Introduction
Olefin (C2 lH 4) havagazı lambaları kullanılan bir laboratuarda yetiştirilir bezelye fide, (hipokotiller) daha kısa olduğu gövde olan bir anormal morfoloji sergilemiş olduğu gözlemlenmiştir, birinci 1901, bir bitki hormonu olarak tespit edilmiştir, daha kalın ve normal bezelye fide ile karşılaştırıldığında yan bükülmüş; Bir fenotip sonra üçlü cevap 1,2 olarak nitelendirdi. Daha sonraki çalışmalar, etilen gibi büyüme, stres yanıtı, meyve olgunlaşma ve yaşlanma 3. Arabidopsis thaliana, bitki biyolojisi araştırma için bir model organizma olarak çok sayıda gelişimsel süreçleri düzenleyen önemli bir fitohormondur, iyi etilen verdiği yanıtta açısından incelenmiştir olduğunu göstermiştir. Çeşitli etilen tepki mutantlar koyu yetişkin A'da görülen üçlü cevap fenotip istismar ederek izole edilmiştir etilen 1,4,5 mevcudiyetinde thaliana fideleri. bitkilerdeki etilen üretimi için biyosentetik ön-madde 1-a,minocyclopropane karboksilik asit (ACC) 6 ve yaygın olarak üç karşılık fenotipi 1,4,5 neden endojen, etilen üretimini geliştirmek için üçlü cevap deneyi sırasında kullanılır.
Etilen yanıtı yaygın bitkilerde çalışılan olmasına rağmen, bakteriler üzerinde eksojen etilen etkisi büyük ölçüde bitkiler ile bakterilerin yakın ilişki rağmen understudied edilir. Bir çalışmada, belirli Pseudomonas suşları karbon ve enerji 7'nin tek kaynağı olarak etilen kullanarak hayatta olduğunu bildirdi. Ancak, yalnızca iki çalışma bakteri etilen yanıt göstermiştir. İlk çalışma göstermiştir ki Pseudomonas aeruginosa, P. suşları fluorescens, P. putida ve P. syringae eriyik agaroz, saf etilen gazı 8 ile dengelenmiş bir kemotaksis tampon maddesi ile karıştırıldı olan bir agaroz tıkayıcı deneyi kullanılarak, etilen bakımından kemotaktik edildi. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, hiçbir Furth olmuşturSaf etilen gazı kullanılarak er raporları nedeniyle özel ekipman olmadan laboratuvarda gazların sevkinde güçlüğüne muhtemel bakteriyel etilen tepkisini, karakterize etmek. Bakteriyel etilen tepkisinin ikinci rapor etilen 9 xylinus meyve ilişkili bakteri Komagataeibacter (eski Gluconacetobacter) bakteriyel selüloz üretimi ve etkisinde gen ifadesini arttığını gösterdi. Bu durumda, etilen-salan bileşik, 2-chloroethylphosphonic asit (İEKB) saf etilen gazı ve özel ekipman ihtiyaç kalmaz, bakteriyel büyüme ortamında in situ etilen meydana getirmek üzere kullanıldı.
- 14, bir baz katalizörlü, birinci dereceden reaksiyon 12 boyunca pH 3.5 10,11 Yukarıdaki: 1 molar oranında İEHB 1 etilen üretir. CEPA bozunması pozitif Etil pH ve sıcaklık 13,14 ve sonuçlar ile ilişkilidiren, klorür ve fosfat. CEPA gaz etilen için uygun bir alternatif etilen bakteriyel yanıtları okuyan ilgilenen araştırmacılar sağlar.
Aşağıdaki protokoller genel amacı bakteriyel etilen tepkisini incelemek için basit ve etkili bir yöntem sağlamaktır ve bakteriyel büyüme ortamında CEPA'nın ayrışma etilen üretiminin fizyolojik olarak uygun seviyelerinin doğrulaması içerir, kültür pH analizi CEPA ayrışma sırasında zarar görmemesini sağlamak için bakteri üremesi ve bakteriyel morfoloji ve fenotip üzerindeki etilen etkisi değerlendirilmesi. Biz K. kullanarak bu protokolleri göstermek xylinus, bununla birlikte, bu protokoller uygun büyüme ortamı kullanılarak ve fenotip analizi diğer bakterilerde etilen tepkisini incelemek için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kimyasallar
- 500 mM NaH 2 PO 4 · asitleştirildi içinde H2O (137,99 g / Mol) (pH 500 mM CEPA (144.49 gr / mol) ihtiva eden bir çözelti, ve her ikisi de, 500 mM NaCI (58.44 g / mol) 'den oluşan bir çözelti hazırlamak 2.5) ultra saf su ve 0.1 N HCI. çözümler açıktır kadar vorteks ile karıştırın.
- Seri olarak 5 mM ve 50 mM stok elde etmek için aynı çözücü (10 x) 500 mM seyreltik çözeltiler.
- Ultra saf su içinde 1-aminosiklopropan karboksilik asit (101.1 g / mol ACC) içindeki bir 10 mM çözelti hazırlayın.
- -Filtre sterilize -20 ° C'de stok çözümleri ve mağaza alikotları.
- Filtre sterilize selülaz. 4 ° C'de saklayın alikotları.
2-chloroethylphosphonic acid Ayrışma 2. doğrulanıyor Etilen Üretimi: Üçlü Tepki Testi
- Buhar fazlı Yöntemiyle Ekotip Columbia tohumları thaliana Arabidopsis Yüzey sterilize:
DİKKAT: Aşağıdaki adımı t üretiroksik klor gazı. Davlumbaz tohum sterilizasyon kuralları.- Tohum sterilizasyon için 250 ml cam beher karşılamak ve davlumbaz yerleştirmek yeterince derin bir yapışmalı kabı alın.
- A. ekle thaliana bir mikrosantrifüj tüp tohum ve rafa tüp yerleştirin. yapışmalı kabın içine açık tüp içeren raf yerleştirin.
Not: klor gazı daha düşük tohum nüfuz sağlamak için yarısı dolu üzerinde bireysel tüpleri doldurmak etmeyin. - sızdırmaz kapta ticari ağartıcı, 100 ml içeren 250 ml'lik bir beher yerleştirin. Dikkatle ağartıcıya konsantre HCI 3 ml ilave edilir ve derhal kapaklı konteyner mühür.
DİKKAT: Ağartıcı ve HCl tohumları, yüzey sterilize edilmesi işlevini görürler toksik klorin gazı üretmek için reaksiyona girer. - fumehood 4 saat boyunca klor gazı varlığında tohumları inkübe edin.
Not: Daha uzun sterilizasyon süreleri çimlenme etkinliğini azaltacaktır. - Sterilizasyon sonrasında, c izinhlorine gaz daha sonra en az 1 saat süre ile duman davlumbazında havalandırma mikrosantrifüj tüpü mühür. atılmadan önce en az 24 saat boyunca fumehood çamaşır suyu ve HCl karışımı bırakın.
Not: Sterilize edilmiş tohumlara, acil kullanım için oda sıcaklığında saklanabilir. - Uzun süreli depolama boyunca 4 ° C 'de tohum tutun. yoğunlaşmayı önlemek için ependorf tüp açmadan önce oda sıcaklığına kadar tohum getirin. karanlıkta saklayın tohumları.
- 4-sektör Petri Yemekleri (90 x 15 mm) Agar Plakaları hazırlayın:
- A. büyüme ortamı 110 ml hazırlanması thaliana fidanları: 1 x Murashige ve% 1 ihtiva eden Skoog (MS) bazal ortam 15 (4.33 gr / lt) (ağ / hac) sakroz ve% 0.8 (ağ / hac) ağar. NaOH ile pH 6'ya MS ortamı ayarlayın.
- CEPA'nın ayrışma bakteriyel büyüme ortamı 100 ml hazırlayın: Schramm ve Hestrin 16% 1.5 ihtiva eden (SH) ortamı (ağırlık / hacim) ağar. NaOH ile pH 7'ye SH ortamı ayarlayın.
- otoklav ve tempe tarafından medya sterilize55 ° C su banyosu içinde R.
- MS agar katkılı sonra, steril bir şişeye 40 mi ekleyin. A. pozitif kontrol büyüme ortamı hazırlamak için thaliana fideler, 10 uM ACC bir son konsantrasyon elde etmek üzere, 10 mM ACC 40 ul MS agar 40 ml kısım tamamlar.
- Sektörlü Petri kapları (Şekil 1), uygun kadran ortamın 5 ml ilave edilir ve Ağarı katılaştırmak için bir olanak sağlar. üç nüsha olarak tüm tabak hazırlayın.
Not: CEPA sonra protokolde kadar büyüme ortamına ilave edilmez.
Şekil 1:. CEPA üçlü müdahale analizi için kullanılan agar plakaları Kur şematik (negatif kontrol (A), pozitif kontrol (B) belirli bir kadran ve deney plakaları görüntülemektedirC). Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Tabakalandırmak A. thaliana Tohumlar Senkron Çimlenme sağlamak için:
- Yaklaşık elli A. ekle MS veya MS + ACC agar içeren her kadranda üzerine thaliana tohumları. Emin olun tohumlar eşit fide çıkarılmasını ve analizi kolaylaştırmak için dağıtılır.
- Plakalar 4 ° C'de karanlıkta tohumlarının inkübe 3-4 gün ° C.
- Üçlü Tepki Testi Bakteriyel Büyüme Medium üzerinde CEPA (SH) ayrıştırmak ve uygulayın:
- tabakalaşma sonra, 2 saat boyunca floresan ışık tohumları maruz.
- SH agar içeren deney levhaları çeyrek üzerine 500 mM İEKB stok çözeltisinin 10 ul yay (pH 7, Şekil 1) bir son konsantrasyon elde etmek için CEPA'nın1 mM.
- laboratuvar film ile plakaları mühür ve tohum için karanlık bir ortam yaratmak için folyo ile kaplayın.
- Aşağı agar yüzü 3 gün boyunca 23 ° C'de karanlıkta plakaları inkübe edilerek de tohumlar çimlenmeye.
Not: Tabaklar yığılmış olabilir, ancak etilen havadan daha hafif olduğu için negatif kontroller altına konulmalıdır.
- Üçlü Tepki Testi Verileri Analiz:
- Alev sterilize forseps ile, bir diseksiyon veya dijital USB mikroskop altında her tedavi ve görünümüne tekabül eden bir plakadan tek fidan kaldırın. fide alt hizalanmış ve fotoğrafı emin olun.
- Her kadranda 30 fideleri (biyolojik çoğaltmak başına 60 fide ve tedavi başına 180 fidan) çıkarın. bir cetvel ile siyah bir arka plan ve fotoğraf ile bir yüzey üzerinde aynı hizaya getirin.
- ImageJ yazılımı 17 kullanarak çoğaltmak fidelerin hipokotil uzunluğu (mm) ölçün. tıklayıp * düz sürükleyerek ölçeği ayarlama *aracı 10 mm uzunluğunda seçin. "Analiz" sekmesi altında "Set Ölçeği" i seçin ve * Parçalı aracını kullanarak 10'a bilinen mesafeyi ayarlamak, tıklayın ve sürükleyin mesafeyi ölçmek için hipokotil ve basın M uzunluğunu seçmek için kullanılır. Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek-yönlü ANOVA kullanılarak biyolojik çoğaltır araçlarını karşılaştır. Farklılıklar <0.05 anlamlı eğer p olarak kabul edilir.
Bakteriyel Büyüme boyunca pH 3. Analiz
- Üç nüsha olarak xylinus Starter Kültürler büyümek ve Ölçmek Komagataeibacter:
- K. tek bir koloni İnokülasyon xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. 0.4, 0.3, 600 ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 72 saat) kadar 150 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de kültürler inkübe edin.
- santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). 5 ml steril% 0.85 ile NAC (w / v)l Çözelti hücreler iki kez yıkama ve hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun.
- Bir Petroff-Hausser sayma odasını kullanarak hücrelerin ölçmek.
- pH Analiz için Kültürleri aşılamak:
- folyo kapak ile on iki adet 500 ml'lik şişelere% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH suyu (pH 7), 150 ml ilave edilir. K. ile şişeler aşılamak 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda xylinus başlangıç kültürleri. Üç starter kültür kullanılarak, tedavi başına üç biyolojik çoğaltır hazırlamak.
- 5, 50 veya 500 mM İEKB stok çözeltileri 300 ul Ek kültürleri, sırasıyla, 1.0 mM, 0.01, 0.1 nihai CEPA konsantrasyonlar elde, ve. Cepa çözmek için kullanılan çözücü, 300 ul muamele edilmemiş kontrol kültürleri Supplement.
- sıkı şişelere folyo kapak bantlayarak şişeler kapatılır ve 150 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de 14 gün boyunca kültür inkübe edin.
- Her gün, aseptically (10 dakika;, 4 ° C 2,000 x g) santrifüj ile, her şişe ve topak hücrelerinden 5 mi örnek alabilir. temiz bir tüpe süpernatantlar aktarın ve bir pH ölçer kullanılarak her bir biyolojik tekrarında pH'ı ölçülür.
- biyolojik çoğaltır ortalama pH değeri grafik ile zaman ders verileri analiz edin.
Not: kültür pH 3.5'in altında düşmemesine önemlidir; 5 bir kültür pH değerinin önemli ölçüde CEPA etilen salınımını azaltan ve 3.5'in altında bir pH değeri, tamamen etilen salınımını inhibe eder. - , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH 2 PO 4 çözeltinin 1.0 mm'dir.
4. Koloni Morfolojisi
- K. büyümek üç kopya halinde xylinus Başlangıç Kültürleri:
- K. tek bir koloni İnokülasyon xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. doğmuş iyileşmesini0.4, 0.3 OD 600 kadar, 150 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de te kültürleri (yaklaşık 72 saat) ulaşılır.
- santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). Steril tuzlu su, 5 ml hücre, yıkama ve daha sonra hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun.
- % 1.5 SH 25 ml içeren 24 agar plakaları (pH 7) orta hazırlayın (a / h) agar.
- Agar katılaşmış sonra, sırasıyla 0.01, 0.1, ve 1.0 mM nihai CEPA konsantrasyonları elde edilmesi için 5, 50, 50 ul ve agar üzerinde, 500 mM CEPA stok solüsyonları yayıldı. herhangi bir değişiklik meydana ve çözücünün 50 ul yayılan ayarlama muamele edilmemiş ve çözücü kontrol plakaları, test bileşiklerini çözmek için kullanılan.
- K. bir döngü dolu (~ 5 ul) ile izole edilmiş koloniler için şerit tabakalar xylinus starter kültür ve parafin film ile onları mühür. üç nüsha olarak tüm plakaları aşılamak. 30 ° C'de beş gün süreyle inkübe edin.
- fotniteliksel bir dijital USB mikroskop kullanarak ve 20X büyütmede ograph koloniler katı ortam üzerinde koloni morfolojisi ve selüloz üretimi değerlendirmek.
Not: Selüloz koloni kenarı boyunca puslu bir madde olarak görünür. - , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH 2 PO 4 çözeltinin 1.0 mm'dir.
5. zar Tahliller
- Büyümek ve Ölçmek K. üç kopya halinde xylinus Başlangıç Kültürleri:
- Üç nüsha olarak, K. tek bir koloni aşılamak xylinus% 0.2 (h / h) filtre ile sterilize selülaz ile takviye edilmiş SH ortamı, 5 ml (pH 5) içinde. 0.4, 0.3, 600 ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 72 saat) kadar 150 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de kültürler inkübe edin.
- santrifüj ile hasat başlatıcı kültürleri (2000 x g, 4 ° C, 10 dakika). Steril tuzlu su, 5 ml, t yıkamao hücreler iki kez ve hücre pelletini. hücreleri buz üzerinde tutun.
- Bir Petroff-Hausser sayma odasını kullanarak hücrelerin ölçmek.
- 24 oyuklu plakaların aşılanması için ana karışımlarını hazırlamak:
- sırasıyla 0.01, 0.1, ve 1.0 mM nihai CEPA konsantrasyonları elde edilmesi için 5, 50, 120 ul ve 500 mM İEHB stokları SH ortamı 60 ml (pH 7) Supplement. Cepa çözmek için kullanılan çözücü, 120 ul SH ortamı (pH 7) arasında bir 60 ml Supplement. Vortex karıştırın.
- dört adet 14 ml'lik miktarlar halinde İEHB içeren bir maddenin her birinden 60 ml bölün. 10 5 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda başlatıcı kültür biyolojik çoğaltır 14 ml alikotlar üç inoküle. selüloz üretimi önlemek için buz üzerinde hücreleri ile tüpler tutun.
Not: Geri kalan 14 ml bir örnek steril kontrol kuyuları için kullanılacaktır.
- 24 oyuklu plakaların aşılanması:
- Üç biyolojik çoğaltır satır ve kendi plaka her tedaviyi testSteril kontrollerin bir satır (Şekil 2).
Şekil 2:. Zar tahlilinde ve analiz Hazır İEHB-desteklenmiş, pH 7 SH ortamı (60 mi) için kullanılan protokol gösteren bir akış şemasıdır, üç ayrı biyolojik suret aşılamalar ve steril bir kontrol (14 mL) ekstrakte edildi için örnek olarak alındı. Bu kültürler daha sonra bir 24 yuvalı plaka içine altı teknik çoğaltır (2 mi) içine bölüştürülmüştür ve parafın bir film ile kaplanmıştır. 30 ° C'de 7 gün beklettikten sonra, zarlarına hasat edilir ve FT-IR ile ıslak ağırlık, kalınlık, kuru ağırlığı, ve kristal belirlenmesi ile karakterize. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız
- 14 ml ana karışımı kullanarak, EAC içine 2 ml ekleyinsteril 24 oyuklu plaka altı kuyu H. Üç biyolojik çoğaltır ve steril kontrol (Şekil 2) için tamamlayın. Her tedavi için tekrarlayın.
- parafın film kapatma plakaları ve 30 ° C 'de 7 gün süre ile, statik inkübe edin.
- Hasat ve Tedbir pelikül Islak Ağırlığı, Kalınlığı, kuru Ağırlık (Selüloz Verim) ve kristal yapıdaki (Şekil 2):
- Rakip zar kenarı yükseltmek ve forseps ile bireysel zarlarına kaldırmak için ince tabakanın bir tarafını basınız. kavrama koruyarak, kendi ıslak ağırlıkları belirlemek için tartım önce aşırı orta kaldırmak için 3 sn taze kağıt havlu üzerine koyun.
- yüksek çözünürlüklü bir dijital kamerayı kullanarak taraftan bir cetvel ve fotoğraf bitişik zarlarına hizalayın.
- ImageJ yazılımı kullanma 17, sol omuz, sağ omuz ve her ince tabakanın ortasına pelikül kalınlığını ölçmek. Her biyolojik RepliCat için tüm teknik çoğaltır ortalamae.
- Ayrı ayrı 6-çukurlu bir plaka gözlerine zarlarına transfer. 20 dakika hücreleri lize etmek için, 80 ° C de, 0.1 N NaOH 12 ml zarlarına tedavi edin.
- NaOH çıkarın ve ajitasyon ile 24 saat boyunca ultra saf su ile yıkanarak zarlarına nötralize eder. suya her 6 saat değiştirin.
Not: ince zarlar yıkama aşamasının tamamlanması üzerine beyaz olmalıdır. - Talep silikon tabakaları üzerindeki ince zarlar ve sabit bir ağırlığa kadar 48 saat boyunca 50 ° C'de kurutulur. Kuru kez, bakteriyel selüloz verimi belirlemek için analitik bir ölçekte pelikül ağırlıkları paspaslar kaldırmak ve ölçün.
- 4.000 650 cm aralığında kızılötesi spektroskopisi (FT-IR) 32 taramaları kullanılarak ve 4 sm bir çözünürlük -1 Fourier dönüşümü kullanılarak ince tabaka kristal analiz -1. A 1437 / A 895 kullanarak, kristallik endeksi, CI (IR) hesaplayın; "kristal bant" ve "amorf band" absorbansı oranı daha önce 18 nitelendirdi.
- , Klorin ve fosfat seviyeleri kontrol, 0.01, 0.1 ile aynı deney sonuçlarını ve sırasıyla 5, 50 ve 500 mM stoklar kullanıldığında NaCl NaH 2 PO 4 çözeltinin 1.0 mm'dir.
- Zar Verileri Analiz:
- zar ıslak ağırlığı ve kuru ağırlığı arasındaki farkı belirleyerek pelikül hidrasyon hesaplayın.
- İstatistiksel analiz için her bir biyolojik çoğaltmak için tek bir değer elde etmek için tüm teknik çoğaltır değerlerinin ortalamasını alın. Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek-yönlü ANOVA ile tedavi karşılaştır. Farklılıklar p eğer <0.05 anlamlı bulunmaktadır.
- Tedavi edilmeyen kontrollerin yüzdesi olarak veri normalleştirmek ve biyolojik çoğaltır araçları arsa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Üçlü cevap testi ile SH ortamında CEPA etilen kurtuluş (pH 7) doğrulanması için bir şematik plaka kurulum Şekil 1A gösterilmiştir - C. Zar protokolünü gösteren bir akış şeması Şekil 2'de Koyu-yetişkin A. gösterilir thaliana fideler ACC mevcudiyetinde ve SH ortamı Cepa ayrışma yoluyla üretilen etilen (pH 7) varlığında üçlü cevap fenotipi (abartılı apikal kancalı daha kısa ve daha kalın hipokotil) sergiler, fakat tedavi edilmemiş koşullarda (Şekil 3A) 9. ACC- ve İEHB türetilmiş etilen tedavi A. hipokotil uzunluğu thaliana tohumları anlamlı idi (p <0.0001) bir fizyolojik ilgili konsantrasyonları da SH ortamı (pH 7) üzerinde CEPA serbest bırakıldı işlenmemiş kontrollerle (Şekil 3B) 9, bu etilen doğrulayan daha kısayon. Muamele edilmemiş ve İEHB tedavi edilen K. pH xylinus kültürleri 5'in üzerinde (Şekil 4) 9 kalmıştır; Bu nedenle, etilen olarak CEPA'nın bozunma bakteriyel bir organik asit üretimi azaltılmaz. CEPA türetilmiş etilen zaman K. bakteriyel selüloz üretimi arttı xylinus Katı SH ortamı üzerinde büyütülmüştür (pH 7) (Şekil 5) 9. İEHB türetilmiş etilen tüm konsantrasyonlar önemli ölçüde ince tabaka kalınlığı (Şekil 6B) ve önemli ölçüde artmış pelikül, kuru ağırlık etkilemedi, pelikül, ıslak ağırlık (Şekil 6A) azalmıştır (selüloz verim; Şekil 6C) 9. Ince tabaka kalınlığı ölçümü için alınan temsili bir verilmedi Şekil 7'de gösterilmiştir. Ince tabaka hidrasyon CEPA türetilmiş etilen (Şekil 8A) 9 her konsantrasyonları ile indirgenmiştir, İEKB türetilen tüm konsantrasyonlar etilen 9 PEL artarkenlicle kristallikte (Şekil 8B). NaCI ve NaH 2 PO 4 etkileri gözlenen fenotipleri CEPA türetilmiş etilen neden olduğunu teyit (veriler gösterilmemiştir) tüm durumlarda önemsizdi.
