم xylinus لتوضيح أن ردود الاثيلين البكتيرية يمكن دراسة استخدام CEPA. التكيف مع هذه الأساليب لدراسة استجابة الاثيلين في كائنات حية أخرى بسيطة مثل تغيير متوسطة النمو وتحليل النمط الظاهري. استخدام CEPA يوفر للباحثين بديلا مريحة للغاز الاثيلين وقد يشجع المزيد من الدراسات بوساطة الاثيلين في البكتيريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) Sigma A3903 Biosynthetic precursor of ethylene in plants
4-sector Petri dish Phoenix Biomedical CA73370-022 For testing triple response
Agar BioShop AGR001.1 To solidify medium
Canon Rebel T1i DLSR camera Canon 3818B004 For pictures of pellicles
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921  Sigma C2730 Aqueous solution
Citric acid BioShop CIT002.500 For SH medium
Commercial bleach Life Brand 57800861874 Bleach for seed sterilization
Concentrated HCl BioShop HCL666.500 Hydrochloric acid for pH adjustment
Digital USB microscope Plugable N/A For pictures of colonies
Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) Sigma C0143 Ethylene-releasing compound
Glucose BioBasic GB0219 For SH medium
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 ATCC 53582 Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium
Microcentrifuge tube LifeGene LMCT1.7B 1.7 ml microcentrifuge tube
Murashige and Skoog (MS) basal medium  Sigma M5519 Arabidopsis thaliana growth medium
Na2HPO4·7H2O  BioShop SPD579.500 Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium
NaCl BioBasic SOD001.1 Sodium chloride for saline and control solution
NaH2PO4·H2O  BioShop SPM306.500 Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution
NaOH BioShop SHY700.500 Sodium hydroxide for pH adjustment
Paraffin film Parafilm PM996 For sealing plates and flasks
Peptone (bacteriological) BioShop PEP403.1 For SH medium
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific 3900 Bacterial cell counting chamber
Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm VWR 28145-501 For sterilizing cellulase
Sucrose BioShop SUC600.1 Sucrose for MS medium
Yeast extract BioBasic G0961 For SH medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
  2. Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
  3. Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
  4. Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
  5. Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
  6. Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
  7. Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
  8. Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
  9. Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
  10. Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
  11. Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
  12. Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
  13. Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
  14. Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 117، حمض 2-chloroethylphosphonic، CEPA، الاثيلين،
الاستفادة من مجمع بين الافراج عن الإثيلين، حمض 2-Chloroethylphosphonic، كأداة لدراسة استجابة الإثيلين في البكتيريا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Augimeri, R. V., Varley, A. J.,… More

Augimeri, R. V., Varley, A. J., Strap, J. L. Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria. J. Vis. Exp. (117), e54682, doi:10.3791/54682 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter