Introduction
L'etilene olefina (C 2 H 4) fu scoperto come ormone vegetale nel 1901, quando si è osservato che piantine pisello, coltivate in un laboratorio che utilizza lampade a gas di carbone, mostravano una morfologia anomala in cui steli (ipocotili) erano più corte, più spessa e piegato di lato rispetto ai normali piantine di piselli; un fenotipo in seguito definito il 1,2 risposta tripla. Studi successivi hanno dimostrato che l'etilene è un fitormoni vitale che regola numerosi processi di sviluppo come la crescita, la risposta allo stress, la maturazione dei frutti e senescenza 3. Arabidopsis thaliana, un organismo modello per la ricerca biologia vegetale, è stato ben studiato per quanto riguarda la sua risposta alla etilene. Mutanti risposta Diversi etilene sono stati isolati sfruttando il fenotipo risposta tripla osservato in dark-grown A. piantine thaliana in presenza di etilene 1,4,5. Il precursore biosintetico per la produzione di etilene in piante è 1-aAcido minocyclopropane carbossilico (ACC) 6 ed è comunemente usato per il test di risposta tripla per aumentare la produzione di etilene endogeno che porta alla tripla 1,4,5 risposta fenotipo.
Sebbene la risposta etilene viene ampiamente studiato nelle piante, l'effetto dell'etilene esogeno sui batteri è notevolmente poco studiata nonostante la stretta associazione di batteri con piante. Uno studio ha riportato che alcuni ceppi di Pseudomonas possono sopravvivere con etilene come unica fonte di carbonio e di energia 7. Tuttavia, solo due studi hanno dimostrato che i batteri rispondono all'etilene. Il primo studio ha mostrato che ceppi di Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida e P. syringae erano chemiotattica verso etilene utilizzando un test spina agarosio in cui agarosio fuso è stato mescolato con un buffer chemiotassi equilibrata con gas puro etilene 8. Tuttavia, a nostra conoscenza, non ci sono stati Furthrapporti er usano gas etilene puro per caratterizzare la risposta di etilene batterica, probabilmente a causa della difficilmente di gestire gas in laboratorio, senza attrezzature specializzate. La seconda relazione di risposta etilene batterica dimostrato che un aumento della produzione di etilene di cellulosa batterica e l'espressione genica influenzato nel batterio frutta-associata, Komagataeibacter (ex Gluconacetobacter) xylinus 9. In questo caso, il composto di etilene-releasing, acido 2-chloroethylphosphonic (CEPA) è stato usato per la produzione di etilene in situ nel mezzo di crescita batterica, bypassando la necessità di etilene puro o attrezzature specializzate.
CEPA produce etilene in un rapporto 1: 1 molare sopra pH 3,5 10,11 attraverso un primo ordine di reazione base-catalizzata 12 - 14. La degradazione del CEPA è correlata positivamente con pH e temperatura 13,14 e risultati nella produzione di etilene, cloruro e fosfato. CEPA fornisce ai ricercatori interessati a studiare le risposte batterici di etilene con una comoda alternativa per l'etilene gassoso.
L'obiettivo generale dei seguenti protocolli è di fornire un metodo semplice ed efficace per studiare la risposta di etilene batterica e comprende la convalida dei livelli fisiologicamente rilevanti di produzione di etilene da CEPA decomposizione in mezzo di crescita batterica, analisi di pH cultura per assicurare CEPA decomposizione non è compromessa durante crescita batterica, e la valutazione degli effetti dell'etilene sulla morfologia batterica e fenotipo. Dimostriamo questi protocolli che utilizzano K. xylinus, tuttavia, questi protocolli può essere adattato per studiare la risposta di etilene in altri batteri utilizzando il terreno di coltura appropriato e analisi fenotipo.
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Protocol
1. Prodotti chimici
- Preparare una soluzione di 500 mM CEPA (144.49 g / mol), e una soluzione costituita sia 500 mM NaCl (58.44 g / mol) e 500 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O (137.99 g / mol) in acidificata (pH 2.5) ultra-acqua pura o 0,1 N HCl. Mescolare con un vortice fino a quando le soluzioni sono chiare.