Şekil 3: CEPA etilen üretmek için SH ortamı (pH 7) üzerinde ayrışır Dijital USB mikroskop fotoğrafları gösteriyor ki koyu yetişkin A.. thaliana fideler üçlü cevap fenotip göstermeyen (daha kısa hipokotil, kalın hipokotil ve apikal kanca abartılı) muamele edilmemiş (A) kontrolü ile karşılaştırıldığında ACC ve İEHB türetilmiş etilen yanında çoğaldığı takdirde. ACC ve İEHB türetilmiş etilen mevcudiyetinde büyütülen fidelerin hipokotil uzunluğu significantl edildimuamele edilmemiş kontrol (B) daha kısa Y. Ölçek çubuğu = 1 mm. Hata çubukları SD gösterir (n = 3). Farklı harflerle Barlar anlamlı farklılık bulundu (p <0.0001) bulunmaktadır. Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4: K. pH xylinus kültürler SH ortamı içinde CEPA'nın ayrışma (pH 7). Kültür pH değeri, bakteriyel büyüme döngüsü boyunca etilen olarak CEPA etkin ayrışma sağlayan, 5 üzerinde kalır için yeterince yüksek olarak kalır. K. pH xylinus kültürleri salgıladıkları olarak izlenmekte ve organik asitler resorbe gerekir. efsane test CEPA konsantrasyonlarını göstermektedir. Y-ekseni başlar NotpH 5. Hata çubukları SD gösterir (n = 3). Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: CEPA türetilmiş etilen K. tarafından selüloz üretimini artırdı katı ortam üzerinde xylinus. K. ya İEHB (F - H - xylinus (A) muamele edilmemiş ya da edildi SH agar plakaları (pH 7) üzerinde büyütülmüştür asitleştirildi (pH 2.5), ultra-saf su (B), fosfat ve klorür (E, C) ile ön-muamele edilmiş ). Temsili koloniler gösterilir. K. tarafından üretilen ok gösterileri selüloz xylinus, koloni çevresinde puslu madde olarak görülüyor. Ölçek çubuğu = 0,5 mm. Bu rakam haAugimeri ve Askı 9'dan değiştirildi s. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 6: CEPA türetilmiş etilen su tutma kapasitesini azaltır ve K. verim artar ince zarlar toplanır ve analiz edilmeden önce xylinus selüloz ince zarlar. Kültürler, 24 yuvalı plakalar içinde CEPA ile takviye SH suyu (pH 7) statik olarak büyüdü ve 7 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edilmiştir. İEHB türevi, etilen, pelikül, ıslak ağırlık (A), azalmış ince tabaka kalınlığı (B) ve artan pelikül kuru ağırlığa (C) üzerinde herhangi bir etki. Farklı CEPA tedavileri birbirinden anlamlı farklılık yoktu. Hata çubukları SD gösterir (n = 3). ile barlarFarklı harfler anlamlı farklılık bulundu (p <0.05) bulunmaktadır. Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7: K. Temsilcisi fotoğraf xylinus zarlarına. Ince tabaka kalınlığı ImageJ yazılımı kullanılarak fotoğraflardan ölçülmüştür. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 8: İEHB türetilmiş etilen hidrasyonunu azaltılmışK. xylinus selüloz zar kristal arttırarak ince zarlar. Kültürler, 24 yuvalı plakalar içinde SH suyu (pH 7) statik olarak büyümüş ve ince zarlar toplanır ve analiz edildi önceki 7 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edilmiştir. Zar hidrasyon peliküle ıslak ve kuru ağırlığı arasındaki fark olarak hesaplandı. Artan zar kristallikte (B), etilen, indirgenmiş pelikül hidrasyon (A) CEPA türetilen. Farklı CEPA tedavileri birbirinden anlamlı farklılık yoktu. Hata çubukları SD gösterir (n = 3). Farklı harflerle bar önemli ölçüde farklı (p <0.05) vardır. Bu rakam Augimeri ve Askı 9 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen yöntemler modeli organizma, K. kullanılarak bakteriyel etilen tepkisinin incelenmesi için CEPA etilenin in situ üretimini anahat xylinus. Etilen bir pH'a CEPA saf etilen gazı veya özel laboratuar ekipmanı ihtiyacını ortadan sahip daha büyük 3.5 10,11 sahip