- In serie diluire (10x) le soluzioni 500 mm nello stesso solvente per ottenere 5 mm e 50 titoli mm.
- Preparare una soluzione di 10 mm 1-aminociclopropano acido carbossilico (ACC; 101.1 g / mol) in acqua ultra-pura.
- Filtro-sterilizzare soluzioni di riserva e aliquote conservare a -20 ° C.
- Filtro-sterilizzare cellulasi. Aliquote Conservare a 4 ° C.
2. Verifica Etilene produzione da 2-Chloroethylphosphonic acido di decomposizione: Triple Assay Risposta
- Surface-sterilizzare Arabidopsis thaliana Ecotipo Columbia Seeds Uso della fase vapore Metodo:
ATTENZIONE: Il passo successivo produce tgas di cloro ossico. Condurre la sterilizzazione seme in una cappa aspirante.- Ottenere un contenitore sigillabile profondo abbastanza per ospitare un bicchiere di vetro da 250 ml per la sterilizzazione del seme e metterlo in una cappa aspirante.
- Aggiungere A. thaliana semi in una provetta e posizionare il tubo in un rack. Posizionare il rack che contiene il tubo aperto nel contenitore richiudibile.
Nota: Non riempire singoli tubi oltre mezzo pieno per consentire al gas di cloro di penetrare i semi inferiori. - Inserire un becher da 250 ml contenente 100 ml di candeggina commerciale nel contenitore sigillabile. Aggiungere con cautela 3 ml di HCl concentrato alla candeggina e sigillare immediatamente il contenitore con il suo coperchio.
ATTENZIONE: Bleach e HCl reagiscono per produrre gas di cloro tossico che agisce in superficie-sterilizzare i semi. - Incubare i semi in presenza di cloro gassoso per 4 ore in fumehood.
Nota: i tempi di sterilizzazione più lunghi ridurre l'efficienza di germinazione. - Dopo la sterilizzazione, consentire cgas hlorine per sfogare la cappa per almeno 1 ora poi sigillare la provetta. Lasciare la candeggina e la miscela HCl nel fumehood per almeno 24 ore prima dello smaltimento.
Nota: i semi sterilizzati possono essere conservati a temperatura ambiente per un utilizzo immediato. - Conservare i semi a 4 ° C per una conservazione a lungo termine. Portare i semi a temperatura ambiente prima di aprire la provetta per evitare la formazione di condensa. semi Conservare al buio.
- Preparare piastre di agar a 4-settore Petri Piatti (90 x 15 mm):
- Preparare 110 ml di terreno di coltura per A. thaliana piantine: 1x Murashige e Skoog (MS) terreno base 15 (4.33 g / L) contenente 1% (w / v) di saccarosio e 0,8% (w / v) di agar. Regolare il supporto MS a pH 6 con NaOH.
- Preparare 100 ml di terreno di coltura batterica di CEPA decomposizione: Schramm e Hestrin (SH) medium 16 contenente 1,5% (w / v) di agar. Regolare il medium SH a pH 7 con NaOH.
- Sterilizzare i media in autoclave e Temper a bagnomaria C 55 °.
- Una volta che l'agar MS ha temprato, aggiungere 40 ml in un pallone sterile. Per preparare il terreno di coltura controllo positivo per A. thaliana piantine, completano l'40 ml aliquota di MS agar con 40 ml di 10 mm secondo per ottenere una concentrazione finale di 10 micron ACC.
- Aggiungere 5 ml di terreno ai quadranti appropriate delle piastre Petri settorizzati (Figura 1) e consentire l'agar solidificare. Preparare tutte le lastre in triplice copia.
Nota: CEPA non viene aggiunto al mezzo di crescita fino al più tardi nel protocollo.
Figura 1:. Installazione di piastre di agar utilizzati per il test di risposta tripla con CEPA Uno schema illustra i quadranti specifici per il controllo negativo (A), controllo positivo (B), e piastre sperimentali (C). Questa cifra è stata modificata da Augimeri e cinturino 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Stratify A. thaliana semi di germinazione Assicurarsi sincrono:
- Aggiungere circa cinquanta A. semi thaliana viene eseguito su ciascun quadrante contenente MS o MS + ACC agar. Assicurarsi che i semi sono distribuiti in modo uniforme per facilitare la rimozione piantina e l'analisi.
- Incubare le piastre contenenti semi al buio a 4 ° C per 3-4 giorni.
- Scomporre CEPA su batterica di crescita a medio (SH) ed eseguire Triple test di risposta:
- Dopo stratificazione, esporre i semi di luce fluorescente per 2 ore.
- Distribuire 10 ml di soluzione stock di 500 mM CEPA sui quadranti delle piastre sperimentali contenenti SH agar (pH 7; Figura 1) per ottenere una concentrazione finale CEPAdi 1 mM.
- Sigillare i piatti con pellicola di laboratorio e coprire con un foglio per creare un ambiente scuro per i semi.
- Germinare semi incubando le piastre al buio a 23 ° C per 3 giorni con il lato agar giù.
Nota: Le piastre possono essere impilati, ma controlli negativi dovrebbero essere collocati sul fondo dal etilene è più leggero dell'aria.
- Analizzare Triple Risposta Assay dati:
- Con una pinza di fiamma sterilizzato, rimuovere singole piantine da una piastra corrispondente ad ogni trattamento e vista sotto un microscopio da dissezione o USB digitale. Assicurarsi che il fondo delle piantine sono allineati e fotografia.
- Rimuovere 30 piantine da ogni quadrante (60 piantine per replica biologica e 180 piantine per il trattamento). Allineare su una superficie con uno sfondo nero e la fotografia con un righello.
- Misurare la lunghezza hypocotyl (mm) di piantine ripetute utilizzando il software ImageJ 17. Impostare la scala facendo clic e trascinando il * diritta *strumento per selezionare una lunghezza di 10 mm. Selezionare "Set Scale" nella scheda "Analizza" e impostare la distanza nota a 10. Utilizzando lo strumento * * segmentato, fare clic e trascinare per selezionare la lunghezza della dell'ipocotilo e premere M per misurare la distanza. Confronta i mezzi di repliche biologiche con un one-way ANOVA con test di confronto multiplo di un Tukey. Le differenze sono ritenuti significativi se p <0.05.
3. Analisi del pH durante la crescita batterica
- Crescere e quantificare Komagataeibacter Culture xylinus Starter in triplice copia:
- Inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. Incubare culture a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore).
- Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml sterile 0,85% (w / v) NaCl soluzione, lavare le cellule due volte e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio.
- Quantificare cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser.
- Seminare Culture per l'analisi di pH:
- Aggiungere 150 ml di brodo SH (pH 7) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione a dodici 500 ml flaconi con coperchi foglio. Seminare palloni con K. colture starter xylinus ad una concentrazione di 10 5 cellule / ml. Utilizzando le tre colture starter, preparare tre repliche biologiche per il trattamento.
- culture integrare con 300 ml di soluzioni madre 5, 50, o 500 mm CEPA per ottenere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1 e 1,0 mm, rispettivamente. Supplemento colture di controllo non trattati con 300 ml di solvente usato per sciogliere CEPA.
- Sigillare beute mediante nastratura ermeticamente i coperchi foglio nei flaconi e incubare culture per 14 giorni a 30 ° C con agitazione a 150 rpm.
- Ogni giorno, Asepticarimuovere lly 5 ml campioni provenienti da ciascuno cellule pallone e pellet per centrifugazione (2.000 x g, 4 ° C; 10 min). Trasferire surnatanti in una provetta pulita e misurare il pH di ciascun replicato biologica usando un pH-metro.
- Analizzare i dati in tempo portate dalla graficamente il pH media delle repliche biologiche.
Nota: È importante che il pH coltura non scenda sotto 3,5; un pH cultura 5 riduce significativamente rilascio etilene da CEPA, e un pH inferiore a 3,5 inibisce completamente il rilascio di etilene. - Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente.