herhangi bir sulu ortam ilave üretilebilir Bu yöntem çok yararlıdır. Bu yöntem, bakterilerin Cepa türetilmiş Etilenin etkilerini incelemek ile sınırlı değildir, aynı zamanda ökaryotik organizmalarda etilen tepkisini incelemek için uyarlanabilir edilebilir. Bileşikler, aynı zamanda in situ CEPA'nın ayrışma üretilmektedir, paralel kontrol deneyleri fosfat ve klorid ile yapılması önemlidir. Başka gerekli kontrol CEPA kendisi soruşturması kapsamında mikrobiyal kültürler üzerinde doğrudan etki gösterir olup olmadığını belirlemektir. Fizyolojik olarak alakasız etilen konsantrasyonu K. üretildi xylinus kültürleri bizpH 5 SH ortamı içinde yetiştirilen ve İEHB etkileri 9 için bir kontrol olarak hizmet nedenle yeniden; Ancak, bu yaklaşım sadece asit toleranslı organizmalar için çalışıyor.
sulu bir büyüme ortamında biyolojik çalışmalar için İEHB türetilmiş etilen kullanımı etilen gerçekten de sistem içinde üretilen olduğu doğrulama gerektirir. Burada tarif edilen yöntem A kullanır etilen 1 varlığında karanlıkta yetişen fidan tarafından sergilenen üçlü cevap fenotip patlatır thaliana üçlü cevap tahlil. dört parçaya ayrılır Petri kapları fideler ayrı MS ortamında büyütüldü, ancak ilgili mikrobiyal büyüme ortamına bitişik izin verir. mikrobiyal büyüme ortamına İEKB çözeltisinin uygulanması, etilen üretimini kolaylaştırır ve tepe boşluğu infiltratlar olarak bir etilen eksojen kaynağına bitişik fide ortaya çıkarır. endojen ürünü geliştirir olarak ACC ile MS ortamı tamamlayan bir pozitif kontrol sağlarA. Etilen iyon thaliana ve üçlü cevap fenotip sonraki indüksiyon.
Mikrobiyal büyüme ortamı 13,14 CEPA gelen etilen üretimi sırasında Kültür pH önemli bir husustur. Tipik olarak, kültür K. kullanılan SH ortamı xylinus esas İEHB türetilmiş etilen (Augimeri ve kayış, yayınlanmamış veriler) üretimini azaltır, yaklaşık 5 arasında bir pH değerine sahiptir; Bu nedenle, orta pH 7'ye 9'a ayarlandı. Bu büyük ölçüde pH 7 13 de artar ise İEKB arıza oranı, ya da pH 5'in altında son derece yavaş olduğunu gösterdi, diğer çalışmalarla tutarlıdır. sağlamak için elzemdir test organizmasının bir büyüme ortamı, pH 5 K. üzerinde kalmasını xylinus kültürleri etilen 9 çıkışına olanak verilerek, yaklaşık 5.5 minimum pH ulaşmıştır. Etilen saf derişimi, bu kültür c kontrol edilemez olduğunu not etmek önemlidirşartlarından.
K. büyümesi, selüloz, ve zar özelliklerini Cepa türetilmiş etilen etkisi xylinus bakteriyel Etilen tepkileri cepa kullanılarak incelenebilir ki göstermek için kullanılmıştır. diğer organizmalar etilen tepkisini incelemek için bu yöntemleri uyarlanması büyüme ortamı değişiyor ve fenotip analizi gibi basit. CEPA kullanımı etilen gazı için uygun bir yerine araştırmacılara sağlar ve bakterilerin daha fazla etilen-aracılı çalışmaları teşvik edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 ml microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
- Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
- Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
- Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
- Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
- Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
- Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
- Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
- Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
- Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
- Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
- Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
- Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I.