4. Colony Morfologia
- Grow K. Culture xylinus Starter in triplice copia:
- Inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. incubaculture te a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore).
- Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml di soluzione fisiologica sterile, lavare le cellule e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio.
- Preparare 24 piastre di agar contenenti 25 ml di SH (pH 7) medie con 1,5% (w / v) di agar.
- Una volta che l'agar è solidificato, diffusa 50 ml di 5, 50, e 500 soluzioni madre mM CEPA su agar per ottenere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1, e 1,0 mM, rispettivamente. Impostare placche di comando trattato e del solvente, che consistono di alcuna modifica e la diffusione di 50 ml di solvente usato per sciogliere i composti di prova.
- Piastre di scansione per gli colonie isolate con un ciclo-completo (~ 5 ml) di K. xylinus coltura starter e sigillarli con la pellicola di paraffina. Seminare tutte le lastre in triplice copia. Incubare le piastre per cinque giorni a 30 ° C.
- Photcolonie ograph a 20X di ingrandimento utilizzando un microscopio digitale USB e qualitativamente valutare la morfologia e la cellulosa di produzione coloniale su terreno solido.
Nota: Cellulosa appare come sostanza nebuloso lungo il margine della colonia. - Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente.
5. Pellicle Assays
- Crescere e quantificare K. Culture xylinus Starter in triplice copia:
- In triplice copia, inoculare una singola colonia di K. xylinus in 5 ml di terreno SH (pH 5) supplementato con 0,2% (v / v) cellulasi sterilizzata per filtrazione. Incubare culture a 30 ° C con agitazione a 150 rpm fino un OD 600 da 0,3 a E 0.4 viene raggiunto (circa 72 ore).
- Harvest colture starter mediante centrifugazione (2.000 XG; 4 ° C; 10 min). Con 5 ml di soluzione fisiologica sterile, lavare tlui le cellule due volte e risospendere il pellet cellulare. Mantenere le cellule in ghiaccio.
- Quantificare cellule utilizzando una camera di conteggio Petroff-Hausser.
- Preparare Master Mix per inoculare piastre da 24 pozzetti:
- Supplemento 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 ml di 5, 50, e 500 mM scorte CEPA avere concentrazioni finali CEPA di 0,01, 0,1, e 1,0 mM, rispettivamente. Supplemento altri 60 ml di terreno SH (pH 7) con 120 ml di solvente usato per sciogliere CEPA. Vortex per miscelare.
- Dividere ogni 60 ml di CEPA contenente mezzo in quattro 14 ml aliquote. Inoculare tre dei 14 ml aliquote con repliche biologiche di coltura starter alla concentrazione di 10 5 cellule / ml. Mantenere i tubi con le cellule in ghiaccio per evitare la produzione di cellulosa.
Nota: Il restante 14 ml un'aliquota sarà utilizzato per pozzetti di controllo sterili.
- Seminare piastre da 24 pozzetti:
- Testare ogni trattamento nel proprio piatto con tre file di repliche biologiche euna fila di controlli sterili (Figura 2).
Figura 2:. Flow-chart che illustra il protocollo utilizzato per il saggio pellicola e l'analisi della CEPA supplementato medio SH pH 7 (60 ml) è aliquotati per tre inoculazioni replicati biologica separati e un controllo sterile (14 ml ciascuna). Tali colture sono poi aliquotati in sei repliche tecniche (2 ml) in una piastra ben 24 e quindi sigillati con parafilm. Dopo incubazione per 7 giorni a 30 ° C, pellicole vengono raccolte e caratterizzati determinando peso umido, spessore, peso a secco, e cristallinità dal FT-IR. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura
- Utilizzando il master mix 14 ml, aggiungere 2 ml in each di sei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti sterili. Completare per le tre repliche biologiche e controllo sterile (Figura 2). Ripetere l'operazione per ogni trattamento.
- piastre di tenuta con la pellicola di paraffina e incubare staticamente per 7 giorni a 30 ° C.
- Raccolta e Misura Pellicle Wet peso, spessore, asciutto Peso (cellulosa Yield) e cristallinità (Figura 2):
- Premere un lato della pellicola di elevare il bordo pellicle avversaria e rimuovere singole pellicole con una pinza. Pur mantenendo la presa, metterli su un tovagliolo di carta fresca per 3 secondi per rimuovere eccesso di terreno prima della pesatura per determinare il loro peso umido.
- Allineare pellicole adiacenti ad un righello e fotografia dal lato utilizzando una fotocamera digitale ad alta risoluzione.
- Utilizzando il software ImageJ 17, misurare lo spessore pellicola sulla spalla sinistra, spalla destra e al centro di ogni pellicola. Medio Tutti i replicati tecnici per ogni Replicat biologicae.
- trasferire singolarmente le pellicole nei pozzetti di un 6-pozzetti. Trattare pellicole con 12 ml di 0,1 N NaOH a 80 ° C per 20 minuti per lisare le cellule.
- Rimuovere il NaOH e neutralizzare pellicole mediante lavaggio con acqua ultra pura per 24 ore con agitazione. Cambiare l'acqua ogni 6 ore.
Nota: pellicole dovrebbero essere bianco al termine della fase di lavaggio. - Inserire pellicole stuoie silicio e asciutto a 50 ° C per 48 ore fino a peso costante. Una volta asciutto, togliere dal stuoie e misurare pesi pellicle su una bilancia analitica per determinare il rendimento di cellulosa batterica.
- Analizzare pellicola cristallinità mediante trasformata di Fourier spettroscopia infrarossa (FT-IR) utilizzando 32 scansioni e una risoluzione di 4 cm -1 nell'intervallo 4000 a 650 cm -1. Calcolare l'indice di cristallinità, CI (IR), utilizzando un 1437 / A 895; il rapporto di assorbanza del "banda cristallina" e "banda amorfa" come descritto in precedenza 18.
- Per controllare i livelli di cloro e fosfato, un esperimento identico utilizzando 0,01, 0,1, e 1,0 mM di 4 soluzione di NaCl-NaH 2 PO usando i 5, 50, e 500 azioni mM, rispettivamente.
- Analizzare Pellicle dati:
- Calcolare pellicola idratazione determinando la differenza tra pellicola peso umido e il peso secco.
- La media dei valori di tutti i replicati tecniche per ottenere un singolo valore per ciascun replicato biologico per l'analisi statistica. Confronto trattamenti con un one-way ANOVA con test di confronto multiplo di Tukey. Le differenze sono significative se p <0.05.
- Normalizzare i dati come la percentuale dei controlli non trattati e riportare i mezzi di repliche biologiche.
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Representative Results
Una configurazione schematica piatto per la verifica dell'etilene liberazione dal CEPA in terreno SH (pH 7) con il test triplice risposta è illustrato in Figura 1A - C. Un diagramma di flusso illustrante il protocollo pellicola è mostrato in Figura 2. Dark-grown A. thaliana piantine mostrano il fenotipo triplice risposta (hypocotyl più breve e più spesso di un gancio apicale esagerata) in presenza di ACC e in presenza di etilene prodotto attraverso la decomposizione di CEPA su supporto SH (pH 7), ma non in condizioni non trattati (Figura 3A) 9. La lunghezza ipocotilo di ACC- e CEPA-derivati di etilene trattati A. semi thaliana erano significativamente (p <0,0001) inferiore a controlli non trattati (Figura 3B) 9, confermando che l'etilene è stato rilasciato dal CEPA a media SH (pH 7) ad una concentrazione fisiologicamente rilevantizione. Il pH non trattati e CEPA trattati K. culture xylinus rimasto superiore 5 (figura 4) 9; quindi CEPA decomposizione in etilene non è stata compromessa a causa della produzione di batteri acido organico. Etilene CEPA-derivato un aumento della produzione di cellulosa batterica quando K. xylinus è stato coltivato su terreno solido SH (pH 7) (Figura 5) 9. Tutte le concentrazioni di etilene CEPA-derivato è diminuito in modo significativo pellicola peso umido (figura 6A), non ha influenzato lo spessore pellicola (Figura 6B) e il peso secco significativo aumento pellicola (resa di cellulosa; Figura 6C) 9. Una foto rappresentativo prelevato per la misurazione dello spessore pellicola è mostrato in Figura 7. Pellicle idratazione è stata ridotta di tutte le concentrazioni di etilene CEPA-derivato (Figura 8A) 9, mentre tutte le concentrazioni di CEPA derivato etilene 9 aumentati pelcristallinità licle (Figura 8B). Gli effetti di NaCl e NaH 2 PO 4 erano insignificanti in tutti i casi (dati non mostrati) che conferma fenotipi osservati sono stati causati da etilene CEPA-derivato.
Figura 3: CEPA si decompone per mezzo di SH (pH 7) per la produzione di etilene fotografie microscopio digitale USB mostrano che oscura-grown A.. thaliana piantine mostrano il fenotipo risposta tripla (più breve hypocotyl, più spessa e hypocotyl esagerate gancio apicale) se coltivate in presenza di ACC ed etilene CEPA di derivazione rispetto al controllo non trattato (A). La lunghezza ipocotilo di piantine coltivate in presenza di ACC ed etilene CEPA-derivato erano significantly più breve rispetto al controllo non trattato (B). Barra di scala = 1 mm. Le barre di errore mostrano SD (n = 3). Bar con lettere diverse sono significativamente differenti (p <0,0001). Questa cifra è stata modificata da Augimeri e cinturino 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il pH K. xylinus culture rimane sufficientemente alta per CEPA decomposizione in mezzo SH (pH 7). Il pH cultura rimane superiore 5, permettendo efficiente decomposizione di CEPA in etilene tutto il ciclo di crescita batterica. Il pH di K. culture xylinus devono essere monitorati in quanto secernono e riassorbono acidi organici. La legenda mostra le concentrazioni testate CEPA. Si noti che l'asse y cominciaa pH 5. Le barre di errore mostrano SD (n = 3). Questa cifra è stata modificata da Augimeri e cinturino 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: etilene CEPA-derivati aumenta la produzione di cellulosa da K. xylinus su un terreno solido. K. xylinus è stato coltivato su piastre SH Agar (pH 7) che sono stati trattati (A), o pre-trattati con acidificato (pH 2,5) acqua ultra-pura (B), fosfato e cloruro (C - E) o CEPA (F - H ). Colonie rappresentative sono mostrate. La freccia indica la cellulosa prodotta da K. xylinus, visto come la sostanza nebuloso attorno alla colonia. Barra di scala = 0,5 mm. Questa cifra has stato modificato da Augimeri e cinturino 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: etilene CEPA-derivato diminuisce la capacità di trattenere l'acqua e aumenta il rendimento di K. xylinus pellicole di cellulosa. Le colture sono state coltivate in brodo staticamente SH (pH 7) integrato con CEPA in piastre da 24 pozzetti e incubate a 30 ° C per 7 giorni prima pellicole sono state raccolte e analizzate. Etilene CEPA-derivato diminuito pellicola peso umido (A), non ha avuto effetto dello spessore pellicola (B) e il peso secco aumento della pellicola (C). I diversi trattamenti CEPA non erano significativamente differenti tra loro. Le barre di errore mostrano SD (n = 3). bar conlettere diverse sono significativamente differenti (p <0.05). Questa cifra è stata modificata da Augimeri e cinturino 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7: fotografia Rappresentante di K. pellicole xylinus. Spessore Pellicle è stata misurata da fotografie utilizzando il software ImageJ. Barra di scala = 10 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8: etilene CEPA derivato ridotto l'idratazioneK. xylinus pellicole di cellulosa aumentando pellicola cristallinità. Le colture sono state coltivate in brodo staticamente SH (pH 7) in piastre da 24 pozzetti e incubate a 30 ° C per 7 giorni prima pellicole sono state raccolte e analizzate. Pellicle idratazione è stato calcolato come differenza tra pellicle bagnato e peso secco. CEPA derivato etilene ridotta pellicola idratazione (A) aumentando cristallinità pellicola (B). I diversi trattamenti CEPA non erano significativamente differenti tra loro. Le barre di errore mostrano SD (n = 3). Bar con lettere diverse sono significativamente differenti (p <0.05). Questa cifra è stata modificata da Augimeri e cinturino 9. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I metodi qui descritti illustrano la produzione in situ di etilene da CEPA per lo studio della risposta etilene batterica usando l'organismo modello, K. xylinus. Questo metodo è molto utile come etilene può essere prodotto da integrare qualsiasi mezzo acquoso che ha un pH superiore a 3,5 10,11 con CEPA eliminando la necessità di etilene puro o di laboratorio specializzato. Questo metodo non è limitato a studiare gli effetti di etilene CEPA derivato sui batteri, ma può essere anche essere adattato per studiare la risposta di etilene in organismi eucarioti. È importante che esperimenti di controllo parallelo essere eseguite con fosfato e cloruro di quanto questi composti sono prodotti anche da CEPA decomposizione in situ. Un altro controllo necessario è quello di accertare se CEPA si esercita un effetto diretto sulle colture microbiche in esame. Fisiologicamente concentrazioni di etilene irrilevanti sono state prodotte quando K. xylinus culture noiri cresciuto in un mezzo SH pH 5 e quindi servire come controllo per gli effetti CEPA 9; Tuttavia, questo approccio funziona solo per organismi tolleranti acidi.
L'uso di etilene CEPA-derivato per studi biologici in un mezzo di crescita acquosa richiede la verifica che l'etilene è infatti prodotta all'interno del sistema. Il metodo qui descritto utilizza la A. assay triplice risposta thaliana che sfrutta il fenotipo triplice risposta esibita da piantine scure coltivati in presenza di etilene 1. Petri diviso in quattro quadranti consentono le piantine di essere coltivate in mezzo MS separatamente, ma adiacente al mezzo di crescita microbica rilevante. Applicazione della soluzione CEPA sul mezzo di crescita microbica facilita la produzione di etilene ed espone le piantine adiacenti ad una fonte esogena di etilene come si infiltra spazio di testa. Integrando il supporto MS con ACC fornisce un controllo positivo in quanto rafforza il prodotto endogenaioni di etilene di A. thaliana e successiva induzione del fenotipo triplice risposta.
PH La cultura è un'altra considerazione importante nella produzione di etilene da CEPA in terreno di crescita microbica 13,14. Il mezzo SH tipicamente utilizzato per la cultura K. xylinus ha un pH di circa 5 che riduce sostanzialmente la produzione di etilene CEPA-derivato (Augimeri e cinghia, dati non pubblicati); Pertanto, il terreno è stato regolato a pH 7 9. Ciò è coerente con altri studi che hanno dimostrato che il tasso di guasto CEPA è estremamente lento pari o inferiore a pH 5, mentre è notevolmente migliorata a pH 7 13. È pertanto essenziale garantire che il terreno di coltura del microrganismo di prova rimane al di sopra del pH 5. K. culture xylinus raggiunto un pH minimo di circa 5,5, consentendo evoluzione dell'etilene 9. E 'importante notare che la concentrazione assoluta di etilene non può essere controllato in queste coltura cONDIZIONI.
L'effetto dell'etilene CEPA derivato sulla crescita, la produzione di cellulosa, e le proprietà pellicle di K. xylinus è stato utilizzato per illustrare che le risposte di etilene batterici potrebbero essere esaminati utilizzando CEPA. Adattare questi metodi per studiare la risposta di etilene in altri organismi è semplice come cambiare il mezzo di crescita e analisi fenotipo. L'uso di CEPA fornisce ai ricercatori con un comodo sostituto per il gas etilene e può incoraggiare più studi di etilene-mediata nei batteri.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 ml microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
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